閆巧娟 ， 劉 瑜， 江正強

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

·大家專版·

微生物α-半乳糖苷酶的研究進展

閆巧娟1， 劉 瑜2， 江正強2

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

α-半乳糖苷酶在多種生物內(nèi)廣泛存在，微生物是目前α-半乳糖苷酶的主要來源。微生物α-半乳糖苷酶可按照底物特異性或序列同源性分類，在古菌、細菌和真菌中均存在，其性質(zhì)與來源和家族有關(guān)，催化機理大多為構(gòu)型保留機制，目前主要應(yīng)用于食品與飼料工業(yè)，還可用于生物質(zhì)降解和醫(yī)藥領(lǐng)域。展望了微生物α-半乳糖苷酶的研究趨勢。本文對相關(guān)研究者具有一定的參考意義。

α-半乳糖苷酶；棉籽糖家族寡糖；工業(yè)應(yīng)用

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22，α-D-半乳糖苷半乳糖基水解酶)能夠從α-半乳寡糖、半乳甘露聚糖側(cè)鏈、半乳糖脂和糖蛋白的非還原端逐個水解半乳糖殘基[1]。該酶有著重要而廣泛的應(yīng)用，目前主要應(yīng)用于食品與飼料工業(yè)中。在食品工業(yè)中，可水解食物中棉籽糖家族寡糖(raffinose family oligosaccharide，RFO)，避免胃腸脹氣的發(fā)生[2-3]；在飼料工業(yè)中，可以將單胃動物不能利用的棉籽糖家族寡糖水解成半乳糖和蔗糖，提高飼料利用率，同時消除棉籽糖家族寡糖被腸道微生物分解引起的腹瀉和脹氣；此外還可以通過水解半乳甘露聚糖的側(cè)鏈促進β-甘露聚糖酶水解[4]，或者通過轉(zhuǎn)糖苷活性合成α-低聚半乳糖及其他重要的新型糖苷化合物[5]。α-半乳糖苷酶的來源非常廣泛，動物、植物和微生物中均有分布。自從1895年Bau[6]、Fischer等[7]從下面發(fā)酵啤酒酵母中分離了α-半乳糖苷酶以來，目前碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzyme，CAZy)數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org)中已確定的α-半乳糖苷酶已達134個。微生物α-半乳糖苷酶由于其產(chǎn)量較大、來源廣泛、性能優(yōu)良而得到較多的關(guān)注。因此，本文主要介紹微生物α-半乳糖苷酶的研究進展。

1 α-半乳糖苷酶的分類與來源

傳統(tǒng)上，根據(jù)底物特異性，α-半乳糖苷酶可以分為兩類：第一類僅水解人工合成的對硝基苯基底物和棉籽糖家族寡糖(包括棉籽糖、水蘇糖)等分子量較小的底物(圖1A)；第二類除水解上述底物，還能夠水解半乳甘露聚糖的半乳糖基側(cè)鏈(圖1B)。由于α-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)，CAZy數(shù)據(jù)庫根據(jù)序列同源性將目前已知α-半乳糖苷酶歸入GH 4、GH 27、GH 36、GH 57、GH 97和GH 110家族。GH 36和GH 27家族α-半乳糖苷酶占已知α-半乳糖苷酶的多數(shù)，分別大致對應(yīng)于上述第一類和第二類α-半乳糖苷酶。其他家族α-半乳糖苷酶相對較少。

圖1 α-半乳糖苷酶水解棉籽糖、水蘇糖和半乳甘露聚糖示意圖Fig.1 Schematic illustration of the hydrolysis effect of α-galactosidase towards raffinose, stachyose and galactomannanA：α-半乳糖苷酶水解棉籽糖和水蘇糖示意圖；B：α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖示意圖A: Schematic illustration of the hydrolysis effect of α-galactosidase towards raffinose and stachyose; B: Schematic illustration of the hydrolysis effect of α-galactosidase towards galactomannan

