高珂 賴玉田 黃健 王一帆 王曉瑋 車國衛(wèi)

肺癌是全球男性和發(fā)達(dá)國家女性因癌癥死亡率最高的疾病種類[1,2]。外科手術(shù)仍是目前治療肺癌的主要手段，肺癌手術(shù)后肺部并發(fā)癥（postoperative pulmonary complication, PPC）是影響患者手術(shù)后早期恢復(fù)的主要原因，其中手術(shù)后肺炎（postoperative pneumonia, POP）是肺癌患者圍手術(shù)期主要致死原因[3]。致病性氣道定植菌被認(rèn)為是PPC的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]，而肺表面活性蛋白D（surfactant protein D, SP-D）與肺內(nèi)的天然免疫有關(guān)，肺內(nèi)的局部免疫狀態(tài)對致病性細(xì)菌定植有重要影響。為探討肺癌患者術(shù)前致病性氣道定植菌分布、血清SP-D濃度與肺葉切除術(shù)后肺炎發(fā)生的關(guān)系，我們研究了成都市6家三甲醫(yī)院連續(xù)收治的125例可手術(shù)的肺癌患者，分析肺癌患者手術(shù)前氣道致病性定植菌的危險(xiǎn)因素，血清SP-D水平變化與術(shù)后肺炎發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年5月-2015年1月的連續(xù)收治的四川省腫瘤醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院、成都市第二人民醫(yī)院、成都市第三人民醫(yī)院、成都大學(xué)附屬醫(yī)院、成都醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院等6家三級甲等醫(yī)院胸外科收治的擬手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者192例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于18歲且小于80歲；②符合四川大學(xué)華西醫(yī)院生物倫理委員會批準(zhǔn)的受試者要求，同意術(shù)前根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行檢查，并簽署知情同意書；③全胸腔鏡/開胸肺葉切除術(shù)+系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃患者；④術(shù)后病理診斷原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非非小細(xì)胞肺癌患者；②術(shù)中發(fā)現(xiàn)需要行全肺切除、聯(lián)合肺葉切除和需要行肺動脈和支氣道袖式成形肺葉切除術(shù)及亞肺葉切除；③術(shù)中出血量超過1,000 mL和胸腔鏡手術(shù)中轉(zhuǎn)開胸，或者術(shù)后需要再次手術(shù)止血；④外院或門診已行纖維支氣管鏡檢測但未行分泌物細(xì)菌學(xué)檢測；⑤實(shí)驗(yàn)期間拒絕繼續(xù)按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行細(xì)菌學(xué)及血清學(xué)檢測；⑥根據(jù)臨床癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢測和影像學(xué)資料診斷術(shù)前即合并肺部感染；⑦在標(biāo)本檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)本不合格的（標(biāo)本污染，標(biāo)本量少不足以完成所有指標(biāo)檢測）。具體患者篩查流程見圖1。根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)共排除18例患者，其中術(shù)后病理證實(shí)非非小細(xì)胞肺癌4例，手術(shù)因素（術(shù)中大出血或亞肺葉切除）3例，實(shí)驗(yàn)期間拒絕繼續(xù)按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行細(xì)菌學(xué)及血清學(xué)檢測5例，標(biāo)本不合格6例，最終進(jìn)入實(shí)驗(yàn)患者125例，其中男性95例，女性30例，年齡43歲-76歲，平均（63.48±8.69）歲；其中鱗癌60例，腺癌63例，其他病理類型2例；其中I期67例，II期48例，III期10例。

1.2 基礎(chǔ)肺功能（pulmonary function test, PFT）檢測指標(biāo)對肺通氣功能（肺容積、肺通氣量、小氣道功能、呼吸動力學(xué)、吸入氣體分布、呼吸肌功能 ）和肺換氣功能（彌散功能、通氣血流比值）進(jìn)行測定和評估。

1.3 肺部并發(fā)癥分類及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

圖 1 病例篩選流程圖Fig 1 Flow chart of case screening

1.3.1 PPC的種類 包括：肺部感染、肺栓塞、乳糜胸、皮下氣腫、咯血、聲音嘶啞、支氣道胸膜瘺、手術(shù)后持續(xù)肺漏氣、手術(shù)后胸腔積液（中到大量）和積氣（肺壓縮≥30%）、肺不張、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）或呼吸衰竭。肺部并發(fā)癥分類及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表 1 肺部并發(fā)癥診斷標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 The criterion of postoperative pulmonary complications (PPC)

