錢幫國，焦磊

（珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司，上海 201203）

多標記免疫熒光染色及多光譜成像技術在組織學研究中的應用

錢幫國，焦磊*

（珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司，上海 201203）

免疫組織化學染色及成像分析是研究組織形態(tài)和組織原位抗原表達不可或缺的檢測技術，廣泛應用于臨床病理診斷和醫(yī)學及生物學研究的各個領域。組織切片樣本中蘊含著豐富的信息，但是受制于傳統(tǒng)單標記免疫組織化學染色方法的限制，通常只能對組織中的一到兩種抗原進行染色分析，而且定量結果的判讀往往依賴于肉眼觀測，缺乏客觀標準。隨著蛋白組學的發(fā)展，對現(xiàn)代組織學分析提出了更高的要求，例如不同的蛋白共表達和共定位分析、低豐度分子的檢測、異質性分析、細胞表型統(tǒng)計乃至復雜組織微環(huán)境的描繪等，都需要在同一張組織切片樣本上同時檢測多種靶標分子。這對于理解組織微環(huán)境中各種細胞間的關系，推演信號通路上下游蛋白表達的關系，制定臨床診斷和治療方案都有著非常重要的意義。本文介紹一種基于酪胺信號放大（TSA）技術衍生而來的多標記免疫熒光染色方法，能夠在同一組織切片樣本上復染7種以上抗原并進行區(qū)別標記，配合光譜成像技術和定量分析軟件，能夠將組織中蘊含的豐富信息準確的呈現(xiàn)出來。這套流程化的分析方案為臨床診斷和基礎科研提供了更高精度和更可靠的組織學數(shù)據，將免疫組織化學分析的技術水平提升到一個新的高度。

多色標記免疫組織化學；多光譜成像；酪胺信號放大；定量病理學

隨著新型測序、基因和蛋白芯片以及流式分析技術的發(fā)展，已經可以從正?；蚣膊〗M織中獲取越來越多的基因或細胞表型信息。這些基于均相樣本的分析方法因為缺少形態(tài)學數(shù)據，一般只能測定平均含量，而無法揭示特定表型在組織中的原位分布特點。組織中的蛋白或細胞往往表現(xiàn)為異質性分布[1]，其空間定位以及與組織結構的相互關系對于理解各組分在組織微環(huán)境中的角色和作用有著重要意義。免疫組織化學染色法是利用抗原和抗體間的特異性結合來檢測細胞或組織中特定目標蛋白的實驗方法[2]，兼顧蛋白表達定量和形態(tài)定位檢測兩方面的要求。受益于抗體標記和成像檢測技術的進步，已經有方法可以擺脫常規(guī)免疫組織化學染色和成像技術的限制，將過去局限于一到三種蛋白檢測的傳統(tǒng)免疫組織化學分析，提升為同時檢測多達7種分子靶標的新型免疫組織化學分析方案（PerkinElmer PhenopticsTM），進而滿足組織微環(huán)境中復雜表型分析的需求。本文從多標記免疫組織化學染色、光譜成像和信號拆分以及組織形態(tài)學定量分析三個環(huán)節(jié)對新型免疫組織化學分析方法進行介紹（圖1），并對該方法在生物醫(yī)學研究中的應用前景進行了探討。

圖1 Phenoptics新型免疫組織化學分析方案的分析流程。A，多色免疫熒光染色；B，光譜成像和信號拆分；C，組織形態(tài)學定量軟件分析Fig. 1 Flowchart of Phenoptics analysis. A, multiplexed immunohistochemistry; B, multispectral imaging; C, tissue image quantitative analysis

1 多標記免疫組織化學染色

1.1 傳統(tǒng)方法在多標記免疫組織化學染色中的局限性

抗體種屬限制：自19世紀60年代起，酶標抗體就被用在免疫組織化學染色中顯示特定目標抗原在組織中的定量表達和定位分布，后來拓展到熒光標記。免疫組織化學染色按報告蛋白的結合方式可以分為一抗直接標記和二抗間接標記兩種類型[3]。一抗直標的方法操作簡單，但是標記信號微弱，一般難以滿足弱信號檢測及精細的成像要求。為了達到足夠的染色強度，通常采用二抗標記的方式。在多標記免疫組織化學染色中，為了保證抗原標記的特異性，必須要求在染色中針對不同抗原使用不同種屬來源的一抗抗體，借此保證二抗對目標一抗種屬的特異性識別。但是實際科研工作中，抗體種屬來源的選擇非常少，很難積累到足夠多種類的優(yōu)質抗體，因此常規(guī)免疫組織化學方法一般只能在同一樣本上同時標記一到3種標記物。

