王 昱，王 浩,2

（1.江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院 江蘇省環(huán)境工程重點實驗室，江蘇 南京 210029；2.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇 南京 210023）

0 引言

近年來，隨著社會經(jīng)濟快速發(fā)展及人口不斷增加，大量工農(nóng)業(yè)、漁業(yè)及生活污水進入周圍水環(huán)境，其中富含的氮素營養(yǎng)鹽會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，對地表水環(huán)境造成嚴重的破壞[1-3]。貢湖是太湖的重要組成部分之一，由于城市的快速擴張，面臨著自凈能力下降、生態(tài)系統(tǒng)退化及生物多樣性降低等問題。親水河作為各水域水體流入貢湖前的主要緩沖河道，對攔截地表徑流中各類污染物質(zhì)進入貢湖起到重要作用。河道水體氮素營養(yǎng)鹽的升高，會嚴重影響貢湖的生物多樣性及系統(tǒng)穩(wěn)定性。因此，采取合適方法降低河道氮素營養(yǎng)鹽濃度，具有重要的意義。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對植物及脫氮微生物的生態(tài)修復(fù)方法去除河道水體氮素營養(yǎng)鹽進行了大量研究[4-6]。然而，以往的研究主要針對河道水體氮素脫除效果，并未對氮素去除過程的定量貢獻進行研究，對不同生態(tài)修復(fù)手段下，反硝化過程及植物吸收降低水體硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的機制研究尚不多見[7]。

因此，研究通過運用脫氮微生物（INCB）與伊樂藻（Elodea nuttallii）相結(jié)合的生態(tài)修復(fù)手段，通過室內(nèi)模擬實驗分析添加INCB及種植沉水植物對河道反硝化速率及植物吸收的影響，探討不同生態(tài)修復(fù)手段對硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的脫除機制。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集

實驗樣品于 2015年4月在親水河（32°17′52″N,120°20′20″E）進行采集，見圖1。 采用特制有機玻璃柱狀采泥器采集24根完整無擾動底泥柱，每柱保留泥樣約40 cm。同時采集原位上覆水及長勢良好伊樂藻樣品，于4 h內(nèi)送至實驗室進行培養(yǎng)前處理。

圖1 貢湖灣入湖河道-親水河采樣點地理位置示意

1.2 室內(nèi)實驗設(shè)計

將24根底泥柱樣分成平行的6排，每排柱樣使用4個不同的處理方式，分別為：A組，不做任何處理的裸泥組，僅作為對照；B組，僅添加60±1 g脫氮微生物INCB，INCB的制備與應(yīng)用已在相關(guān)研究中詳細描述[8]；C組，植入5株長約10 cm長勢良好的伊樂藻；D組，添加INCB和沉水植物。保持室溫約20±1℃進行為期6個月的室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)接受后，對相關(guān)理化數(shù)據(jù)及15N同位素豐度進行測定。

1.3 樣品測定指標及方法

1.3.1 水質(zhì)測定方法

紫外分光光度法測定硝態(tài)氮；納氏試劑分光光度法測定氨態(tài)氮；過硫酸鉀氧化紫外分光光度法（日本島津UV-2450）測定TN；便攜式溶氧儀（YSI 550A）進行測定溶解氧。

1.3.2 同位素15N的添加

經(jīng)過6個月的室內(nèi)培養(yǎng)后，系統(tǒng)內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)趨于穩(wěn)定，向平行的3排泥柱分別加入同位素標記的①Na15(NO3ω（15N）=99.16）；②15NH4(Clω（15N）=99.11），使得每個處理組中的15NO3-和15NH4+濃度約為100 μmol/L，同位素添加后使用橡膠塞密封，在室溫下（20±1℃）進行無頂空密閉靜態(tài)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后進行反硝化和植物吸收速率的測定。

1.3.3 反硝化速率的測定

使用注射器采集各處理組上覆水，溢流收集到密封良好的采集管中，加入約0.5 mL質(zhì)量濃度為500 g/L的ZnCl2溶液，用以抑制管中微生物活性，恒溫保存樣品，使用膜接口質(zhì)譜儀（Prisma QMS200f）對反應(yīng)體系中溶解性氣體28N2（14N14N），29N2（14N15N），30N2（15N15N）的濃度進行測定。反硝化速率計算公式如下[9-10]：