1.3.2 術(shù)后肺炎的標(biāo)準(zhǔn)：含有以下指標(biāo)3個(gè)或以上的應(yīng)視為術(shù)后肺炎[5,6]：①手術(shù)后72 h的發(fā)熱，T＞38oC；或72 h以內(nèi)的體溫再度升高。②白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高（＞12×109/L-15×109/L），或白細(xì)胞計(jì)數(shù)回復(fù)正常值以后的再度升高，超過10×109/L。③胸部影像學(xué)提示肺組織實(shí)變或不斷增加的斑片狀陰影。④咳出膿性痰液，或痰培養(yǎng)陽性。其中如果包含④，僅需要其他一項(xiàng)即可視為POP?；蚪?jīng)呼吸科會診確定為肺部感染，并需要更換抗生素或延長抗生素使用時(shí)間。

1.4 氣道的細(xì)菌學(xué)檢查 患者在入院時(shí)，經(jīng)纖維支氣管鏡用防污染樣本毛刷或支氣管肺泡灌洗液（灌洗液經(jīng)過單層紗布過濾，再經(jīng)過800 rpm離心10 min后，沉淀物用于微生物學(xué)檢查）取細(xì)菌學(xué)標(biāo)本，合格標(biāo)本按標(biāo)準(zhǔn)流程預(yù)處理后，分別接種于血平板、中國藍(lán)和巧克力平板中，在5%CO2、37oC箱體內(nèi)孵化18 h后行菌落計(jì)數(shù)和分離鑒定。出現(xiàn)優(yōu)勢菌后，菌落計(jì)數(shù)。以防污染樣本毛刷≥103cfu/mL、支氣管肺泡灌洗液≥104cfu/mL確定為細(xì)菌定植標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.5 手術(shù)方法 全胸腔鏡肺葉切除患者手術(shù)方法為單向式胸腔鏡肺葉切除法+系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃[8]。開胸患者應(yīng)用常規(guī)后外側(cè)切口，肺葉切除術(shù)+系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃。系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃左側(cè)必須清掃第5、6、7、8、9、10組淋巴結(jié)，右側(cè)包括第2、3、4、7、8、9、10組淋巴結(jié)。

1.6 術(shù)后處理方法 術(shù)后疼痛處理均應(yīng)用鎮(zhèn)痛泵（鹽酸曲馬多注射液，1 mg/h-1.5 mg/h），均早期促使患者下床活動。必要時(shí)應(yīng)用非甾體類止痛藥（氨酚羥考酮片或布洛芬緩釋膠囊）。鎮(zhèn)痛泵于胸腔引流管拔除的同時(shí)也一起停止。兩組患者均根據(jù)胸腔引流氣體和液體量決定行胸部X線片檢查時(shí)間，并根據(jù)胸部X線片結(jié)果決定是否拔除胸腔引流管。

1.7 血漿中SP-D濃度的測定 在患者入院當(dāng)天，采集患者外周血5 mL，待血液自然凝固10 min-20 min，離心20 min，2, 000 rpm，仔細(xì)收集上清液。應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人SP-D水平。人SP-D ELISA試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

表 2 呼吸道氣道定植菌陽性與陰性兩組患者一般臨床資料的比較Tab 2 The clinical demographic characters of study subjects

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，樣本在作t檢驗(yàn)和方差分析前，均先作正態(tài)分析或方差齊性檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素應(yīng)用Logistic回歸，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床病理生理學(xué)特征 肺癌患者術(shù)前合并致病性氣道定植菌19例（15.2%, 19/125），平均年齡（65.29±8.31）（46歲-76歲），78.95%（15/19）患者吸煙指數(shù)≥400支/年，68.42%（13/19）為中央型肺癌，PPC的發(fā)生率為42.11%（8/19），術(shù)后肺炎發(fā)生率為26.32%（5/19）。