染料顏色重疊：限制多標記免疫組織化學染色的另一個因素是染料重疊帶來的信號識別問題。由于組織中不同靶標分子會在空間上出現(xiàn)位置重疊（即使沒有生物學意義上的相互作用），在成像檢測時不同染料信號在同一像素上的疊加就在所難免。基于明場成像的免疫組織化學檢測一般采用酶標記染色，在同一組織切片上進行3種不同的酶鏈抗體顯色是非常困難的[4]。另外相近色染料如DAB（棕色）、AEC（紅色）、PermaRed（紅色）、Eosin（紅色）的組合使用，或者深色染料對淺色染料的遮蓋，都會使顏色混合在一起時變得難以區(qū)分；而且明場光學信號的非線性分布和較窄的動態(tài)范圍，密集的染料沉積也無法進行有效的定量比較。另一種光學檢測方法是免疫熒光成像。熒光標記具備更高的信噪比和強度線性相關性而在多標記染色中獲得更廣泛的使用。借助窄帶通的濾光片可以對熒光信號進行有效的區(qū)分，但是當標記染料達到4種或以上時，潛在的信號串色風險同樣成為不容忽視的問題，加之較強的組織自發(fā)熒光背景干擾，使得高精度的光譜成像檢測成為多標記免疫熒光檢測的必備方案[4-5]。除了光學檢測，質譜技術因其較高的信號分辨率，也被用于免疫組織化學成像分析[6-7]。但是金屬標記、燒蝕樣本的一次性檢測方式以及昂貴的質譜設備都限制了這種方法的廣泛使用。

連續(xù)切片和順次染色法：為了擺脫抗體種屬來源沖突的限制，有研究者采用連續(xù)切片或多次洗脫復染的方式來實現(xiàn)多種抗原的關聯(lián)檢測[8]。連續(xù)切片樣品要求樣本數(shù)量要足夠，對于較小的組織樣本或珍貴的臨床標本并不適合。而且由于切片厚度的限制和損耗，即使連續(xù)的兩張切片之間也難以做到微米級的精準對齊，無法保持細胞的連貫性，也不能進行單細胞級別的共定位分析。另一種嘗試是循環(huán)洗脫復染（SⅠMPLE技術），即對同一張組織切片進行單標記染色，采集圖像，然后洗脫染料和抗體后，再次進行染色和成像，如此循環(huán)多次后再將每輪染色的圖像結果重疊起來以此實現(xiàn)多標記檢測[9-10]。這種方法的缺點是多輪洗脫造成的樣本損傷（特別是抗原丟失）。因為是多輪成像，后期不同批次圖像的對齊分析，尤其是單細胞和亞細胞結構的對齊定位也是一個巨大的挑戰(zhàn)。而且每一輪染色之后信號會被徹底洗脫，因此無法對染色結果進行二次檢測驗證（比如更換不同物鏡倍率進行觀察），這也限制了該方法的應用范圍[11]。

