王 博,王 虹,歐陽曉芳,李 格

（青海大學化工學院， 青海 西寧 810016）

0 引言

隨著我國現(xiàn)代化進程的加快和人民生活水平的日益提高，城市生活污水排放量不斷增加，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益加劇。水體中的氨氮能引起水質(zhì)惡化，造成多種危害[1]，并對污水的處理及回用造成嚴重影響，尋求經(jīng)濟高效的的氨氮去除方法對人類生產(chǎn)生活具有重要意義。氨氮去除方法主要包括物理法、化學法、生物法等，其中生物脫氮技術(shù)備受關(guān)注。生物脫氮利用從自然界中獲得的有益微生物降低氨氮，具有處理成本低、容易操作、無二次污染、處理效果較好等優(yōu)點[2]。

青海省地處青藏高原東北部，高原大陸性氣候，冬季嚴寒而漫長，晝夜溫差大，全省各地年平均氣溫在-4.1 ～ 10.3℃之間[3]，由于其高寒缺氧的地域特征，城市污水處理系統(tǒng)冬季運行較為困難。本試驗從大通河南岸污染水源中篩選出氨氮降解菌，研究在污水體系中的最佳降解條件。本研究針對高原地區(qū)特殊的氣候條件，發(fā)揮優(yōu)勢菌的處理效果，適應復雜的自然水體，對城市生活污水凈化的起到優(yōu)異的效果，其結(jié)果不僅為高原地區(qū)污水凈化的進一步研究提供理論依據(jù)，還可結(jié)合馴化、誘變等生物技術(shù)，提高特殊環(huán)境中目標菌株的降解效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種篩選分離樣品來源于西寧市大通河南岸污染水源，廢水體系引用樣品來源于西寧市第三污水處理廠；菌種活化培養(yǎng)基[4]，LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基[5]。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的生長特性

接3-4環(huán)氨氮降解菌于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于25℃，160 r/min搖床下培養(yǎng)，每間隔12 h用紫外可見分光光度計測定菌液在600 nm下的OD值，記錄OD值隨時間的變化；同時采用血球計數(shù)板法記錄菌數(shù)隨時間的變化；在不同階段，取一定量的菌液降解水樣中氨氮，得到各階段菌液對水中氨氮降解的能力。最后在同一圖中繪制這3個量隨時間的變化曲線，確定在該條件下氨氮降解菌降解能力最高所對應的培養(yǎng)時間。

1.2.2 降解條件的單因素試驗

取水樣50 mL于試管中，分別取接種量為1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液， 降解時間為12，24，36，48，60，72，84 h 和調(diào)節(jié) pH 值為 7，8，9，10，11，12，13，在25℃，160 r/min條件下進行單因素試驗，采用納氏試劑法[6]測出各錐形瓶以及加入等量菌液的空白試驗的氨氮濃度，確定氨氮降解菌在水樣中氨氮降解的最佳條件。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗

在確定單因素降解條件的基礎(chǔ)上，選擇接種量、降解時間、pH值3個因素，利用Box-Behnken設(shè)計3因素3水平的響應面試驗，見表1。

表1 實驗的因素水平及編碼

1.3 驗證試驗

在響應面試驗確定的最佳降解條件基礎(chǔ)上做3個平行試驗，結(jié)果取平均值，并與響應面預測值進行比較以驗證模型可靠性，從而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮降解菌的生長特性分析

以時間為橫坐標，600 nm下的OD值、生物量、氨氮降解率為縱坐標繪制的氨氮降解菌的生長特性曲線見圖1。

圖1 氨氮降解菌生長特性

由圖1可見，在LB液體培養(yǎng)基中，OD值到84 h仍未出現(xiàn)明顯下降，接種60～72 h，生物量趨于平穩(wěn)。比較生長曲線與氨氮降解率曲線法線，菌株降解氨氮最快的時間在穩(wěn)定期的60～72 h，培養(yǎng)至72 h之后降解率有所降低。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 接種量對氨氮降解菌降解效率的影響

在pH值為7的50 mL生活污水中，分別取體積比 1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液，設(shè)3組平行，25℃，160 r/min搖床降解60 h，測定氨氮降解率。結(jié)果表明，接種量在低于10%時，隨菌量增加，氨氮降解率隨之升高；在接種量為10%時，水樣中氨氮降解率達到高，為73.38%，見圖2。

2.2.2 降解時間對氨氮降解菌降解效率的影響

在pH值為7的50 mL生活污水中，接入10%的菌液，設(shè)置3組平行試驗，25℃，160 r/min搖床分別降解 12，24，36，48，60，72，84 h。在時間到達后，測定氨氮降解率。結(jié)果表明，菌株對氨氮的降解率隨著時間的延長明顯提高，在60 h達到最佳的氨氮降解率，為 79.46%，見圖2。

2.2.3 pH值對氨氮降解菌降解效率的影響

在50 mL生活污水中，接入10%的菌液，分別調(diào)節(jié) pH 值為 5，6，7，8，9，10，11，設(shè)置 3 組平行試驗（水樣初始pH值接近7），25℃，160 r/min搖床降解60 h，測定氨氮降解率。結(jié)果表明，菌株在pH值為8時對氨氮的降解率達到最高，為82.24%，見圖2。

