孟慶滔 王斯 劉凱 何霽云 何森 張昕 王勇 石如峰 施迪 文博 潘佩 周雨霏朱小江 廖行 張鑫 張強(qiáng) 蔡亞麗 劉琦 嚴(yán)心 李欣然 龔深圳 陽鈺婕 陳曉平

藥物與臨床

上皮細(xì)胞鈉通道α亞單位（α-ENaC）基因單核苷酸多態(tài)性與四川藏族高血壓氫氯噻嗪療效的關(guān)聯(lián)分析

孟慶滔 王斯 劉凱 何霽云 何森 張昕 王勇 石如峰 施迪 文博 潘佩 周雨霏朱小江 廖行 張鑫 張強(qiáng) 蔡亞麗 劉琦 嚴(yán)心 李欣然 龔深圳 陽鈺婕 陳曉平

基金來源：四川省科技廳-支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2012SZ0131）

目的 研究四川省甘孜州藏族僧尼群體輕度高血壓患者對(duì)小劑量氫氯噻嗪治療的反應(yīng)和耐受性，并比較α-ENaC基因四個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）不同基因型/等位基因攜帶者降壓反應(yīng)的差異。方法 對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的120例初發(fā)藏族輕度高血壓患者進(jìn)行問卷調(diào)查、體格檢查、血清學(xué)檢測；提取其外周血白細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用分子質(zhì)譜法對(duì)α-ENaC基因四個(gè)SNP位點(diǎn)rs2228576、rs10849447、rs13306613和rs3782727進(jìn)行分型；并對(duì)所有入選患者進(jìn)行為期1個(gè)月的小劑量氫氯噻嗪（12.5 mg qd）干預(yù)。結(jié)果 該研究群體用藥前的平均收縮壓為153.73 mm Hg，用藥后的平均收縮壓為143.52 mm Hg，較用藥前血壓值下降10.21 mm Hg；用藥前的平均舒張壓為90.94 mm Hg，用藥后的平均舒張壓為85.16 mm Hg，較用藥前血壓值下降5.78 mm Hg。藥物達(dá)標(biāo)總?cè)藬?shù)為40人，達(dá)標(biāo)率為36.70%。協(xié)方差分析未發(fā)現(xiàn)上述四個(gè)位點(diǎn)不同基因型攜帶者的血壓下降值具有顯著差異。多元線性回歸也未發(fā)現(xiàn)上述SNP位點(diǎn)的突變與血壓下降值有顯著關(guān)聯(lián)。結(jié)論 小劑量氫氯噻嗪可以在短期內(nèi)顯著降低藏族輕度高血壓患者的血壓水平，但未發(fā)現(xiàn)以上SNP位點(diǎn)對(duì)降壓程度有顯著影響。

αENaC； 單核苷酸多態(tài)性； 僧尼； 藏族； 原發(fā)性高血壓； 氫氯噻嗪

藏族高血壓患病率居全國各民族首位，治療率和控制率低[1]。因藏族高血壓的鹽敏感特質(zhì)，降壓藥物氫氯噻嗪可能對(duì)其療效較好[2,3]，但缺乏證據(jù)。上皮細(xì)胞鈉通道α亞單位（α-ENaC）[4,5]基因 SNP位點(diǎn) rs2228576[6-9]、rs10849447[10]、rs13306613[11,12]和rs3782727[13]與高血壓相關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)水鈉潴留影響氫氯噻嗪的療效[14]。本研究擬對(duì)藏族高血壓患者進(jìn)行氫氯噻嗪短期干預(yù)，并分析上述SNP位點(diǎn)對(duì)降壓的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選自四川省甘孜州色達(dá)縣（海拔3700米）五明佛學(xué)院的藏族僧尼，其祖籍分布四川、青海、西藏各地，彼此無親緣關(guān)系。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。研究方案通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①從未服用降壓藥物的1級(jí)高血壓患者；②藏族，世居高原；③年齡18～80歲；④有獨(dú)立的行為能力；⑤愿意參加該試驗(yàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性高血壓；②已知的慢性腎病、肝功能不全；③慢性心功能不全；④肥厚梗阻性心肌病、主動(dòng)脈瓣狹窄；⑤試驗(yàn)前6個(gè)月內(nèi)有不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)后、高血壓腦病、腦血管意外、短暫性腦缺血發(fā)作、確診的視網(wǎng)膜出血或滲出等；⑥現(xiàn)存的嚴(yán)重影響藥物吸收、分布、代謝及排泄的其他疾病。

