梁志剛，孫旭文，李敏，竇連偉，陶曼麗，王曉民

·論著·

褐藻多糖硫酸酯對1-甲基4-苯基吡啶離子損傷的MN9D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及組織蛋白酶D-單克隆凋亡相關(guān)蛋白的作用

梁志剛，孫旭文，李敏，竇連偉，陶曼麗，王曉民

目的 探討褐藻多糖硫酸酯(FUC)對1-甲基4-苯基吡啶離子(MPP+)損傷的MN9D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及組織蛋白酶D(CatD)單克隆凋亡相關(guān)蛋白的作用。方法 采用100 mol/L MPP+損傷MN9D細(xì)胞制備帕金森病(PD)細(xì)胞模型。觀察FUC預(yù)處理后PD細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率。采用熒光檢測法測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSH)抑制率。采用Western blot法檢測CatD、自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ)及Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 與MPP+組比較，1×10-6、10-5、10-4mol/L FUC預(yù)處理細(xì)胞存活率均顯著升高(均P<0.01)。與對照組比較，MPP+組SOD、GSH抑制率顯著降低(均P<0.05)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組及SEL預(yù)保護(hù)組SOD、GSH抑制率顯著升高(均P<0.01)。FUC預(yù)保護(hù)組與SEL預(yù)保護(hù)組SOD、GSH抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MPP+組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表達(dá)顯著高于對照組(均P<0.001)。FUC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平顯著低于MPP+組(均P<0.001)。FUC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 FUC對PD細(xì)胞模型有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為保護(hù)細(xì)胞溶酶體，抑制CatD-Bax的表達(dá)，抗氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡。

褐藻多糖硫酸酯；MN9D細(xì)胞；1-甲基4-苯基吡啶離子；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

帕金森病(PD)是一種常見神經(jīng)變性病，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明[1]。已有研究[2]證實，氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡在退行性疾病發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。組織蛋白酶D(CatD)在線粒體水平之前即參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。褐藻多糖硫酸酯(FUC)是海洋生物褐藻提取的具有抗氧化、抗凝及抗老化的多糖，與葡胺聚糖(GAG)有類似結(jié)構(gòu)[2]。有研究[3]表明，F(xiàn)UC對Alzheimer’s病模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究小組前期實驗[4]結(jié)果顯示，F(xiàn)UC對PD模型有保護(hù)作用。本研究采用1-甲基4-苯基吡啶離子(MPP+)損傷小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系MN9D細(xì)胞，探討FUC與氧化損傷、CatD-Bax軸的關(guān)系，尋找其干預(yù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制及作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料及分組 MN9D細(xì)胞購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞室，于我中心實驗室保存，分為對照組、MPP+組、FUC預(yù)保護(hù)組、司雷吉蘭(SEL)預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基為美國GIBCO BRL公司產(chǎn)品，新生牛血清(NCS)為奧地利PAA公司產(chǎn)品，胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品，MPP+為美國SIGMA公司產(chǎn)品。FUC購自中國生物檢驗中心，純度99.8%；陽性對照藥物選擇單胺氧化酶抑制劑司雷吉蘭是目前臨床上常用的治療藥物(SEL)[5]，有效藥物濃度10 μmol/L。MTS細(xì)胞活力測定試劑盒為PROMAGE公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH)熒光檢測試劑盒購自CELL BIOLABS公司；小鼠單克隆凋亡相關(guān)蛋白(Bax)、CatD、自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ)抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自SIGMA公司。其他試劑均為分析純，購自SIGAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 MN9D細(xì)胞培養(yǎng)及MPP+誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞損傷的模型建立 從液氮罐中取出凍存MN9D細(xì)胞管，迅速放入37℃水浴中，令其盡快融化。1 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀物用DMEM/F12+10%NCS培養(yǎng)液混懸，吸出細(xì)胞懸液，用適量培養(yǎng)液稀釋后，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h進(jìn)入指數(shù)生長期后進(jìn)行傳代培養(yǎng)并進(jìn)行試驗。將細(xì)胞接種于Poly-L-lysine包被的96孔板，接種密度為1×105/ml，每孔接種體積為100 μl。細(xì)胞穩(wěn)定24 h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基。根據(jù)本研究小組既往研究[6]結(jié)果，選用100 μmol/L的MPP+損傷MN9D細(xì)胞24 h制備PD細(xì)胞模型，對照組加入相同體積的生理鹽水。MN9D細(xì)胞接種于Poly-L-lysine包被的96孔板，接種密度為1×105/ml，每孔接種體積為100 μl。利用MTS試劑盒檢測細(xì)胞存活率，篩選確定FUC最佳保護(hù)濃度。將MN9D細(xì)胞接種于Poly-L-lysine包被的96孔板，細(xì)胞穩(wěn)定24 h后更換含5%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，分別采用1×10-8～10-4mol/L梯度濃度的FUC的培養(yǎng)基預(yù)處理MN9D細(xì)胞1 h后，加入100 μmol/L MPP+共孵育24 h。吸取培養(yǎng)液，更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，96孔板內(nèi)每孔加入10 μl MTS試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值，比較MPP+組及不同濃度FUC組的細(xì)胞存活率，以確定FUC最佳保護(hù)濃度。將MN9D細(xì)胞接種于Poly-L-lysine包被的6孔板，接種密度為1×105/ml，每孔接種體積為0.5 ml。細(xì)胞穩(wěn)定24 h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組分別加入最佳保護(hù)濃度的FUC、SEL 10 μmol/L及CatD抑制劑——pepstatinA 10 μmol/L孵育1 h后，加入100 μmol/L的MPP+共孵育。

