盛亞 熊艷麗 許明芳 況勛杰 王東 楊雪琴

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Nm23-H1是第一個被分離鑒定出的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑制基因。大量的基礎(chǔ)研究表明，Nm23-H1能夠逆轉(zhuǎn)包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。因此理論上其表達(dá)的高低與肺癌患者的預(yù)后應(yīng)該成正相關(guān)。但越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，Nm23-H1在肺癌的高表達(dá)并不都提示好的預(yù)后[1]。甚至有研究[2]發(fā)現(xiàn)其在鱗癌的表達(dá)反而與預(yù)后負(fù)相關(guān)。張志敏等[3]通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)在30例手術(shù)切除肺癌標(biāo)本中，24例標(biāo)本Nm23-H1的表達(dá)都以胞漿表達(dá)為主，但有6例標(biāo)本存在Nm23-H1的胞核表達(dá)，而這6例患者均較早的出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同樣在Kim等[4]的研究中也發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗癌中，20%的患者存在Nm23-H1的胞核表達(dá)，而核高表達(dá)的Nm23-H1與較差的預(yù)后（OR=7.48）以及疾病的早期復(fù)發(fā)（OR=3.02）相關(guān)，這提示Nm23-H1除具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的抑癌基因特性外，可能還具有癌基因潛能，而這兩種特性可能與Nm23-H1在胞漿胞核不同的定位有關(guān)?，F(xiàn)有的基礎(chǔ)研究均以過表達(dá)或抑制胞漿Nm23-H1為研究手段，研究結(jié)果并不能真實反映或重復(fù)臨床中Nm23-H1以胞核定位為主細(xì)胞的實際生物學(xué)效應(yīng)。因此，本研究構(gòu)建了核內(nèi)定向表達(dá)載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后觀察細(xì)胞增殖變化，以期探討胞核Nm23-H1對肺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 人肺腺癌A549細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心保存并傳代培養(yǎng)；大腸桿菌E. coli DH5α、293FT細(xì)胞由本實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司，胎牛血清購自Life Technologies公司；pLentis-CMV-IRES2-PURO載體購自美國Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購自Takara公司；DNA連接酶購自Promega公司；兔抗人Nm23-H1抗體、兔抗人β-tublin購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人Lamin A/C購自Bioworld Technology公司；CCK-8（Cell counting kit-8）購自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京大學(xué)人類疾病基因研究中心。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%小牛血清、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3天傳代1次。0.25%胰酶常規(guī)消化，選擇生長良好的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 Nm23-H1（NME1）表達(dá)載體構(gòu)建、慢病毒包裝及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)Nm23-H1設(shè)計PCR引物以擴增Nm23-H1（NME1）CDS序列。上游引物：TTAGGATCCacc ATGaagcgacctgccgccacaaagaaggctggacaggctaagaagaagaaa ATGGCCAACTGTGAG；下游引物：GCACTCGAGTTA AGCATAATCTGGAACATCATATGGATATTCATAGATC CAGTTCT。其中上游引物帶有BamHI酶切位點以及核定位信號NLS序列，下游引物帶有XhoI酶切位點以及HA tag序列。反應(yīng)條件為：98oC、1 min，98oC、10 s，60oC、20 s，72oC、180 s，30個循環(huán)后，72oC延長3 min。PCR產(chǎn)物膠回收，獲得回收產(chǎn)物NME1，載體連接后，感受態(tài)轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，按OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作，用BamHI酶切驗證，正確的質(zhì)粒送測序，測序引物為：AACAACTCCGCCCCATTGAC。酶切鑒定及測序均驗證均正確。在293FT的培養(yǎng)板中加入氯喹至終濃度25 μM，加入滅菌水及以下質(zhì)粒（pMD2.G 1.5 μg+pSPAX2 4.5 μg+pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO 6 μg），總體積為263 μL，然后加入2 mol CaCl237 μL，混勻，最后再加入300 μL 2×HBS，邊滴加邊振蕩，迅速將混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃混勻。