1.2 基線資料搜集

1.2.1 基本資料搜集 研究對(duì)象大多不懂漢語，故問卷調(diào)查通過當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族醫(yī)療人員翻譯進(jìn)行，內(nèi)容包括年齡、性別、既往病史、飲食、運(yùn)動(dòng)、吸煙、飲酒史等基本信息，并調(diào)查其飲用清茶、奶茶、酥油茶時(shí)是否加鹽。體格檢查包括測量身高、體重、腰圍、臀圍、血壓、心率等。研究對(duì)象均在空腹8～12 h后采集血液5 ml，當(dāng)場離心（3000 r/min，10 min）分裝，干冰運(yùn)輸至四川大學(xué)華西醫(yī)院生化實(shí)驗(yàn)室行全血細(xì)胞及生化檢測。

1.2.2 DNA提取和鑒定 從康為世紀(jì)購買基因組DNA試劑盒和RNA酶，按步驟提取外周血白細(xì)胞DNA。隨機(jī)抽檢樣本OD260/OD280在1.7～2.1。調(diào)整DNA終濃度為10～30 ng/ml，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 質(zhì)譜法測定SNP序列 采用質(zhì)譜法對(duì)SNP位點(diǎn) rs2228576、rs13306613、rs10849447、rs3782727進(jìn)行分型檢測。該檢測由上海英濰捷基生命技術(shù)公司（Invitrogen）輔助完成。

通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA模板，引物序列見表1。循環(huán)步驟為，Step 1：95 ℃，2 min；Step 2：95 ℃，30 s；Step 3：56 ℃，30 s；Step 4：72 ℃，60 s；Step 5：72 ℃，5 min；Step 6：25℃，∞。其中 Step 2到 Step 4重復(fù)循環(huán)45次。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增參數(shù)

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，對(duì)待檢位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸。設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性延伸引物（序列見表2）。在PCR儀中按照下述程序進(jìn)行延伸反應(yīng)。Step 1：94℃，30 s；Step 2：94 ℃，5 s；Step 3：52 ℃，5 s；Step 4：80 ℃，5 s；Step 5：72 ℃，3 min。其中Step 2到 Step 4重復(fù)40個(gè)循環(huán)。最終在突變位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基并終止，此堿基即突變位點(diǎn)，延伸引物將根據(jù)突變類型的差異而連接上不同的ddNTPs，形成分子量差異。延伸產(chǎn)物純化后點(diǎn)樣至靶片上，使用質(zhì)譜儀對(duì)其分子質(zhì)量進(jìn)行檢測，從而得到各SNP位點(diǎn)的具體基因型。

1.3 藥物治療

1.3.1 試驗(yàn)藥物及用藥方案 氫氯噻嗪（片劑，25mg/片，山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：A140704）12.5 mg，每日1次，治療4周。為預(yù)防低血鉀，同時(shí)每日口服氯化鉀緩釋片0.5 g，并鼓勵(lì)患者多吃蔬菜、水果，告知患者若感不適及時(shí)與當(dāng)?shù)匮芯啃〗M聯(lián)系。

表2 延伸引物序列和參數(shù)

1.3.2 隨訪觀察 治療4周末進(jìn)行訪視。內(nèi)容包括：測量血壓，取3次測量讀數(shù)的平均值；登記藥物干預(yù)期間出現(xiàn)的不良反應(yīng)；完善心電圖檢查。

以SBP、DBP對(duì)比基線血壓的下降幅度作為療效評(píng)估值；收縮壓（SBP）＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），舒張壓（DBP）＜90 mm Hg為降壓達(dá)標(biāo)。如血壓達(dá)標(biāo)，繼續(xù)使用氫氯噻嗪降壓治療；如血壓未達(dá)標(biāo)則可加用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）或鈣通道阻滯劑（CCB）中的一種。一旦出現(xiàn)嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂、代謝紊亂、過敏等不良反應(yīng)，根據(jù)情況決定是否停藥。