1.2 TSA信號放大技術及Opal多色標記染色技術

近期一種新的基于酪胺信號放大（tyramine signal amplification，TSA） 技術衍生而來的多標記免疫組織化學染色方法（PerkinElmer OpalTMKit）在研究報道中被廣泛使用[12-14]。酪胺信號放大技術已有20多年的歷史，是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶抗原進行高密度原位標記的檢測方法，被廣泛應用于ELⅠSA、ⅠSH、ⅠHC等技術中進行生物學抗原的檢測，大幅提高被檢測信號的靈敏度（圖2A，圖2B）[15]。帶有染料標記的底物酪胺（T）分子在過氧化氫氧化環(huán)境下，被抗體或探針固定的HRP轉化為具有短暫活性的中間狀態(tài)（T*），然后被激活的中間態(tài)分子（T*）迅速與相接蛋白分子的富含電子區(qū)域（酪氨酸殘基）進行穩(wěn)定的共價結合，未被標記的酪胺分子將被洗脫，借此實現(xiàn)對抗原的特異性染色。由于相接的蛋白（包括HRP，抗體，目標抗原）都含有大量的酪氨酸結合位點，所以目標抗原處會富集大量標記分子，使信號被有效放大[16]（圖2C）。Opal技術利用TSA染色中酪胺分子與其結合的抗原蛋白之間共價鍵的穩(wěn)定性，其鍵能遠高于抗原、抗體間的非共價鍵結合力，通過微波加熱法就可以在保留抗原標記信號的同時去除結合在抗原上的一抗和二抗分子，借此實現(xiàn)抗原的直接標記（圖2D）。后續(xù)可以再次使用同一種屬來源的抗體標記其他抗原靶點，只需更換不同的標記顏色，而不必考慮上一輪抗體的交叉干擾。Opal技術徹底解決了多標記免疫組織化學染色中抗體種屬選擇的限制，在設計抗體組合時只需根據各抗體的效價來為各個靶點選擇最優(yōu)的抗體即可。

Opal技術的染色流程與普通免疫組織化學染色相近，只是在每一輪染色過程中增加了一個抗體洗脫步驟（圖3）?？贵w洗脫一般采用微波加熱的方式，與抗原修復過程近似，所以不會對樣本及抗原造成過分的損傷。通過微波洗脫處理可以將以非共價鍵結合在抗原上的抗體去除，但是保留以共價鍵結合在抗原表面的TSA熒光信號，從而實現(xiàn)無抗體干擾的抗原直接標記，再經過多輪染色循環(huán)實現(xiàn)多色標記。

圖2 酪胺信號放大（TSA）染色與傳統(tǒng)組織化學染色比較。A，Hela細胞細胞色素C經常規(guī)二抗標記的免疫熒光染色的結果；B，相同濃度下經TSA信號放大的結果；C，TSA染色過程；D，TSA/Opal與傳統(tǒng)免疫染色標記方法的比較Fig. 2 Comparison between TSA and conventional immunostaining. A, conventional detection of cytochrome C in Hela cell with fluorescence labeled secondary antibody; B, TSA detection of cytochrome C in Hela cell where the deposition of fluorescence labels was amplified proximal to the target antigens; C, TSA staining process; D, comparison between different staining methods

雖然都是采用順次單標、多輪復染的方式，但是Opal與SⅠMPLE等染色洗色、多輪拍照的方法存在著本質的不同。Opal在每輪染色中間的洗脫環(huán)節(jié)只需去除抗體，不需要對抗原上的標記進行徹底洗脫，所以對樣本的損傷會更??；經由Opal染色的多種抗原標記物可以在樣本上同時存在，同時拍攝檢測記錄在同一張圖像畫面上，而無需后期對不同畫面進行加工對齊，這樣就保證了標記物間定位的準確性和穩(wěn)定性；并且樣本可以保存長達一年的時間，隨時可以根據需要進行再次采圖拍攝查驗[4]。三色以下的Opal復染樣本對成像檢測設備的要求不高，可以用普通熒光顯微鏡或共聚焦設備來采集圖像。但是對更多色標記的復染樣本，尤其是獲得無組織自發(fā)熒光干擾的高信噪比圖像，就需要借用專業(yè)的光譜成像設備來進行檢測。

2 光譜成像和信號拆分

經由多色免疫熒光染色的樣本包含多維的生物學信息，包括組織結構信息、不同細胞型的空間分布信息、不同信號通路蛋白或細胞功能標識物的共表達信息等。對這些信息的完整記錄和充分解讀，對于研究疾病發(fā)生發(fā)展的機制，探討診斷和治療疾病的有效方法有著重要意義。然而如上文所述，連續(xù)切片成像和普通濾光片成像的方式都難以完整記錄或準確識別混雜重疊的多標記信號，需要專業(yè)的檢測方法才能對多標記染色樣本中的信息進行有效的記錄和解讀。

