梁曉輝 孫保存 韓繼媛 趙秀蘭 劉增輝

肺癌是目前世界上發(fā)病率和致死率第一位的惡性腫瘤，也是我國(guó)境內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2009年至2011年我國(guó)肺癌患病率是733.3（1/10萬(wàn)）。其中男性509.3（1/10萬(wàn)），居惡性腫瘤的第1位。女性224（1/10萬(wàn)），居惡性腫瘤第2位[1]。而有57%的患者在初診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致晚期肺癌患者死亡的主要原因是侵襲和轉(zhuǎn)移[2,3]，因此深入了解肺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲機(jī)制，研究新型靶向治療藥物，抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)于提高治療效果、延長(zhǎng)患者生存期尤其重要。新近研究發(fā)現(xiàn)孕酮及脂聯(lián)素受體家族成員3（progesterone and adiponectin receptor family member 3, PAQR3）隸屬于PAQR基因家族，是一種位于高爾基體上的七次跨膜蛋白。目前已有多項(xiàng)研究[4-7]證實(shí)PAQR3在多種惡性腫瘤中如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、腎癌膀胱癌和骨肉瘤組織中發(fā)揮顯著的抑癌作用。PAQR3可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抑制血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移來(lái)影響腫瘤的發(fā)展[8]。研讀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，有關(guān)PAQR3蛋白在肺癌組織，尤其是人的肺癌組織標(biāo)本中的抑癌作用研究仍為空白。本研究即采用免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)肺癌組織中PAQR3蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析，以進(jìn)一步明確PAQR3與肺癌的病理特征及其預(yù)后的相關(guān)性，為優(yōu)化肺癌的臨床診治方案提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科2008年1月-2010年12月經(jīng)手術(shù)切除、臨床資料完整的肺癌病例106例，所有病例截止術(shù)前均未接受化療或放療，且無(wú)其他惡性腫瘤疾病，無(wú)嚴(yán)重肝、腎功能損害。106例肺癌組織標(biāo)本均經(jīng)HE染色，病理診斷明確。其中男性60例，女性46例，年齡30歲-70歲，平均年齡（47.5±6.4）歲；按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）（2015）肺腫瘤組織學(xué)分類，其中鱗癌37例，腺癌45例，小細(xì)胞癌15例，大細(xì)胞癌9例；腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期，I期20例，II期32例，III期31例，IV期23例；按組織學(xué)分級(jí)（不含腺癌），高分化10例，中分化16例，低分化35例（包括未分化）。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例，未轉(zhuǎn)移40例。同時(shí)取各肺癌病例的癌旁正常組織作為對(duì)照。隨訪資料截止到2015年12月，8例患者失訪，隨訪率92.4%。1年、3年和5年生存率分別為81%、51%和42%。

1.2 免疫組織化學(xué)染色試劑與方法 常規(guī)使用中性福爾馬林固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，厚度4 μm。放入65oC烤箱2 h，之后進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，滴加抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)抗原，后使用封閉液室溫封閉1 h，加入濃度為1:50的PAQR3抗體稀釋液（美國(guó)Santa Cruz公司），在恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h（37oC）。使用PBS沖洗并加入二抗稀釋液（美國(guó)Santa Cruz公司），在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h（37oC）。之后使用PBS沖洗并加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，采用DAB顯色，蘇術(shù)精復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 所有染色標(biāo)本由兩位病理診斷醫(yī)生在雙盲的情況下進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果判定。判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按照陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度兩個(gè)分級(jí)做為判定標(biāo)準(zhǔn)。以細(xì)胞漿染色強(qiáng)度分別計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色/棕黑色顆粒為3分；以細(xì)胞陽(yáng)性范圍分別計(jì)分：＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；再將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞率作乘積分級(jí)：＞3分為（+），6分-9分為（++），9分-12分為（+++），凡（+）或（+）以上者均為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，生存情況分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAQR3蛋白在肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá) 本研究中所有肺癌的診斷均經(jīng)過(guò)術(shù)后HE染色結(jié)果證實(shí)，免疫組織化學(xué)染色（圖1）結(jié)果顯示PAQR3主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，呈褐色。PAQR3在正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為71%，呈現(xiàn)高表達(dá)，在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為35%，表達(dá)水平明顯較低。兩組表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.2 PAQR3的表達(dá)與肺癌臨床病理特征間的關(guān)系 肺癌患者PAQR3蛋白的陽(yáng)性率在TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型以及分化程度方面差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而年齡、性別、腫瘤大小的分布方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 PAQR3的表達(dá)與臨床預(yù)后之間的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示，PAQR3陰性患者的5年中位生存時(shí)間為28.5個(gè)月，陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間為45個(gè)月；PAQR3陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率明顯高于陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的一種最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居高不下。近年來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)惡性腫瘤尤其肺癌的發(fā)病、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究取得了不少的成果。但是肺癌的發(fā)病率和死亡率仍沒(méi)有明顯的降低。因此，探討和研發(fā)新的診療措施勢(shì)在必行。肺癌具有多種癌基因參與、多種抑癌基因發(fā)生變化、分階段變化的獨(dú)特的生物學(xué)行為特點(diǎn)，因此我們應(yīng)該更多的從分子生物學(xué)角度去探討發(fā)病機(jī)制和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而研發(fā)新的分子靶向治療藥物。

圖 1 肺癌和癌旁正常肺組織中PAQR3的表達(dá)（免疫組化染色，A、B：200×，C、D：100×）。A、C：肺癌組織中PAQR3的陰性表達(dá)；B、D：正常肺組織中PAQR3的陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）。Fig 1 The expression of PAQR3 in lung cancer and adjacent normal tissues (IHC,A,B: 200×; C,D: 100×). A,C: Negative expression of PAQR3 in lung cancer tissue; B,D: Positive expression of PAQR3 in adjacent normal tissues.