式中：r29和r30分別為同位素氮氣29N2及30N2的產(chǎn)生速率；D15為利用15N的反硝化速率；D14為利用14N的反硝化速率；Dw為非耦合硝化反硝化速率；Dn為耦合硝化反硝化速率；Dtotal為總反硝化速率；δ為室內(nèi)模擬實驗柱中15N豐度，X代表NO3-或NH4+，a代表添加同位素前，b代表添加同位素后。

1.3.4 植物吸收速率測定

采集實驗柱中伊樂藻樣品，洗凈表面泥土后，于80℃烘箱中烘至恒重，使用研缽將干燥后的伊樂藻樣品研磨成均勻粉末后過0.15 mm篩，于1/10 000天平稱取定量植物粉末樣品，使用同位素比質(zhì)譜儀和在線元素分析儀 （Europa Scientific Integra,Crewe,UK）對樣品15N豐度及氮素百分比進行測定。植物吸收速率計算公式如下[11]：

式中：δ15N（water,time=ambient）為添加植物前水體中15N；δ15N（water,time=0）為添加植物后即刻水體中15N；δ15N（veg,time=ambient）為添加植物前植物中15N；δ15N（veg,time=t）為培養(yǎng)結(jié)束后植物中15N；ω(TN（veg）)為植物中總氮，g/kg；Biomass（veg）為實驗柱中伊樂藻總生物量，g/m2。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法

使用Excel數(shù)據(jù)包對實驗數(shù)據(jù)進行歸納；采用Origin 8.6進行圖形繪制；數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0進行分析；采用單向方差分析（ANOVA）來區(qū)別不同處理組樣品間的差異；在不同組間的顯著性差異水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧侵蝕深度測定結(jié)果分析

通過對泥水界面底泥溶解氧侵蝕深度的研究發(fā)現(xiàn)，4個不同的處理組間存在顯著性差異（P＜0.05）。C，D這2組（種植伊樂藻）溶解氧侵蝕深度約30 mm，而A，B這 2組（未種植伊樂藻）中溶解氧侵蝕深度僅約14 mm，見圖2。由于植物根部釋氧，C組和D組中氧侵蝕深度得到增加，在根系周圍底泥一定范圍內(nèi)形成好氧-缺氧微環(huán)境，還導(dǎo)致根區(qū)底泥氧化還原電位的變化[12]，提升了氮素轉(zhuǎn)化效率。

圖2 不同處理組中底泥溶解氧侵蝕深度

2.2 反硝化速率測定結(jié)果分析

15NO3-和15NH4+添加后經(jīng)過24 h靜態(tài)培養(yǎng)，不同處理組中反硝化速率見圖3（a：添加15NO3-；b：添加15NH4+），各處理組間反硝化速率存在顯著差異（P＜0.05）。相較于其他3個處理組，在添加15NO3-和15NH4+的處理組中，C組總反硝化速率均最低，分別為82.01和49.65 μmol/(m2·h)； 添加INCB的D組具有最高的反硝化速率，分別為 258.6 和 156.49 μmol/(m2·h)；同時，添加了INCB的處理組（B組和D組）反硝化速率顯著高于未添加INCB的處理組（P＜0.05），INCB中富含大量脫氮微生物在系統(tǒng)中得到釋放，增加氮循環(huán)菌數(shù)量，促進氮素向氮氣的轉(zhuǎn)化，提高系統(tǒng)內(nèi)的反硝化速率[13]。