服藥依從性采用藥物覆蓋率（proportion of days covered，PDC） 評(píng)價(jià)，PDC=（發(fā)放雙克片數(shù)－剩余片數(shù)）*2/總用藥天數(shù)。PDC≥80%認(rèn)為依從性良好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0軟件包。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，否則以中位數(shù)（四分位間距）表示。計(jì)數(shù)資料以百分率描述。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）兩組間比較，并采用LSD進(jìn)行多組間兩兩比較。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)分析。Haploview軟件檢測Hardy-Weinberg平衡（H-W平衡）。采用協(xié)方差分析比較不同基因型/等位基因攜帶者的血壓下降值。多元線型回歸模型分析基因型降壓幅度的關(guān)聯(lián)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 入選研究對(duì)象共120例。其中4例生化指標(biāo)不完整，4例基因提取失敗，3例基因型測定失敗，資料完整的受試對(duì)象共109例，平均年齡為57.39歲，男性患者占45.9%。無患者因不良反應(yīng)中途停藥，亦無嚴(yán)重不良事件發(fā)生。平均依從性約88%。

如表3所示，受試對(duì)象各平均指標(biāo)無明顯異常，男性與女性受試者相比，年齡較輕，血紅蛋白水平較高，血鉀水平較低。

2.2 降壓療效 總?cè)巳涸谟盟幥暗钠骄湛s壓為（153.73±12.21）mm Hg，用藥后的平均收縮壓為（143.52±9.92）mm Hg，較用藥前血壓值顯著下降（10.21±3.90）mm Hg（P＜0.01）?？?cè)巳涸谟盟幥暗钠骄鎻垑簽椋?0.94±9.18）mm Hg，用藥后的平均舒張壓為（85.16±7.65）mm Hg，較用藥前血壓值顯著下降（5.78±2.85）mm Hg（P＜0.01）。經(jīng)過 1 個(gè)月治療后，藥物達(dá)標(biāo)總?cè)藬?shù)為40人，達(dá)標(biāo)率為36.70%。

通過協(xié)方差分析校正了年齡、BMI、服藥前血壓、血糖、肌酐、血鈉、血鉀、喝茶加鹽和佛教相關(guān)活動(dòng)后，男性和女性的收縮壓[（10.14±3.68）mm Hg比（10.17±4.14）mm Hg，P=0.45]、舒張壓[（5.56±2.77）mm Hg 比（5.97±2.93）mm Hg，P=0.346]下降值未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 研究對(duì)象的基本資料（±s）

表3 研究對(duì)象的基本資料（±s）

注：SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；BMI：體重指數(shù)；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

組別 例數(shù) 年齡（歲） 用藥前SBP（mm Hg） 用藥后SBP（mm Hg） △SBP（mm Hg） 用藥前DBP（mm Hg） 用藥后DBP（mm Hg）男性 50 53.26±16.95 153.99±11.43 143.85±9.37 10.14±3.68 89.81±8.62 84.25±6.97女性 59 60.90±12.66 153.51±12.92 143.24±10.43 10.17±4.14 91.89±9.60 85.92±8.15 P值 ＜0.01 0.838 0.749 0.969 0.240 0.257組別△DBP（mm Hg）BMI（kg/m2）Glu（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）男性 5.56±2.77 27.65±4.07 5.04±1.12 4.82±1.20 1.64±0.84 2.86±0.89 1.08±0.23女性 5.97±2.93 26.27±4.71 5.31±0.73 5.12±1.34 1.57±1.02 3.00±1.15 1.46±0.70 P值 0.459 0.125 0.248 0.265 0.720 0.521 ＜0.01組別Cr（μmol/L）尿酸（μmol/L）血紅蛋白（g/L）血鈉（mmol/L）血鉀（mmol/L）血鈉/血鉀男性 83.06±23.26 389.09±101.99 188.93±24.56 142.72±5.00 4.26±0.39 33.76±3.19女性 72.55±18.52 332.56±75.33 166.42±24.76 142.67±2.45 4.79±0.79 30.39±4.36 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 0.947 ＜0.01 ＜0.01

2.3 研究人群的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 從表4可見，四個(gè)位點(diǎn)都符合Hardy-Weinberg平衡，證明雙克治療的研究人群具有較好的群體代表性，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體。