α-半乳糖苷酶可由植物、動物和微生物產(chǎn)生。在植物中，α-半乳糖苷酶常見于果實與種子中[8-9]。哺乳動物和人體內(nèi)的α-半乳糖苷酶參與糖鞘脂的降解，對脂代謝有重要作用[10]。α-半乳糖苷酶也常見于各種微生物，在古菌、細菌和真菌中均有存在[1]。目前CAZy數(shù)據(jù)庫中已報道的α-半乳糖苷酶主要來自于細菌和真菌，古菌來源的α-半乳糖苷酶僅有4例，其中PyrococcusfuriosusDSM 3638和ThermococcusalcaliphilusAEDII12RA的GH 57家族是目前GH 57家族僅有的兩個α-半乳糖苷酶，另外兩例屬于GH 36家族；細菌來源的α-半乳糖苷酶在GH 4、GH 27、GH 36、GH 97和GH 110家族中均存在，其中GH 4、GH 97和GH 110家族的α-半乳糖苷酶全部來自于細菌；真菌α-半乳糖苷酶雖然報道也較多，但已知僅存在于GH 27和GH 36家族，尚無其他糖苷水解酶家族真菌α-半乳糖苷酶的報道[11]。

2 微生物α-半乳糖苷酶的發(fā)掘與分子改造

2.1 天然α-半乳糖苷酶的研究

從自然界中篩選產(chǎn)α-半乳糖苷酶的菌株，進行酶的純化和性質(zhì)、應(yīng)用研究，是挖掘α-半乳糖苷酶的傳統(tǒng)方法。近年來乳桿菌α-半乳糖苷酶報道較多。如Roopashri等[2]報道了LactobacillusplantarumMTCC 5422的α-半乳糖苷酶，其最適pH值和溫度分別為5.8和45 ℃，在55 ℃保溫30 min后仍能保持穩(wěn)定。陳俊亮等[12]純化了長雙歧桿菌KLDS2.0509 α-半乳糖苷酶，酶的最適pH 值為5.0，最適溫度為42 ℃，在pH 5.0～6.0和42 ℃以下保持穩(wěn)定，能夠降解蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖，但不能水解瓜爾豆膠。杜新永等[13]研究了唾液乳桿菌XH4B α-半乳糖苷酶，確定酶的最適反應(yīng)條件為pH 5.5和55 ℃。傳統(tǒng)產(chǎn)α-半乳糖苷酶微生物篩選可以得到一些性質(zhì)較好的酶，但是產(chǎn)酶水平較低，難以滿足酶應(yīng)用的需要。此外，酶的編碼序列不清楚，因而難以進一步改造酶。

2.2 α-半乳糖苷酶的基因克隆、表達與性質(zhì)

表1 微生物α-半乳糖苷酶的基因克隆、表達和性質(zhì)

注：*預(yù)測分子量

從表1可以看出， 近來報道較多的是GH 27家族和GH 36家族的α-半乳糖苷酶。GH 27家族α-半乳糖苷酶分子量較低，多為45～60 kDa，個別GH 27家族α-半乳糖苷酶分子量較高，如StreptomycescoelicolorA3(2) 的α-半乳糖苷酶分子量為68 kDa[30]，TalaromycesleycettanusJCM12802的α-半乳糖苷酶分子量為72 kDa[35]。GH 36家族α-半乳糖苷酶分子量相對較高，多在80 kDa以上，但是一些嗜熱細菌具有較小分子量的GH 36家族α-半乳糖苷酶，如DictyoglomusthermophilumH-6-12 α-半乳糖苷酶Agal2的分子量為57 kDa[25]；ThermusthermophilusHB27 α-半乳糖苷酶分子量為55 kDa[31]。細菌來源的α-半乳糖苷酶報道較多，多為GH 36家族；真菌來源的報道相對較少，大致平均分布在GH 27家族和GH 36家族中。細菌α-半乳糖苷酶嗜熱性更好，如T.thermophilusHB27 α-半乳糖苷酶最適溫度可達90 ℃[31]；而真菌α-半乳糖苷酶最適溫度一般不超過70 ℃；細菌來源的α-半乳糖苷酶的最適pH值多為6.0～6.5，而真菌來源的更偏酸性，最適pH值通常為5.5以下。

2.3 微生物α-半乳糖苷酶的分子改造

天然微生物α-半乳糖苷酶的性質(zhì)往往不能夠滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。酶分子改造技術(shù)如定向進化和理性設(shè)計等能夠按照人們和工業(yè)的需求改造酶分子，成為酶工程領(lǐng)域的重要研究手段。但是，α-半乳糖苷酶分子改造的報道很少，取得的效果也很有限。如Chen等[17]通過易錯PCR結(jié)合DNA shuffling技術(shù)得到了Penicilliumjanczewskiizaleskα-半乳糖苷酶的突變體，最適pH值從5.2降到5.0，在pH 6.0～8.0的穩(wěn)定性得到大幅提高，最適溫度沒有變化，在40 ℃時的穩(wěn)定性有所提高。在酶的理性設(shè)計方面，尚無改造α-半乳糖苷酶的報道。因此，α-半乳糖苷酶的分子改造是目前亟待加強的研究領(lǐng)域之一。