圖3 Opal多色免疫熒光染色流程圖Fig. 3 The Opal multiplex IHC workflow

多光譜成像是檢測復雜染色樣品信號的有效手段，不僅能對混雜的各色信號進行識別，而且能夠去除自發(fā)熒光的干擾。實現(xiàn)光譜成像的設備包括光譜型共聚焦顯微鏡（如Zeiss LSM880，Leica SP8等等）和多光譜組織成像系統(tǒng)（PerkinElmer Vectra?）。前者主要用于亞細胞結構的細微成像或厚樣本的深層觀察，對于普通的組織切片（3～5μm），在20×物鏡的解析度下，共聚焦提供的光學層切功能并不是一個必要的選項。而點掃描共聚焦較慢的掃描速度、高強度的光漂白以及缺少配套的組織分析軟件，都使其難以成為組織切片多色成像及定量分析的首選方案。

多光譜組織成像系統(tǒng)是專為組織切片定量分析設計的專業(yè)成像系統(tǒng)，其最大的特色在于圖像光譜信息的采集，同時提供生物組織樣本的形態(tài)結構和光學圖譜兩方面的信息。傳統(tǒng)的光學成像只記錄樣本二維畫面中的灰度或者色彩信息，而光譜圖像是由不同波段二維圖像構成的三維圖組（Cube）[4,5]。在Vectra成像系統(tǒng)中，采用液晶可調諧濾波器（LCTF）以20nm的步進在420～720nm可見光范圍內的進行光譜掃描，各波段采集的高分辨率圖像被相機完整的記錄并合為一體。因此光譜圖像中的任何一個像素點都包含著一段完整的光譜曲線，每一種染料（包括自發(fā)熒光）也都有其對應的特征光譜（圖4）。利用樣品標記中的已知染料光譜，就可以將各色信號從多光譜圖像中拆分出來，變成富含光密度信息的獨立單通道圖像[5]。

光譜成像在組織學分析中具有其獨特的技術優(yōu)勢。對于明場免疫組織化學染色樣品，借助多光譜成像可以對混雜的染料進行有效的識別、拆分和定量，即使是顏色相近的DAB（棕色）或PermaRed（紅色）染料也能被拆分開來，并實現(xiàn)精準的定量[17]。而且經光譜記錄的明場圖像，可以把拆分得到的單通道圖像的顏色進行任意調整，或者轉變?yōu)闊晒庑Ч▓D5A，圖5B）來呈現(xiàn)不同通道間的共定位效果[18]。對于熒光染色的樣品，特別是福爾馬林固定石蠟包埋的樣品，光譜成像可以通過去除組織自發(fā)熒光來提高圖像的信噪比達十倍以上[19]。多于多標記免疫熒光染色的樣品，借助多光譜成像技術可以對多達十色復染的信號進行準確拆分，獲得清晰的、無串擾的、高清晰圖單通道圖像[12-14]。同樣經光譜記錄的熒光染色樣品圖像，也可以轉變?yōu)閭鹘y(tǒng)HE或免疫組織化學樣式的明場效果圖（圖5C—圖5F）便于形態(tài)結構的辨識和病理觀察[19]。

3 智能組織定量軟件分析

在傳統(tǒng)組織學研究中，對于免疫組織化學和免疫熒光圖像的評判多采用人工判讀的方式。通過人工計數(shù)來觀察陽性著色組織的面積比例和分布是一種常用的半定量分析方法，但是需要耗費大量的人力和時間，而且其結果因為存在較大的判讀誤差和主觀傾向性而導致難以做到客觀準確[20]。隨著信息技術的發(fā)展，很多圖像分析軟件如Ⅰmage Pro、Ⅰmage J等被用來輔助進行組織學定量分析。但是對于復雜組織的自動化分析，因為組織樣本的形態(tài)結構與組成極為復雜（如腫瘤組織、癌旁組織、血管、壞死組織等），造成普通軟件無法自動識別不同的組織類型，難以滿足研究者定量分析特定區(qū)域抗原表達的要求，極大的限制了自動化批量定量組織分析的應用。