將培養(yǎng)基換為2 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)皿中的上清，500 g離心10 min，然后將上清用0.45 μm濾器過濾，置于-70oC保存。將培養(yǎng)的目的細(xì)胞消化計數(shù)后按 2×104/孔鋪于24孔板中，24 h后，分別加入對照病毒以及表達(dá)病毒，各250 μL，24 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基500 μL，待細(xì)胞生長至80%融合度左右，將細(xì)胞消化并傳入6孔板中，24 h后，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，換為含有合適濃度puromycin的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿后，消化收集細(xì)胞，穿入培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Nm23-H1的定位及表達(dá) 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的A549用細(xì)胞核/胞漿細(xì)胞組分提取試劑盒（Nuclear/Cytosol Fractionation Kit）分別提取胞漿蛋白及胞核蛋白。制作5%的濃縮膠和12.5%的分離膠，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后使用封閉液（含15%脫脂奶粉的TBs液）封閉1 h，Nm23-H1抗體按1:1,000比例稀釋（稀釋液為含0.05%Tween的TBS液），4oC孵育過夜。加標(biāo)記了辣根過氧化物酶（herseradish peroxidase, HRP）的生物素二抗，按1:2,000-1:4,000比例稀釋，室溫輕搖孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5 激光共聚焦檢測Nm23-H1的定位及表達(dá) 分組處理A549細(xì)胞后移除培養(yǎng)基，取出已經(jīng)貼壁的蓋玻片，以0.01 mol的PBS沖洗，5 min一次，重復(fù)沖洗3次；2%甲醛/PBS溶液在室溫條件下固定30 min，用PBS沖洗，沖洗步驟同前；加0.5% Triton X-100放置室溫15 min，用PBS沖洗，沖洗步驟同前；以30 mL/L的山羊血清工作液于37oC封閉30 min，吸掉封閉液；在載玻片上滴加 20 μL鼠抗人Nm23-H1單克隆抗體（稀釋度1:1,000）溶液，蓋玻片細(xì)胞貼壁面與抗體接觸，4oC孵育過夜；加入含有DAPI核染料于37oC孵育10 min。PBS沖洗同前，自然晾干切片，以緩沖甘油封片，以PBS替代一抗作為陰性對照；在Leica TCS SP激光共聚焦顯微鏡下觀察和掃描，以軟件ZEN 2012分析。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 A549細(xì)胞經(jīng)nNME1（Nm23-H1核過表達(dá)）或Control-nNME1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)12 h-24 h后，同A549細(xì)胞一起參照CCK-8試劑盒說明，取2,000個/孔接種至96孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后棄去上清液，每孔加入含10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h后轉(zhuǎn)移培養(yǎng)上清液至96孔平底比色板，根據(jù)調(diào)零孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光度（OD）值，繪制細(xì)胞增殖曲線。每組平行做5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞周期檢測管加入80%冷乙醇固定后4oC過夜，冷PBS沖洗去除固定液，離心棄上清，加入300 μL PBS，10 mg/mL的核糖核酸酶A（RNase A）溶液15 μL混勻，37oC孵育30 min，加1 mg/mL的PI染液混勻，暗室中放置30 min后轉(zhuǎn)入流式管進(jìn)行熒光檢測。采用ModFit LT軟件分析細(xì)胞周期各時相的特點。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每項實驗均獨立重復(fù)3次，結(jié)果以Mean±SD表示，各組間結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗分析并作圖。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核內(nèi)定向表達(dá)載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 重組載體質(zhì)粒酶切鑒定及測序結(jié)果：質(zhì)粒用BamHI酶切驗證，切出3,400 bp及2,200 bp的片段，所用Marker為Takara的1,000 bp DNA Ladder（圖1），正確的質(zhì)粒送測序，測序引物為CMV-F：AACAACTCCGCCCCATTGAC，測序均驗證正確。載體示意圖如下：pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO（圖2）。采用蛋白質(zhì)印跡及激光共聚焦檢測其Nm23-H1蛋白的定位及表達(dá)變化。蛋白質(zhì)印跡及激光共聚焦結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染組和空載體組Nm23-H1蛋白以胞漿表達(dá)為主，而轉(zhuǎn)染組（A549 nNME1）所標(biāo)記了的在胞漿胞核都有表達(dá)，但主要以胞核表達(dá)為主，表明我們成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染了載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，Nm23-H1蛋白在A549細(xì)胞核內(nèi)成功過表達(dá)（圖3）。