對于添加15NO3-和15NH4+的處理組，在A組中均具有最低的耦合反硝化速率，分別為52.8和25.1 μmol/(m2·h)；而在D組，具有最高的耦合反硝化速率，分別為 177.3和 98.5 μmol/(m2·h)。 在處理組 D 中，由于INCB的添加，增加了系統(tǒng)中脫氮微生物豐度，植物的種植為微生物提供附著生長的表面，同時，植物分泌有機物為脫氮微生物提供碳源，從而促進了耦合反硝化作用[14-16]。添加15NO3-處理組中反硝化速率約是添加15NH4+的處理組1.5倍，結(jié)果說明模擬系統(tǒng)中微生物對NO3-的轉(zhuǎn)化率要高于NH4+，NH4+經(jīng)過硝化細菌的氧化變?yōu)閬喯跛猁}（NO2-）和硝酸鹽（NO3-），從而被反硝化微生物利用，生成N2或N2O，其被利用速率相較于15NO3-慢，從而導(dǎo)致添加15NO3-處理組具有更高的反硝化速率。

圖3 不同處理組中反硝化速率

2.3 植物吸收速率測定結(jié)果分析

添加同位素15NO3-和15NH4+后，沉水植物伊樂藻對15N的吸收速率見圖4。其中，種植沉水植物的C和D組植物中15N可檢測豐度得到增加，伊樂藻對15NO3-的吸收速率分別為119.93和83.52 μg/(m2·h)，對15NH4+的吸收速率分別為208.42和162.07μg/(m2·h)。

不同處理組中伊樂藻對氮素的吸收速率不同，對于僅添加伊樂藻的處理組C，其植物吸收速率高于組D（伊樂藻+INCB），由于INCB的添加，脫氮微生物豐度得到增加，從而與伊樂藻形成氮素競爭[17]，部分15N被微生物轉(zhuǎn)化為含氮素氣體而脫除[18]。對比添加15NO3-的處理組，添加15NH4+的處理組中伊樂藻大約是對15NO3-吸收速率的2倍，結(jié)果說明伊樂藻對銨態(tài)氮具有更高的吸收量[19]，沉水植物伊樂藻中15N同位素的大量存積，說明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均可以被植物大量吸收，水生植物對氮素的吸收作用是河道系統(tǒng)脫氮的主要途徑之一。

圖4 不同處理組植物吸收速率

2.4 反硝化速率與植物吸收速率比較分析

對反硝化速率與植物吸收速率進行統(tǒng)一換算，對比見表1。

表1 反硝化速率與植物吸收率比較μmol·m-2·h-1

由表1可知，對于未添加沉水植物的處理組A和B，反硝化是主要脫氮過程；添加15NO3-的處理組中，組C 和D反硝化速率分別為82.01和258.6μmol/（m2·h)，植物吸收速率分別為 1.90 和 1.33 μmol/（m2·h)；對于添加15NH4+的處理組，組C和D反硝化速率分別為49.65 和 156.49 μmol/（m2·h)，植物吸收速率分別為10.97 和 8.53 μmol/（m2·h)。 添加不同形態(tài)氮素的處理組中，反硝化速率脫氮速率均要高于植物吸收速率，沉水植物伊樂藻對反硝化的促進作用要大于其對氮素的吸收作用。D組中由于INCB的加入，降低了植物吸收率，但氮素總體去除率仍大于只添加INCB和伊樂藻的處理組。結(jié)果表明，反硝化和植物吸收均能去除河道水體氮素，相較于植物吸收，微生物反硝化作用是更為主要的氮素脫除途徑[20]。

3 結(jié)論

（1）沉水植物伊樂藻的種植不僅通過自身吸收作用脫除水體氮素，還改變了泥水界面微環(huán)境，增加氧侵蝕深度，提供良好的好氧-缺氧生存環(huán)境，促進微生物的反硝化脫氮過程。

（2）通過添加INCB并種植伊樂藻，增加了微生物反硝化速率，在添加INCB和種植伊樂藻的處理組中反硝化速率及氮素脫除效率均為最高。

（3）對比添加15NO3-的處理組，添加15NH4+的處理組中伊樂藻吸收速率大約是對15NO3-的2倍，而添加15NO3-處理組中反硝化速率約是添加15NH4+的處理組1.5倍，與植物吸收相比，反硝化脫氮是主要的脫氮方式。

（4）室內(nèi)生態(tài)模擬實驗結(jié)果說明，植物吸收和微生物反硝化作用均是水體氮素脫除的有效途徑，通過對INCB和植物的聯(lián)合應(yīng)用，可以提高水體氮素的去除速率，促進河道水體凈化。