106例（84.8%, 106/125）不合并致病性氣道定植菌，平均年齡（62.43±7.90）（43-75）歲。吸煙指數(shù)≥400支/年的患者53.77%（57/106）。43.40%（46/106）患者為中央型肺癌，術(shù)后肺部并發(fā)癥發(fā)生率16.04%（17/106），術(shù)后肺炎發(fā)生率6.60%（7/106）（表2）。

2.2 兩組患者術(shù)后肺部并發(fā)癥種類分布的比較 術(shù)后PPC的發(fā)生率在肺癌合并致病性氣道定植菌組（42.11%）顯著高于非合并組（16.04%）（P=0.021）；其中肺部感染在合并致病性氣道定植菌組（26.32%）顯著高于非合并組（6.60%）（P=0.019）（表3）。

表 3 兩組患者術(shù)后肺部并發(fā)癥種類分布的比較Tab 3 The detail of PPC in colonization -/+ groups

2.3 致病性氣道定植菌陽性患者氣道定植菌株的分布情況 19例患者中檢得氣道定植菌22株，其中革蘭氏陰性菌19株，占86.36%，革蘭氏陽性菌3株，占13.64%。有3例患者檢出2種菌株。其中，肺炎克雷伯菌7株（31.83%, 7/22）、銅綠假單胞菌3株（13.64%, 3/22）、流感嗜血桿菌5株（22.73%,5/22）、大腸埃希氏菌2株（9.09%, 2/22）、陰溝腸桿菌1株（4.54%, 1/22）、表皮葡萄球菌2株（9.09%, 2/22）、金黃色葡萄球菌1株（4.54%, 1/22）、鮑曼不動桿菌1株（4.54%,1/22）。

2.4 兩組患者血清SP-D水平的比較 血清SP-D濃度在且在肺癌合并致病性氣道定植菌組（31.25±6.09）顯著高于非合并組（28.17±5.23）（P=0.023）（圖2）。血清SP-D水平與致病性氣道定植菌發(fā)生呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.204（P=0.011）。檢出的菌株數(shù)量不同患者間血清SP-D水平中位數(shù)不同，檢出單株致病性定植菌患者血清SP-D水平中位數(shù)較檢出2株致病性定植菌患者血清SP-D水平明顯降低（24.68 vs 33.62）（圖3）。

表 4 呼吸道致病性氣道定植菌的危險(xiǎn)因素的Logistic回歸Tab 4 The Logistic analysis of the risks of aieway colonizations

2.5 肺癌合并致病性氣道定植菌的高危因素 Logistic回歸分析結(jié)果顯示：年齡（＞75歲）和吸煙史（吸煙指數(shù)≥400支/年）是肺癌患者術(shù)前合并致病性定值菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因數(shù)（表4）。

2.6 并發(fā)手術(shù)后肺炎患者臨床病理生理學(xué)特征 并發(fā)手術(shù)后肺炎患者中氣道致病性定值菌的發(fā)生率是41.67%（5/12），其發(fā)生率是無手術(shù)后肺炎患者的3.4倍（12.39%;OR=3.363, 95%CI: 1.467-7.711）。并發(fā)手術(shù)后肺炎的患者在年齡[(64.46±7.31) vs (61.78±8.21), P=0.021]、吸煙指數(shù)≥400支年（83.33% vs 52.43%, P=0.019）和COPD分級（P=0.007）上的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

圖 2 氣道定植菌陽/陰性患者血清S P+-D水平的l比較。血清SnP --D濃度在肺癌合并致病性氣道定植菌組顯著高于非合并組[(31.25±6.09) vs (28.17±5.23), P=0.023]。Fig 2 The comparison of serum SP-D level between positive and negative colonization patients The serum SP-D level of patients in the colonization positive group was higher than that in the colonization negative group [(31.25±6.09) vs (28.17±5.23),P=0.023].

圖 3 不同氣道定植S菌in菌g株le數(shù) i量so患la者t血e 清SPM-Du水lt平ip中l(wèi)e位 i數(shù)so的l比at較es。檢出單株致病性定植菌患者血清SP-D水平中位數(shù)較檢出2株致病性定植菌患者血清SP-D水平明顯降低（24.68 vs 33.62）。Fig 3 The median of serum SP-D level in different number of isolates.The serum SP-D level in single isolate group was lower than that in multiple isolates group (24.68 vs 33.62).