3 微生物α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)與催化機制

酶的空間結(jié)構(gòu)取決于其氨基酸序列，同一家族的糖苷水解酶具有相似結(jié)構(gòu)，從而催化機制也基本相同[36]。目前不同糖苷水解酶家族α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)和催化機制見表2。

表2 微生物α-半乳糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)與催化機理情況

注：“-”表示目前未知

從表2中可以看出，目前僅有GH 27、GH 36和GH 97家族的α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)得到解析，其共同特點是催化結(jié)構(gòu)域均為 (β/α)8TIM桶結(jié)構(gòu)。除催化結(jié)構(gòu)域以外，α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)中往往還存在一些額外的結(jié)構(gòu)域，如GH 27家族C端存在反向平行果凍卷結(jié)構(gòu)域，GH 36家族C端β-片層結(jié)構(gòu)域以及GH 97家族的N端β-超三明治結(jié)構(gòu)域和C端β-片層結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域的功能目前仍不十分明確，尚待進一步研究[37-39]。一些家族的α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)還不清楚，如GH 4、GH 57和GH 110家族的α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)尚未報道。

α-半乳糖苷酶催化口袋的形狀同酶的底物選擇性密切相關(guān)。第一類α-半乳糖苷酶(一般為GH 36家族)的催化口袋通常深而窄，能夠容納無分支的蜜二糖和棉籽糖，但是卻不能同具有分支的半乳甘露聚糖結(jié)合；而第二類α-半乳糖苷酶(一般為GH 27家族)具有較淺的催化口袋，因而水解具有分支的半乳甘露聚糖能力較強[40]。對于GH 27家族α-半乳糖苷酶，較淺的催化口袋有利于α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖底物內(nèi)部分支，而催化口袋較深的酶只能水解半乳甘露聚糖末端的側(cè)鏈[37]。在催化機制方面，與其他的糖苷水解酶一樣，α-半乳糖苷酶的催化機制也可以分為構(gòu)型保留機制和構(gòu)型翻轉(zhuǎn)機制兩種，催化殘基一般為谷氨酸或天冬氨酸殘基[41]。絕大多數(shù)已知α-半乳糖苷酶采取構(gòu)型保留機制進行催化，僅GH 110 家族α-半乳糖苷酶采取構(gòu)型翻轉(zhuǎn)機制[42]。另外，GH 4家族酶的催化過程額外需要NAD+作為輔因子，中間過程中有氧化-還原反應(yīng)的發(fā)生[43]。

4 微生物α-半乳糖苷酶的應(yīng)用

4.1 α-半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

4.1.2 α-半乳糖苷酶用于合成α-低聚半乳糖 α-低聚半乳糖是一種益生元，能夠促進腸道雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，降低梭菌的數(shù)量[49]。α-低聚半乳糖可通過α-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)合成。Wang等[50]在乳酸乳球菌中表達了羅伊乳桿菌α-半乳糖苷酶，以蜜二糖為糖基供體，巖藻糖、乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖為糖基合成寡糖，轉(zhuǎn)糖苷效率分別為19.8%、35.0%和22.1%，新合成的糖苷鍵連接方式有α-1,3、α-1,4和α-1,6連接。Nakai等[51]以對硝基苯基-α-半乳糖苷為糖基，以多種單糖和二糖合成了一系列寡糖，其中5種寡糖為首次報道，得率為37%～74%。目前α-低聚半乳糖的合成常以對硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷或蜜二糖作為糖基供體，成本較高，生產(chǎn)和應(yīng)用受到很大限制，開發(fā)能以廉價底物進行合成的酶至關(guān)重要。