圖4 七色免疫熒光標記的乳腺癌組織切片多光譜圖像的信號拆分。A，每種染料的特征光譜圖；B1-B8，經光譜拆分所得的單通道圖像；C，原始圖像；D，多光譜合成圖像Fig. 4 Multispectral image unmixing of Opal seven-color multiplex staining of human breast cancer sample. A, spectral properties of each Opal dye; DAPI and autofluorescence were analyzed to generate a spectral library to support multispectral unmixing; B1 to B8, independent signal effectively extracted from the multiplex stain image; C, original image; D, multispectral composite image

新型的專業(yè)定量病理分析軟件（PerkinElmer inFormTM）將智能組織識別算法與光譜解讀和多標記分析融為一體。利用光譜和多色標記提供的豐富信息，軟件可以通過圈選—訓練的方式，將研究者的判讀經驗轉變?yōu)榭陀^算法，自動的將具有特異性結構的目標組織區(qū)域識別分割開來，從而實現(xiàn)只針對感興趣區(qū)域的定量統(tǒng)計分析，大大提高了數(shù)據分析的效率和精度。

多色標記技術和光譜拆分技術帶來的另一個優(yōu)勢是識別不同的細胞表型，并對細胞中表達的特定蛋白進行量化評分。借助特異的細胞標記物可以對組織微環(huán)境中的不同細胞進行標識，再通過光譜采集和信號拆分，得到不同細胞表型的圖像。軟件首先根據核標記（DAPⅠ）信號對組織中的細胞進行識別，并進一步的對胞漿、胞膜進行分割，然后根據不同細胞中相應標記物信號強度和形態(tài)特征以訓練學習的方式將其歸屬為不同的細胞類群。還可以對不同蛋白在特定細胞、特定部位上的表達強度進行定量測定，給出免疫組織化學評分結果，或者是共定位表達的比例（圖6）。由此就在組織原位完成了組織類別、細胞類別、細胞亞結構乃至蛋白表達逐級細化的精準識別，將過去在流式細胞儀上才能實現(xiàn)的細胞分型統(tǒng)計與組織形態(tài)學有機的結合在一起，實現(xiàn)了組織微環(huán)境的完整描繪。

圖5 光譜圖像的明場和熒光效果互換。A和B，乳腺癌組織，p21（DAB染色）和p27（LPR染色）和蘇木精復染的彩色圖像(A)及經光譜拆分和色彩轉換得到對比度更高的明場（B左上）或熒光紅綠共定位顯示效果（B右下）；C，乳腺癌組織，ER（A488）/PR（A594）/HER2（A647）/DAPⅠ四色標記圖像；D-F，經光譜拆分后以DAB效果顯示的ER（D）、HER2（E）和PR（F）染色Fig. 5 Multispectral images can be shown with simulated composite images comprised of unmixed component images. A and B,breast cancer tissue was stained for p21 (DAB) and p27 (LPR) and counter stained with HE; color image of the sample through the oculars (A), simulated bright (upper left in B) or fluorescence composite images to show colocalization (lower right in B); C, breast cancer tissue was stained for ER(A488)/PR(A594)/HER2(A647)/ DAPⅠ; D to F, the multispectral image was unmixed and shown for simulated DAB image for ER(D), HER2(E) and PR(F) separately.

4 應用領域

多標記免疫熒光染色、多光譜成像以及定量病理分析技術三者融合為一個完整的流程方案，可以大幅提升組織形態(tài)學分析數(shù)據的精度，有助于從組織切片樣品中挖掘出更豐富、更可靠的關聯(lián)信息[4]。Mansfield對光譜技術在組織病理學領域的應用進行了系統(tǒng)的總結[5]，尤其在腫瘤、神經、心血管等疾病研究領域應用廣泛。