圖 1 重組質(zhì)粒pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Results enzyme digestion analysis of recombinant plasmid. pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO. M: 1,000 bp DNA Marker. Lane 1-2: pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO.

圖 2 pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO表達(dá)載體Fig 2 Recombinant plasmid pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO

2.2 Nm23-H1核內(nèi)定向表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，空載體組與空白對照組相比，二者增殖速度相當(dāng)，無明顯差異，Nm23-H1核過表達(dá)組增殖速度快于對照組和空載體組，與空載體組相比在72 h（t=6.223,6, P＜0.000,1）、96 h（t=11.501,8, P＜0.000,1）和120 h（t=10.818, P＜0.000,1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖 3 載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中Nm23-H1蛋白的定位及表達(dá)。A：Nm23-H1蛋白在A549細(xì)胞中以胞漿表達(dá)為主，轉(zhuǎn)染組帶有HA標(biāo)簽的Nm23-H1蛋白在胞漿和胞核均檢測到，但主要以胞核表達(dá)為主。β-tublin和Lamin A/C作為內(nèi)對照；B：Nm23-H1蛋白主要位于A549細(xì)胞的胞漿，轉(zhuǎn)染后其在細(xì)胞核表達(dá)明顯增多；1：A549；2：A549空載體組；3：A549 nNME1轉(zhuǎn)染組。Fig 3 Nm23-H1 positioning and expression after stably transfected A549 cells by pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO. A: Nm23-H1 was mainly localized in the cytoplasm of A549 cells, Nm23-H1 with HA tag was detected in cytoplasm and nucleus of A549 nNME1 transfected and mainly localized in nucleus. β-tublin and Lamin A/C served as an internal control; B: Nm23-H1 was mainly localized in the cytoplasm of A549 cells and its nuclear localization significantly increased after transfected; 1: A549; 2: A549 vector only transfected; 3: A549 nNME1 transfected.

2.3 Nm23-H1核內(nèi)定向表達(dá)對A549細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，空載體組A549細(xì)胞G0期/G1期所占比例為35.69%，高于A549 nNME1轉(zhuǎn)染組的28.28%，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.461, P=0.217）；而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G2期/M期百分比為58.7%，空載體組A549細(xì)胞百分比31.30%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.560, P=0.010）；空載體組A549細(xì)胞S期所占比例為29.53%，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞S期所占比例為11.21%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.427, P =0.011）。提示空載體組細(xì)胞主要分布在G0期/G1期，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞則主要分布于G2期/M期（表1）（圖5）。

表 1 Nm23-H1核內(nèi)定向表達(dá)對A549細(xì)胞周期的影響（mean±SD, n=3）Tab 1 Nm23-H1nuclear directional expression effect on A549 cell cycle (mean±SD, n=3)

3 討論

圖 4 CCK-8法檢測Nm23-H1核過表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。***P＜0.000,1，n=3。Fig 4 The nuclear Nm23-H1 promotes A549 cells proliferation in vitro was detected by cell counting kit-8 (CCK-8). ***P＜0.000,1, n=3.

圖 5 A549、A549空載體組和A549 nNME1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期檢測。A：A549、A549空載體組和A549 nNME1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)周期檢測結(jié)果，a：A549；b: A549空載體組；c：A549 nNME1轉(zhuǎn)染組；B：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在G2期/M期所占比例（58.7%）明顯高于空載體組（31.30%）和未轉(zhuǎn)染組（30.7%）。* P＜0.05。Fig 5 Changes in the level of cell cycle in A549, A549 vector only transfected and A549 nNME1 transfected group cells. A: The flow cytometry results showed the cell cycle of A549, A549 vector only transfected and A549 nNME1 transfected group cells; a: A549; b: A549 vector only transfected; c: A549 nNME1 transfected; B：The cell circle distribution of A549 nNME1 transfected (58.7%) was significantly higher than those of A549 vector only transfected (31.30%) and A549 cells (30.7%). *P＜0.05.

腫瘤細(xì)胞的擴散及轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟的復(fù)雜過程，涉及抑癌基因表達(dá)下降、缺失或功能失活和相關(guān)癌基因的過量表達(dá)或功能失常。Nm23-H1作為轉(zhuǎn)移抑制基因，對此過程的多個環(huán)節(jié)都具有調(diào)節(jié)功能。它能降低腫瘤細(xì)胞的運動力、侵襲力，同時促進(jìn)細(xì)胞分化[5]。理論上其表達(dá)越高，肺癌的的預(yù)后越好，但臨床實際情況并非如此。Wang[1]采用RT-PCR檢測了141例非小細(xì)胞肺癌組織Nm23-H1 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nm23-H1表達(dá)的高低與預(yù)后無關(guān)。而Gazzeri等[2]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鱗癌中Nm23-H1蛋白的高表達(dá)與腫瘤病程進(jìn)展具有相關(guān)性，即表達(dá)越高，預(yù)后越差。這說明Nm23-H1在肺癌中可能存在雙面效應(yīng)，即抑癌基因效應(yīng)與促癌基因效應(yīng)。在其他腫瘤中，Li等[6]報道在老年喉癌患者中，Nm23-H1與預(yù)后較差以及疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)（P=0.000,9）。同樣在宮頸癌[7]以及血液腫瘤[8]的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，Nm23-H1的表達(dá)越高，預(yù)后越差。這進(jìn)一步提示Nm23-H1存在雙面效應(yīng)的可能性。