圖2 接種量，pH值，降解時間對菌株氨氮去除的影響

2.3 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 結(jié)果的統(tǒng)計分析和回歸數(shù)學模型的建立

利用 Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計 3因素 3水平共17個試驗點的試驗方案，運用Design Expert 8.0對BBD響應面試驗結(jié)果進行分析[7]，見表2。

表2 Box-Behnken響應面設(shè)計回歸分析

運用Design-Expert軟件，按表2中的試驗數(shù)據(jù)擬合得到三元二次回歸方程：

響應值降解率 =-3.57899+0.032107A+0.068459B+0.561 13C+1.666 67 × 10-6AB+1.500 00 × 10-5AC-5.81250 × 10-4BC-1.42620 × 10-3A2-5.0875 × 10-4B2-0.034 180C2

單因素效應分析：令回歸方程中的3個未知數(shù)中的2個固定于0水平，對數(shù)學模型進行分析得到以其中1個因素為決策變量的偏回歸模型[8]：

響應值降解率A=-3.578 99+0.032 107A-1.426 20 × 10-3A2

響應值降解率B=-3.578 99+0.068 459B-5.087 15 × 10-4B2

響應值降解率C=-3.578 99+0.561 13C-0.034 180C2

上述3個方程的二次項系數(shù)均為負值，說明其表征的拋物線都開口向下，因此，3個因素取值均存在最佳值，過大或過小均會使響應值降低。

對方程模型進行方差分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 方差分析表

根據(jù)概率P值越小影響越顯著的原理 (P＜0.1為高度顯著，P＜ 0.05 為顯著，P＞ 0.05 為不顯著），由表3方差分析，可知模型極其顯著，可信度較高；在模型中，單因素 A，B，C 和二次項A2，B2，C2（P＜ 0.05）均對模型影響顯著。 模型失擬率為 0.410 0（＞ 0.05），表明失擬不顯著，故可以用此模型對不同條件下的氨氮降解率進行分析和預測。

表4 回歸模型方差分析

由表4可以得出，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.989 7說明模型可以解釋98.97%的試驗所得降解率。校正系數(shù)RAdj2=97.65%與相關(guān)系數(shù)接近，只有2.35%的降解率總變異不能用此模型解釋。變異系數(shù)CV=1.05%＜10%，說明模型能很好地反映真實的試驗值，即試驗的可靠性較高。

2.3.2 因素間交互作用的分析

為了進一步研究相關(guān)變量之間的交互作用和確定最優(yōu)點，通過軟件做接種量、pH值、降解時間3個主要影響因素對氨氮降解水平交互影響的等高線及響應面立體分析圖，見圖3。由等高線圖可以直觀地反映出2變量交互作用的顯著程度，圓形表示2因素交互作用不顯著，橢圓形表示2因素交互作用顯著[9]。由圖3可以看出AC，BC交叉項的交互作用對響應值氨氮降解率的影響顯著。

圖3 接種量與pH值，接種量和降解時間，pH值和降解時間影響氨氮降解效率的等高線圖及響應面

2.3.3 響應面分析最佳應用條件的確定

從響應面分析得到降解條件最優(yōu)組合及氨氮降解率的預測最大值見表5。

表5 最優(yōu)組合與最大值

2.4 驗證試驗結(jié)果

按照上面的試驗結(jié)果，采用生活污水體系，以氨氮降解菌接種量為 11.33%、降解時間為 62.92 h，pH值為7.68的應用條件進行驗證試驗，結(jié)果為：91.21% ，89.96% ，90.29% ，89.99% ， 其 平 均 值 為90.36%與最大響應值的預測值基本一致，表明該模型能很好地預測實際降解情況。

3 結(jié)論與展望

本試驗對大通河南岸污染水源篩選分離出氨氮去除率較高優(yōu)勢菌株進行生長特性曲線研究，確定菌液氨氮降解能力最高所對應的培養(yǎng)時間為60～72 h；通過單因素試驗，確定菌株在接種量10%，降解時間為60 h，pH 值為8時降解率最高，為82.24%；利用Box-Behnken設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應面試驗，分析接種量、pH值、降解時間3個因素對降解條件的影響，得到最佳凈化的應用條件組合：接種量 11.33%、降解時間為 62.92 h，pH 值為 7.68，菌株對廢水中氨氮的降解率預測最大值為91.03%，由響應面方差分析可知，降解模型顯著，接種量、降解時間、pH值對降解率影響顯著，且3因素交互作用對響應值有一定影響。按照最佳應用條件進行驗證試驗，得到驗證實驗結(jié)果平均值為90.36%，與最大響應值的預測值基本一致，且比單因素研究條件下提高了8.12%，試驗表明響應面法對氨氮降解菌在高原環(huán)境中降解污水條件的優(yōu)化合理可行，研究結(jié)果為高原環(huán)境微生物凈化生活污水應用提供理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中可運用研究所得模型與實際污水處理系統(tǒng)相結(jié)合，最大程度去除污水中氨氮，實現(xiàn)污水的生態(tài)良性演化。