新型組織分析技術可以大幅提高腫瘤組織研究的效率和精度。2011年美國賓夕法尼亞大學即在《Nature》上發(fā)文，借助光譜成像技術把通過雙色免疫組織化學標記在一起的DAB標記的CA ⅠX信號和Perma Red標記的CCL28信號準確的拆分開來，借此研究腫瘤缺氧與血管生成的關系[17]。加拿大Salk癌癥中心2013年利用光譜成像和軟件識別技術對小鼠組織的腫瘤區(qū)域面積進行了自動劃分和測量統(tǒng)計；荷蘭學術醫(yī)學中心在研究腫瘤干細胞Wnt靶向蛋白的甲基化與直腸癌的預后相關性時，則借助光譜成像和分析軟件針對腫瘤組織（不含基質區(qū)域）的βcatenin陽性染色結果進行了準確評定。在組織芯片（TMA）分析中，新技術帶來的優(yōu)勢更為明顯，因其是對大量組織樣本進行平行染色和高通量分析，用傳統(tǒng)方法處理頗具挑戰(zhàn)性。而多色標記的方法首先就可以大幅節(jié)省組織芯片樣本的制備成本，例如Schalper等人利用Opal多標記染色的方法，在同一張組織芯片上復染了PD-L1、ⅠDO1和B7-H4 3種目標蛋白，分析比較三者表達的相關性[21]。同時因為3種蛋白的數(shù)據均來自相同的樣本和批次，使得數(shù)據間的量化比較也更加可靠。而光譜成像可以獲得更準確的信號定量結果，配合智能定量軟件可以實現(xiàn)大批量視野的全自動分析，大幅提高組織芯片分析的效率。例如美國Dana-Farber腫瘤研究所2011年在《Nature》上發(fā)文闡述SMAD4在前列腺癌發(fā)生過程中的作用，研究中就使用光譜成像和配套軟件來進行組織芯片樣本的自動化分析，并在2015年進一步使用該技術闡述了雄激素受體在前列腺癌腫瘤生成中的重要作用[28]；美國哈佛公共衛(wèi)生學院2011年也在研究前列腺腫瘤組織維生素D受體蛋白表達時，利用光譜成像對組織芯片樣本中的VDR蛋白進行了自動定量統(tǒng)計分析[29]；

圖6 智能組織定量軟件分析流程。A，原始圖像；B，光譜拆分后的圖像（黃色，CD8；綠色，PD-L1；紅色，panCK；藍色，DAPⅠ）；C，識別組織類型（紅色陰影，腫瘤；綠色陰影，間質）和細胞；D，識別細胞表型（紅色，CD8+；綠色，panCK+；藍色，其他類型細胞）；E，腫瘤組織中PD-L1陽性細胞比例；F，腫瘤和間質中CD8+和PD-L1+細胞的數(shù)目Fig. 6 (Process of intelligent quantitative tissue analysis software) Combined spectral, morphologic and cellular analysis of a tissue section. A, multiplexed fluorescence image; B, unmixed multispectral image (yellow, CD8; green, PD-L1; red, panCK; blue, DAPI); C, automated tissue segmentation (red shadow, tumor; green shadow, stroma); D, cell phenotype analysis (red, CD8+; green, pamCK+; blue, other cells); E, PD-L1 positive cell analysis in tumor; F, counts of CD8+ and PD-L1+ cells within tumor and stroma

借助多標記組織成像的方法還可以對腫瘤組織微環(huán)境進行全景描繪（Landscape），其在腫瘤免疫研究中的意義極為重要，能夠提供傳統(tǒng)組織病理分析方法不能發(fā)現(xiàn)的深層信息[13]。借助多標記分析，Mlecnik等人發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境和免疫評分是腫瘤轉移的重要決定因素[22]。Feng等的人的研究表明，在分離有活性的腫瘤浸潤淋巴細胞時，多標記分析同樣具有重要的預測價值。美國MD Anderson 腫瘤研究中心利用多標記分析進行了精細研究，認為T細胞的空間分布與胰腺癌病人的預后緊密相關，其結果最近發(fā)表在《Nature Communication》上。研究中使用了Opal試劑對胰腺癌組織的多個免疫靶點（CD3/CD4/CD8/FoxP3）及腫瘤（CK8）進行了標記，隨后利用Vectra光譜成像系統(tǒng)和inForm軟件分析對腫瘤組織和癌旁組織進行了區(qū)分，再分別對不同組織中的免疫細胞進行表型鑒別和統(tǒng)計分析。inForm提供的精確數(shù)據使得檢測腫瘤細胞特定距離范圍內的T細胞數(shù)量成為可能，借此來判斷T細胞的殺傷效率[8]。這是一種全新的組織微環(huán)境分析方法，提供了傳統(tǒng)方法無法實現(xiàn)的高精度細胞表型分布信息，為疾病的診斷和治療提供了重要的數(shù)據支持。除此之外，多標記和光譜分析技術在肺癌[30]、前列腺癌[31]、黑色素瘤[32]、胰腺癌[33]、肝癌[34]、乳腺癌[35]、頭頸細胞癌[36]、腎小細胞癌[37]、腎纖維化[38]等的研究中都有大量的應用，研究內容涉及腫瘤標志物、腫瘤干細胞、腫瘤免疫、上皮間質轉化[39-40]等。