3 討論

外科手術(shù)仍是目前治療肺癌的主要手段，肺葉切除及系統(tǒng)縱隔淋巴結(jié)清掃是治療肺癌的主要手術(shù)方式。肺癌手術(shù)后肺部并發(fā)癥是影響患者手術(shù)后早期恢復(fù)的主要原因[3]。根據(jù)已有的報(bào)道，PPC的發(fā)生率在2%-40%之間[9-11]，常見的肺部并發(fā)癥包括：術(shù)后肺炎、肺不張、急性呼吸衰竭、肺水腫、支氣道痙攣以及氣胸和持續(xù)肺漏氣等，術(shù)后肺炎是導(dǎo)致患者圍術(shù)期死亡的主要原因。

近年來，肺癌患者氣道致病性細(xì)菌定植及其與PPC的關(guān)系受到關(guān)注[12,13]。致病性細(xì)菌定植是指在正常無菌的呼吸道出現(xiàn)了細(xì)菌，并可以持續(xù)存在且不斷生長繁殖，但不引起顯著的細(xì)菌感染的臨床癥狀[14]。細(xì)菌定植與感染的區(qū)別在于：細(xì)菌定植是指細(xì)菌在消化道、呼吸道、泌尿生殖道等部位粘膜表面持續(xù)存在而未出現(xiàn)宿主反應(yīng)和不利作用，定植可以是細(xì)菌和宿主之間長期持續(xù)的共生關(guān)系，也可以進(jìn)一步發(fā)展為感染。細(xì)菌細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌在局部組織或侵入血循環(huán)中生長繁殖產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起急性全身或局部感染，臨床上出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。因此，定植尚不是感染，卻是感染的重要來源和最危險(xiǎn)的因素。研究[4]顯示氣道致病性細(xì)菌定植是PPC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肺癌患者術(shù)前氣道致病性細(xì)菌定植主要源于：①目前的肺癌病例中，有40%-70%伴發(fā)不同程度的COPD[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，25%-40%的穩(wěn)定期COPD患者取支氣道分泌物進(jìn)行定量培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)有氣道定植菌存在。②感染因素在肺癌發(fā)病機(jī)制中有重要的作用，惡性腫瘤同時(shí)伴發(fā)的免疫抑制和營養(yǎng)狀態(tài)異常，也為致病性細(xì)菌定植提供了條件[17]。我們的研究結(jié)果顯示，大約15%的術(shù)前非小細(xì)胞肺癌患者存在氣道致病性細(xì)菌定植。檢出的氣道定植菌菌株以革蘭氏陰性菌為主，其中3例患者檢出2種菌株。

通過比較氣道定植菌陽性患者與陰性患者的臨床資料，我們發(fā)現(xiàn)： 致病性細(xì)菌定植陽性與患者年齡、吸煙史及腫瘤的位置（中央型/周圍型）等因素有關(guān)，老年免疫力降低，煙霧對于氣道功能和微環(huán)境的破壞，中央型肺癌導(dǎo)致的氣道完全或不完全阻塞是可能的原因。需要指出的是，我們的研究結(jié)果提示是否存在呼吸道致病性細(xì)菌定植與肺癌患者合并COPD的嚴(yán)重程度無關(guān)。雖然，大量COPD患者的致病性細(xì)菌定植的研究表明，細(xì)菌定植的發(fā)生與COPD各項(xiàng)指標(biāo)有密切相關(guān)[18]，但目前關(guān)于肺癌患者致病性細(xì)菌定植的研究很少，已有的文獻(xiàn)均未發(fā)現(xiàn)[4]或沒有研究致病性氣道定植菌和肺癌手術(shù)患者合并COPD相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系[12,19]。我們的研究之所以得出以上的結(jié)果，其原因可能是：①對于可以接受手術(shù)的肺癌患者而言，即使術(shù)前合并不同程度的COPD，其肺功能往往也局限在相對較窄的可以耐受手術(shù)的范圍內(nèi)，肺功能較差的患者在術(shù)前篩查時(shí)就已經(jīng)被排除；②肺癌的發(fā)生本身與致病性細(xì)菌定植有交互關(guān)系[17]，從而削弱了COPD嚴(yán)重程度在肺癌患者致病性細(xì)菌定植發(fā)生機(jī)制上的作用的權(quán)重。在進(jìn)一步的Logistic回歸分析中我們發(fā)現(xiàn)術(shù)前發(fā)生致病性氣道定植菌的危險(xiǎn)因素是高齡和長期吸煙史。同時(shí)，我們的結(jié)果顯示：在氣道定植菌陽性患者中手術(shù)后肺炎的發(fā)病率較陰性患者明顯增高，合并手術(shù)后肺炎的患者中氣道致病性定植菌檢出率較不發(fā)生術(shù)后肺炎的患者明顯增加，提示肺癌患者術(shù)前致病性氣道定值菌與手術(shù)后肺炎的發(fā)生密切相關(guān)。