Nm23-H1有可能存在雙面效應(yīng)，而這種雙面效應(yīng)可能與其胞漿胞核不同的定位有關(guān)。Subramanian等[9]報道EB病毒核抗原3C（EBNA3C）與Nm23-H1結(jié)合后，將促使Nm23-H1從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，同時研究還發(fā)現(xiàn)Nm23-H1轉(zhuǎn)位后，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的特性不僅被EBNA3C廢除，反而還增加了EBNA-3C的轉(zhuǎn)錄活性。Kaul等[10]發(fā)現(xiàn)在EBNA3C蛋白誘導(dǎo)下進(jìn)入胞核后，同樣也表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長效應(yīng)。因此本研究首次以連接核引導(dǎo)信號肽的Nm23-H1構(gòu)建在胞核定位為主的肺癌細(xì)胞系，即構(gòu)建并轉(zhuǎn)染了載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，使Nm23-H1蛋白在A549細(xì)胞核內(nèi)定向表達(dá)。此次核定位信號NLS序列aagcgacctgccgccacaaagaaggctggacaggctaagaagaa gaaa，翻譯的氨基酸為Lys、Arg、Pro、Ala、Ala、Thr、Lys、Ala、Gly、Gln、Ala、Lys、Lys、Lys、Lys，從而組成核定位信號肽。已知多數(shù)核蛋白是通過importin α/β異源二聚體運載系統(tǒng)被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，以此方式入核的蛋白都有羧基端核定位信號肽（nuclear localization signal sequence, NLS），importin α可識別NLS，并形成被運載蛋白-importin α-importin β的三聯(lián)復(fù)合物，將入核蛋白轉(zhuǎn)運至胞核內(nèi)。我們此次的入核蛋白也有同樣的核定位信號肽，但它是否是通過importin α堆運載系統(tǒng)入核，還尚無定論。細(xì)胞增殖實驗表明，Nm23-H1核過表達(dá)的A549細(xì)胞在72 h、96 h和120 h時增殖率均大于空載體組的細(xì)胞增殖率，且有統(tǒng)計學(xué)意義。因此研究結(jié)果表明Nm23-H1核過表達(dá)對人肺腺癌A549細(xì)胞不再是抑癌作用，相反以促癌效應(yīng)為主。這一結(jié)果與單純胞漿過表達(dá)Nm23-H1蛋白是不同的，也是本研究的意義所在，證明了入核后的Nm23-H1蛋白可能起到了其同源異構(gòu)體Nm23-H2的癌基因潛能作用[6]。

既往研究表明，在人肺腺癌A549細(xì)胞胞漿中過表達(dá)Nm23-H1蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，使G1期細(xì)胞增加而S期細(xì)胞減少，停滯于G0期，從而抑制體外培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞的增殖[11]。我們早期研究也發(fā)現(xiàn)，紫杉酵脂質(zhì)體對Nm23-H1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞周期的影響提示Nm23-H1低表達(dá)組在紫杉醇脂質(zhì)體作用于主要將細(xì)胞阻滯于G2期/M期，以增強紫杉醇脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用[12]。以上研究表明胞漿過表達(dá)Nm23-H1蛋白對于人肺腺癌A549細(xì)胞的周期影響是主要將細(xì)胞阻滯在G0期/G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而在紫杉酵脂質(zhì)體作用下的A549細(xì)胞則是因Nm23-H1的低表達(dá)被阻滯于G2期/M期而抑制細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)在胞核過表達(dá)Nm23-H1蛋白，空載體組細(xì)胞主要分布在G0期/G1期，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞則主要分布在G2期/M期。本研究中Nm23-H1核內(nèi)的定向表達(dá)組細(xì)胞則主要分布在G2期/M期，與主要分布在G0期/G1期空載體組相比，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。說明Nm23-H1可能主要通過影響細(xì)胞周期來產(chǎn)生促癌效應(yīng)。

目前已有研究提示Nm23-H1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性及潛在的促癌作用，但大部分來源于病毒癌蛋白的作用[9,13]，且至今尚缺乏直接證據(jù)。曾有研究者分析認(rèn)為，Nm23-H1之所以不再具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的特性及促生長作用，其原因可能是由于病毒致癌蛋白與Nm23-H1的結(jié)合封閉了Nm23-H1的激酶活性位點，影響其在胞漿胞核的分布。其詳細(xì)的作用機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建核內(nèi)定向表達(dá)載體pLentis-CMV-NME1-IRES2- PURO，發(fā)現(xiàn)了人肺腺癌核內(nèi)定向表達(dá)Nm23-H1使細(xì)胞主要分布在G2期/M期并促進(jìn)了A549細(xì)胞的體外增殖。但核內(nèi)定向表達(dá)Nm23-H1以直接或間接的方式激活下游與增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)肺癌增殖的作用途徑和作用機制尚待進(jìn)一步研究闡明。