在神經科學研究領域，多光譜成像也被用于神經退行性疾病的研究，例如德國Darmstadt大學利用光譜技術評價新型探針在腦組織中對Tau蛋白纖維的檢測效果；荷蘭Amsterdam大學使用光譜技術研究腦皮質發(fā)育畸形中的細胞損傷凋亡和神經退行信號通路中的蛋白表達；美國Nebraska大學醫(yī)學中心在研究CCL2蛋白對小鼠神經功能紊亂的影響時，利用光譜成像分析皮層和海馬區(qū)的Aβ/Iba1/ doublecortin蛋白的表達；荷蘭皇家科學院神經研究所利用光譜成像扣除自發(fā)熒光，對不同Braak階段Aβ蛋白在胞內和胞外的表達情況進行清晰的分辨[23-25]。

在心血管疾病研究中，早在2008年美國斯坦福大學醫(yī)學院心胸外科就曾報道，在先天性心臟病嬰兒的活檢組織中使用多光譜成像技術檢測多種分子標記，可以分析新生兒產后早期階段不同心肌祖細胞的數(shù)量以及各種診治手段下的細胞數(shù)量變化趨勢。美國曼徹斯特大學醫(yī)學院也曾借助多光譜技術來扣除了血管的自發(fā)熒光背景干擾，進而觀察納米顆粒圍繞頸動脈的分布細節(jié)[26,27]。

5 展望

隨著轉化醫(yī)學和精準醫(yī)療研究的深入開展，研究者對于組織形態(tài)和病理學定量分析的要求將越來越高。多標記染色、多光譜成像和智能分析軟件三者緊密結合，大幅提高了組織形態(tài)學分析的數(shù)據精度和準確度，不僅滿足了現(xiàn)代組織學分析在數(shù)據客觀性、精確性方面的更高要求，更是從方法學角度為組織學研究帶來了革命性的變化，為描繪復雜的組織微環(huán)境提供了的全新的思路，必將為定量病理學的蓬勃發(fā)展提供新的契機。

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Application of multiplexed immunofluorescent staining and multi-spectral imaging in histological studies

Qian Bangguo, Jiao Lei*
(PerkinElmer China, Shanghai 201203)

Ⅰmmunohistochemical staining and imaging analysis technology is indispensable for the study of tissue morphology and in situ antigen expression. It is widely used in various fields of clinical pathology diagnosis and biological research. The tissue slice sample contains a lot of information, but due to the restriction of traditional single-labeled immunohistochemical staining method, only one or two target antigens can be detected at same time. The quantitative interpretation of the results is often dependent on naked eye observation and lacks objective criteria. With the development of proteomics, there are increasing demands on more sophisticated modern histological analysis, such as different protein co-expression and co-localization analysis, low abundance molecular detection, heterogeneity analysis, cell phenotype statistics, and complex tissue microenvironment description. These features are essential in detecting a variety of target molecules in the same tissue slice simultaneously so that researchers can understand the relationship among various cells in tissue microenvironment, predict the relationship between upstream and downstream protein expression, and develop clinical diagnosis and treatment regimen. This review presents a multi-labeled immunofluorescence staining method based on tyramine signal amplification (TSA) technology. It allows more than seven different markers on the same tissue slice using different colored dyes combined with spectral imaging and quantitative analysis software, therefore the abundant in situ tissue information can be accurately presented. This set of process-oriented analysis can provide more accurate and reliable histological data for clinical diagnosis and scientific research, and bring the immunohistochemical analysis to a higher level.

Multiplexed immunohistochemistry; multispectral imaging; tyramide signal amplification; quantitative pathology

R329-3

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.010

2017-01-20

2017-07-30

錢幫國，男（1989年），漢族，碩士

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：raymond.jiao@foxmail.com