2.4 α-ENaC基因單個(gè)位點(diǎn)與降壓效果的關(guān)聯(lián)分析 表5代表了α-ENaC四個(gè)位點(diǎn)的不同基因型模型和等位基因模型與降壓效果之間的關(guān)聯(lián)情況。若突變純合子基因型數(shù)量≤3個(gè)，則因數(shù)量太少而沒有進(jìn)行累加模型和隱性模型的比較，只是與雜合子進(jìn)行合并后進(jìn)行了顯性模型的分析。

表4 藏族α-ENaC基因4個(gè)位點(diǎn)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

結(jié)果顯示，無論是男性患者還是女性患者，無論是收縮壓還是舒張壓，通過協(xié)方差分析校正了年齡、BMI、服藥前血壓、血糖、肌酐、血鈉、血鉀、喝茶加鹽和佛教相關(guān)活動(dòng)后，兩個(gè)位點(diǎn)的不同模型中均未發(fā)現(xiàn)突變與氫氯噻嗪降壓效果之間的顯著關(guān)聯(lián)。

2.5 α-ENaC基因位點(diǎn)與降壓效果的多元線性回歸 將可能影響患者服氫氯噻嗪后收縮壓下降值的因素如年齡、BMI、用藥前SBP、肌酐、血糖、血鈉、血鉀、喝茶加鹽和佛教相關(guān)活動(dòng)以及各個(gè)基因位點(diǎn)的顯性模型等引入多元線性回歸方程，從不同性別來分析對(duì)收縮壓和舒張壓的下降值具有顯著影響的因素。

表6顯示男性和女性中上述多元線性回歸分析的結(jié)果。結(jié)果顯示，各個(gè)基因位點(diǎn)均未對(duì)血壓值的下降產(chǎn)生顯著影響。

表5 α-ENaC基因SNPs位點(diǎn)與不同性別患者氫氯噻嗪治療后血壓下降值的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

本研究采用12.5 mg氫氯噻嗪對(duì)藏族二級(jí)以下高血壓患者進(jìn)行了為期1個(gè)月的治療，收縮壓和舒張壓顯著下降10.21 mm Hg和5.78 mm Hg，未見不良反應(yīng)發(fā)生。并且四個(gè)SCNN1A基因SNP位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)與血壓下降值之間有顯著關(guān)聯(lián)。

表6 不同性別高血壓患者氫氯噻嗪治療后血壓下降值的多元線性回歸

據(jù)統(tǒng)計(jì)，藏族成年人每日攝入鈉鹽是WHO推薦量的4.5倍[1]，高鹽飲食是其高血壓重要危險(xiǎn)因素[15]。同時(shí)，低鹽干預(yù)可明顯降低藏族高血壓患者血壓水平[16]。綜上說明，鹽攝入量過多和較強(qiáng)的鹽敏感性都參與了藏族高血壓的發(fā)生發(fā)展，因而，氫氯噻嗪可顯著降低藏族高血壓患者的血壓水平。由于本研究對(duì)患者進(jìn)行了補(bǔ)鉀治療，有效避免了低鉀等氫氯噻嗪常見不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，氫氯噻嗪價(jià)格較低廉，對(duì)于經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療均不發(fā)達(dá)的藏區(qū)，是理想的降壓藥物。