4.2 α-半乳糖苷酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用

豆粕作為大豆榨油后的副產(chǎn)品是動物飼料的重要組成部分，在家禽飼料中的添加比例高達48%，在家豬飼料中的添加比例達26%[45]。但是，作為單胃動物的家禽和家豬不能夠消化利用豆粕中的棉籽糖家族寡糖，降低豆粕的利用效率；此外，腸道微生物能夠代謝這些寡糖并產(chǎn)氣，從而導(dǎo)致動物胃腸脹氣和腹瀉，產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)性[45]。α-半乳糖苷酶能夠?qū)⒚拮烟羌易骞烟撬獬蓜游锟梢岳玫陌肴樘呛驼崽?，不僅能夠提高飼料利用率，還能夠解決動物胃腸脹氣的問題，消除棉籽糖家族寡糖的抗?fàn)I養(yǎng)性[3，52]。除棉籽糖家族寡糖外，飼料中半乳甘露聚糖也是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，可以增加胃腸內(nèi)容物的黏稠度，不利于動物對飼料的消化和吸收[52-53]。α-半乳糖苷酶能夠協(xié)同β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖，降低胃腸內(nèi)容物的黏稠度，提高飼料利用率[32，53-54]。用作飼料添加劑的α-半乳糖苷酶需要飼料造粒過程中高溫，因此具有良好耐熱性的α-半乳糖苷酶更適合在飼料領(lǐng)域應(yīng)用。此外，能夠耐受胃液造成的強酸性環(huán)境和消化道分泌以及外加蛋白酶降解的α-半乳糖苷酶能夠在動物胃腸道中發(fā)揮降解作用[55]。因此，耐熱、耐酸和抗蛋白酶的α-半乳糖苷酶成為近年來的研究熱點之一。Katrolia等[34]研究了Rhizomucormiehei來源的α-半乳糖苷酶RmGal36，顯示該酶在55 ℃保溫30 min后能維持80%以上的活性，并對胰蛋白酶、蛋白酶K和芽胞桿菌蛋白酶具有很強抗性。Bisporasp. MEY-1的α-半乳糖酶最適pH值和溫度分別為3.5和55 ℃，在pH 2.2～8.0保持穩(wěn)定，在模擬消化液中也表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性[54]。

4.3 α-半乳糖苷酶在生物質(zhì)降解和生物能源中的應(yīng)用

半乳甘露聚糖(常見的有瓜爾豆膠和槐豆膠等)是一種半纖維素，由β-1,4連接的甘露糖殘基組成的主鏈和α-1,6連接的半乳糖殘基側(cè)鏈組成，側(cè)鏈可以被一些α-半乳糖苷酶所降解，解除了位阻效應(yīng)，促進β-甘露聚糖酶的水解作用[4]。Malgas等[56]采用兩種α-半乳糖苷酶(GH 27和GH 36家族)和兩種β-甘露聚糖酶(GH 5和GH 26家族)研究了它們對瓜爾豆膠和槐豆膠的降解作用，結(jié)果表明GH 36家族α-半乳糖苷酶與兩種β-甘露聚糖酶均無協(xié)同降解作用，GH 27家族α-半乳糖苷酶能夠同GH 26家族β-半乳糖苷酶表現(xiàn)出較強的協(xié)同作用。Wang等[32]研究表明NeosartoryafischeriP1的兩個重組GH27家族α-半乳糖苷酶(rGal27A和rGal27B)能夠與相同來源的GH 5家族甘露聚糖酶(rMan5P1)表現(xiàn)出協(xié)同降解半乳甘露聚糖的作用，其中rGal27A和Man5P1組合協(xié)同系數(shù)可達11.76。目前一些生物質(zhì)降解酶制劑中已經(jīng)添加α-半乳糖苷酶，如諾維信的Novozyme 188，杰能科的Spezyme CP、Multifect(xylanase)、Multifect(pectinase)和GC220等[57]。

大豆糖蜜是大豆蛋白生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，含有大量的棉籽糖家族寡糖，可占大豆糖蜜中總糖的一半[58-60]。大豆糖蜜可用于乙醇和丁醇的生產(chǎn)，但是許多工業(yè)微生物(釀酒酵母、運動發(fā)酵單胞菌、丙酮丁醇梭菌等)水解棉籽糖家族寡糖能力缺乏或者不足，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)呛枯^高，造成浪費[59-61]。為了解決這一問題，da Silva等[62]以α-半乳糖苷酶水解后的大豆糖蜜發(fā)酵乙醇，產(chǎn)量可提高10.4%；Dong等[58]利用丙酮丁醇梭菌以酶解大豆糖蜜作為碳源進行丁醇發(fā)酵，在初始糖濃度為54 g/L時丁醇發(fā)酵水平可達8.7 g/L。