表 5 并發(fā)手術(shù)后肺炎患者臨床病理生理學(xué)特征Tab 5 The clinical demographic characters of patients with POP

肺表面活性蛋白（surfactant protein, SP）是肺組織局部分泌的重要活性物質(zhì)，除可以調(diào)節(jié)表面張力、具有調(diào)節(jié)蛋白酶-蛋白酶抑制劑之間的平衡狀態(tài)的功能外，同時(shí)還是重要的肺天然免疫分子，可以抵抗病原體侵襲、炎癥及氧化應(yīng)激。已發(fā)現(xiàn)的SP有4種，按發(fā)現(xiàn)先后命名為SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。SP-D是水溶性蛋白，除參與肺泡張力的維持外，還與機(jī)體和肺的免疫功能和炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)。其結(jié)構(gòu)上具有重復(fù)表達(dá)GIy-X-Y的膠原樣區(qū)，可與不同細(xì)胞表面多種受體結(jié)合，參與免疫反應(yīng)。

SP-D是評價(jià)COPD嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要的生物標(biāo)志物[20]，在COPD的發(fā)病和疾病的進(jìn)展中起到重要作用[21]，參與了肺的免疫調(diào)節(jié)及病原體的吞噬及凋亡機(jī)制[22]。SP-D由肺泡分泌，肺血?dú)馄琳系牟∽儯闻菁?xì)胞間隔增寬，通透性增大，是SP-D入血的主要原因，血清SP-D水平可以反映終末肺組織的器質(zhì)性變化[23]。從理論上設(shè)想，局部（支氣管肺泡灌洗液中）和血清SP-D的水平高低可以反映術(shù)前肺部的免疫狀態(tài)，并與致病性細(xì)菌定植狀態(tài)相關(guān)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性定植菌陽性組患者血清SP-D水平較陰性患者增高，血清SP-D水平與致病性氣道定植菌發(fā)生呈正相關(guān)。同時(shí)，氣道定植菌菌株數(shù)量的增加伴隨著血清SP-D水平的升高。以上的結(jié)果提示肺組織局部免疫功能的變化可能是導(dǎo)致致病性細(xì)菌定植的原因之一。

綜上所述，在可以手術(shù)治療的肺癌患者中，約占15%的患者伴有并與術(shù)前致病性細(xì)菌定植，肺癌患者合并致病性氣道定植菌與術(shù)后肺炎發(fā)生密切相關(guān)，術(shù)前發(fā)生致病性氣道定植菌的危險(xiǎn)因素是高齡和長期吸煙史,血清SP-D水平與患者術(shù)前致病菌定植狀態(tài)相關(guān)。

致謝：本課題病例來之成都市六家三級甲等醫(yī)院，李強(qiáng)（四川省腫瘤醫(yī)院胸外科）、芮軍（成都市第三人民醫(yī)院胸外科）、李書平（成都醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸心外科）、金?。ǔ啥即髮W(xué)附屬醫(yī)院胸心外科）等同志在病例收集和標(biāo)本提供上給予我們極大的支持和幫助，他們的無私幫助使得我們的研究得以順利進(jìn)行，在此對他們一并致以衷心的感謝。