圖 2 PAQR3表達(dá)量與肺癌患者5年生存率之間的關(guān)系Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of the expression of PAQR3 in 106 patients with lung cancer

PAQR3基因隸屬于PAQR家族，位于染色體4q21.21上，在大多數(shù)物種里編碼同一種蛋白，具有高度保守性。PAQR3蛋白定位于高爾基體上，是一種具有III型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的七次跨膜蛋白，其N端朝向細(xì)胞質(zhì)一側(cè)、C段朝向高爾基體腔內(nèi)，負(fù)責(zé)傳遞和調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)的作用。由于其最初被發(fā)現(xiàn)可以將細(xì)胞內(nèi)游離的Raf激酶錨定在高爾基體上，使其不能被上游分子激活并且失去活化下游分子MEK的能力，因此又被稱為RKTG（Raf kinase trapping to Golgi）。在機(jī)體內(nèi)的肝臟、腎臟、腦、乳腺和睪丸組織中均存在高表達(dá)[9,10]。已有研究[4-8]證實(shí)PAQR3在結(jié)直腸癌中發(fā)揮了抑癌作用，除此之外也被證明在多種腫瘤組織如乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、腎癌膀胱癌和骨肉瘤組織中表達(dá)降低。眾所周知RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路在腫瘤組織中持續(xù)激活，負(fù)向調(diào)控此條信號(hào)通路可對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲產(chǎn)生明顯的抑制作用，同時(shí)也會(huì)加速腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。PI3K/AKT信號(hào)通路同樣在腫瘤組織中持續(xù)激活，抑制PI3K/AKT通路的活性可以顯著抑制腫瘤的增殖和促進(jìn)凋亡[7]。那么PAQR3抑癌的最重要的機(jī)制是其能夠負(fù)性調(diào)控RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路的活化[12]。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PAQR3可通過(guò)上調(diào)P27KIPI蛋白表達(dá)，降低Cyclin D1蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的周期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期的比例減少，處于G0期/G1期的比例增加。使用SiRNA干擾下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的PAQR3表達(dá)后，P27KIPI蛋白表達(dá)明顯減少，Cyclin D1蛋白則顯著增加。而研究證實(shí)過(guò)表達(dá)PAQR3還可以明顯降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP9）的表達(dá)，而MMP9可以特異性的降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中，這可能也是PAQR3抑制肺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的機(jī)制之一[14]。PAQR3參與了腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為中起到了重要的作用。因此，我們推測(cè)PAQR3可能在肺癌患者的腫瘤組織中也同樣存在異常表達(dá)并對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生重要影響。因此深入分析PAQR3在肺癌組織中的表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)臨床診療及研發(fā)新的分子治療靶點(diǎn)都具有重要意義。

表 1 肺癌組織和癌旁正常組織中PAQR3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果分析Tab 1 The expression of PAQR3 in the lung cancer and normal tissue

表 2 PAQR3的表達(dá)與肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 2 Expression of PAQR3 in lung cancer and its relationship with several clinical pathological parameters

本研究結(jié)果證實(shí)PAQR3在正常肺組織中的表達(dá)顯著高于肺癌組織，提示PAQR3的正常表達(dá)在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)生了重大改變。PAQR3的表達(dá)率與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小沒(méi)有相關(guān)性，但是與肺癌患者的病理分型以及分化程度具有顯著的相關(guān)性，惡性度越高，分化程度越低，PAQR3的陽(yáng)性表達(dá)率越低，提示PAQR3的表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為有密切的關(guān)系，同時(shí)其在肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的臨床分期以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，中晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，這強(qiáng)有力的證實(shí)PAQR3參與抑制了肺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)，PAQR3的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的預(yù)后存在著顯著相關(guān)性，PAQR3陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率明顯高于陰性表達(dá)者，推測(cè)肺癌組織中PAQR3的表達(dá)可以作為評(píng)估預(yù)后的重要參考指標(biāo)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，己經(jīng)證實(shí)過(guò)表達(dá)PAQR3可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成、體外增殖及體內(nèi)成瘤能力[15]。因此，結(jié)合以往研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)PAQR3在抑制肺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮重要的作用。

總之，PAQR3在肺癌組織中的表達(dá)受到明顯抑制，與腫瘤的生物學(xué)行為、臨床分期及患者預(yù)后存間在顯著相關(guān)性，在術(shù)后檢測(cè)肺癌腫瘤組織標(biāo)本中的PAQR3對(duì)于評(píng)估患者預(yù)后具有重要意義，另外，開(kāi)發(fā)靶向作用于PAQR3的藥物也可能會(huì)給肺癌的治療帶來(lái)新的思路和方法。