理論上講，SCNN1A基因作為水鈉代謝調(diào)節(jié)基因，其SNP可能通過影響高血壓患者水鈉潴留的程度，從而影響氫氯噻嗪的療效[14]，并且ENaC本身即為氫氯噻嗪的主要作用部位[17,18]，因此，其SNP位點(diǎn)突變與氫氯噻嗪療效的關(guān)聯(lián)可能具有一定的意義。但在本研究中，SCNN1A的四個(gè)SNP位點(diǎn)均未被發(fā)現(xiàn)與血壓下降值之間有顯著關(guān)聯(lián)。首先，這可能與藏族與其他種族的種族差異有關(guān)。既往，直接針對(duì)SCNN1A的SNP位點(diǎn)與氫氯噻嗪療效的研究尚無。rs2228576在美國黑人中被發(fā)現(xiàn)對(duì)高血壓具有保護(hù)作用[6,7]。也曾有針對(duì)吉首地區(qū)苗族輕中度高血壓患者的研究，提示rs2228576位點(diǎn)A等位基因攜帶者，經(jīng)氫氯噻嗪治療后DBP降低幅度更大[19]?；A(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)，該位點(diǎn)所在的羧基末端特定序列與ENaC的泛素降解有關(guān)[8]，能減少其在細(xì)胞表面的表達(dá)，使細(xì)胞Na+流顯著減少[9]，但該位點(diǎn)在日本人群中卻并未發(fā)現(xiàn)與高血壓無關(guān)[10]。盡管對(duì)日本人群的研究發(fā)現(xiàn)rs10849447突變與高血壓的發(fā)生顯著相關(guān)[10]，但在新疆哈薩克族人群中卻并沒有發(fā)現(xiàn)該關(guān)聯(lián)[20]。提示可能由于遺傳背景和環(huán)境的差異，rs2228576和rs10849447引起的水鈉潴留對(duì)藏族高血壓的作用有限，從而不會(huì)引起其對(duì)雙克反應(yīng)的差異。其次，該結(jié)果可能與rs13306613和rs3782727位于內(nèi)含子，沒有對(duì)ENaC通道的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生有效影響有關(guān)。而既往針對(duì)rs13306613與血壓的關(guān)聯(lián)研究較少，針對(duì)的群體有限，而對(duì)rs3782727的研究資料更加缺乏。

本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量氫氯噻嗪短期內(nèi)可安全、有效地降低藏族1級(jí)高血壓患者的血壓水平，無明顯不良反應(yīng)；并且在該群體中并未發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs2228576、rs13306613、rs rs3782727、rs10849447 突變與氫氯噻嗪療效間存在顯著關(guān)聯(lián)。

致謝：感謝色達(dá)縣五明佛學(xué)院、甘孜州人民醫(yī)院、色達(dá)縣衛(wèi)生局對(duì)本研究的大力支持

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The association study of Alpha Subunit of the Epithelial Na+Channels（αENaC）gene SNPs with Hydrocholorozide treatment in Sichuan Tibetan hypertension patients

MENG Qing-tao，WANG Si，LIU Kai，et al.Department of Cardiovascular Disease，West China Hospital Affiliated with Sichuan University，Chengdu 610041，China

CHEN Xiao-ping，E-mail：chenxp13@aliyun.com

Objective To investigate the reaction and tolerance of the Tibetan initially-found mild hypertension patients to the small dose Hydrochlorothiazide （HCTZ）therapy，among the monks and nons living in Tibetan Autonomous Prefecture of Garzê， Sichuan province.To compare the antihypertensive effects of Hydrochlorothiazide（HCTZ）in patients with different genotypes of α-ENaC.Methods120 initially-found mild hypertensive patients who met the inclusion and exclusion criteria were surveyed and examined by questionnaire investigations，physical examinations，as well as serological tests.Moreover，their DNA were extracted from the peripheral white blood cells and amplified by the Polymerase Chain Reaction（PCR）.And then，the 4 SNP locuses（rs2228576，rs10849447，rs13306613 and rs3782727）belonging to the α-ENaC genes were identified using the Molecular Mass Spectrometry.Small dose Hydrochlorothiazide（12.5 mg qd）treatment was given to them for one month.ResultsAfter treatment，systolic blood pressure of the patients decreased significantly by 10.21 mm Hg and diastolic blood pressure reduced significantly by 5.78 mm Hg.There are 40 patients who have blood pressure≤140/90 mm Hg after HCTZ therapy，and the rate of BP control was 36.70%.Analysis of covariance showed no significant BP reduction differences among the carriers of distinct genotypes.Similarly，multiple regression analysis still found nosignificant relationship between the BP reduction and SNP locuses mutation.ConclusionIn a relatively short period，small dose Hydrochlorothiazide therapy could effectively reduce the blood pressure of the Tibetan mild hypertensive patients.However，no significant differences were discovered among the patients carrying distinct SNP locuses.

αENaC； Single nucleotide polymorphism； Monks； Tibetan； Primary hypertension；Hydrochlorothiazide

610041 四川省成都市，四川大學(xué)華西醫(yī)院心血管內(nèi)科

陳曉平，E-mail：chenxp13@aliyun.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.06.022

R544.1

A

1672-5301（2017）06-0564-06

2016-09-05）