4.4 α-半乳糖苷酶在醫(yī)藥中的應(yīng)用

B型血紅細胞表面抗原末端含有α-1,3連接的半乳糖分支，而O型血紅細胞缺乏該結(jié)構(gòu)。GH 110家族的一些α-半乳糖苷酶對α-1,3連接的半乳糖支鏈具有嚴格的特異性，能夠使B型血轉(zhuǎn)化為受血人群更廣的O型血[42]。此外，非靈長類動物細胞表面存在以α-1,3鍵直鏈連接于細胞表面糖鏈末端的半乳糖殘基，能夠在人類體內(nèi)引起強烈的排斥反應(yīng)。Liu等[63]以兔和豬紅細胞為研究對象，證實Bacteroidesfragilis的GH 110家族α-半乳糖苷酶BfGal110B能夠特異性去除該半乳糖殘基。結(jié)果表明該酶具有在器官異種移植中的應(yīng)用潛力。

α-半乳糖苷酶還可用于糖類藥物的合成。連接于細胞表面的Globotriose (Galα1-4Galβ1-4Glc) 是志賀樣毒素受體，外加Globotriose能夠同志賀樣毒素結(jié)合從而消除毒素對人體的危害[64]。 Gong等[22]利用具有嚴格立體選擇性的BacteroidesfragilisNCTC9343的α-半乳糖苷酶以對硝基苯基-α-半乳糖苷和乳糖合成了Globotriose，產(chǎn)率可達32.4%。酶法合成糖類藥物具有反應(yīng)條件溫和、效率高和特異性強的特點，具有很大的應(yīng)用潛力。

5 展 望

微生物α-半乳糖苷酶在多個行業(yè)有著重要的應(yīng)用，但是酶的性能和生產(chǎn)成本是限制其廣泛應(yīng)用的主要因素，因此獲得性質(zhì)符合應(yīng)用需要的微生物α-半乳糖苷酶并高水平表達是目前α-半乳糖苷酶研究亟待解決的問題。目前，除了繼續(xù)加強產(chǎn)酶菌株的篩選和酶基因的挖掘外，還需對酶分子進行改造，使酶的性能符合應(yīng)用的需要。為了提高α-半乳糖苷酶的表達水平，需要對酶基因和宿主進行改造，消除在基因表達、蛋白修飾和分泌等各方面存在的障礙，大幅提高酶的表達水平。在α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)研究方面，亟需解析結(jié)構(gòu)未知家族的α-半乳糖苷酶，闡明其催化機制，為酶的分子改造和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在α-半乳糖苷酶應(yīng)用研究方面，開拓新的應(yīng)用領(lǐng)域，推動α-半乳糖苷酶更廣泛應(yīng)用，也是目前重要課題。隨著相關(guān)研究的繼續(xù)深入，更多性能優(yōu)良的微生物α-半乳糖苷酶將被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，從而創(chuàng)造更大的經(jīng)濟和社會效益。

Advances in Microbial α-Galactosidase

YAN Qiao-juan1， LIU Yu2， JIANG Zheng-qiang2

(1.CollegeofEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083；2.CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083)

α-Galactosidases are widely distributed in various organisms, and microorganisms are the major source of α-galactosidases. Microbial α-galactosidases can be classified base on the substrate specify and sequence homology, and exist in archaea, bacteria and fungi. They show different properties varied with the sources and families and most of them adopt configuration maintaining mechanism. Microbial α-galactosidases have mainly been applied in food and feed industry, and also in biomass degradation and medicine. At last the development trend of α-galactosidases was prospected. This article will provide useful information to the related researchers.

microorganism；α-galactosidase；raffinose family oligosaccharide; industrial application

國家杰出青年科學(xué)基金項目(31325021)

閆巧娟 女，教授。主要研究方向為生物質(zhì)資源利用。E-mail:yanqj@cau.edu.cn

2017-04-15

閆巧娟，博士，教授，教育部新世紀優(yōu)秀人才，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心崗位科學(xué)家。1997年碩士畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院后留校任教，2004年晉升副教授，2009年晉升教授。長期從事農(nóng)產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化方面的科學(xué)研究,主要在食品相關(guān)酶制劑及其水解產(chǎn)物、功能性低聚糖、天然功能成分和微生物產(chǎn)有機酸等方面開展工作。近十年來，在木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳糖苷酶和甘露聚糖酶等的產(chǎn)酶菌株篩選、基因克隆表達、酶的純化和性質(zhì)及水解特性方面開展深入研究，得到多個性能優(yōu)良的新型酶。主持完成國家863計劃、國家自然科學(xué)基金項目等20多項。發(fā)表學(xué)術(shù)論文150余篇，其中SCI收錄論文75篇并被他引800多次；授權(quán)國家發(fā)明專利30余項。獲國家科技進步二等獎2項和省部級獎勵3項。

Q814.4

A

1005-7021(2017)03-0001-09

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.001