1.3.2 MN9D細(xì)胞SOD、GSH活力的檢測及細(xì)胞形態(tài)的觀察 按上述方法處理12 h后按照試劑盒操作說明步驟，應(yīng)用熒光檢測儀檢測對照組、MPP+組、FUC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組的MN9D細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH活力，以抑制率(%)表示，抑制率越高，細(xì)胞活性越高；24 h后采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，隨機(jī)取4個視野，100倍率，觀察各組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞數(shù)目。

1.3.3 MN9D細(xì)胞相關(guān)蛋白水平的檢測 按上述方法處理3 h后采用Western blot法檢測對照組、MPP+組、FUC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組的LC-3Ⅱ、CatD蛋白表達(dá)，共孵育6 h后檢測Bax蛋白表達(dá)。將培養(yǎng)6孔板中的各組細(xì)胞加入99 μl蛋白裂解液及1 μl雞尾酒蛋白酶抑制劑，冰上裂解5 min，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，移液器把裂解物移到艾本德管中，裂解產(chǎn)物超聲處理3次。冰浴中靜置30 min，12 000 r/min，4℃，離心5 min。將上清移入另一艾本德管中，棄去沉淀。95℃變性5 min，存于-20℃冰箱中待用。灌制10%～12%分離膠和5%積層膠，樣品置于凝膠加樣緩沖液中，電泳槽中充滿電泳緩沖液，加入60 μg樣品后連接電源。采用80 V處理20 min，再調(diào)整為120 V處理80～100 min，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠和硝酸纖維素膜裝入標(biāo)有正、負(fù)極的轉(zhuǎn)膜夾板中：從陰極側(cè)開始，依次放置海綿墊片、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜、3層濾紙、海綿墊片，排出氣泡，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，置于含有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中(100 V，60 min)。取出硝酸纖維素濾膜，PBS洗膜10 min，置于含5%脫脂奶粉PBS溶液中封閉，室溫輕搖1～2 h，各組細(xì)胞分別加入含5%脫脂奶粉PBST稀釋的小鼠抗Bax(1∶500)、CatD(1∶2 000)、LC3-Ⅱ(1∶2 000)并加入用于作為內(nèi)參的小鼠抗GAPDH抗體(1∶10 000)，4℃孵育過夜。次日取出后室溫放置30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，加入IRDye800(1∶10 000)標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫輕搖1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用PBS洗去膜上殘留的Tween-20。采用Odyssey紅外成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行掃描測蛋白條帶OD值，檢測CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白WB條帶OD值；每組重復(fù)4次，取均值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的FUC對PD細(xì)胞模型中MN9D細(xì)胞存活率的影響 MPP+組細(xì)胞存活率為49%，1×10-8～10-4mol/L FUC組細(xì)胞存活率分別為50%、52%、54%、62%、71%。與MPP+組比較，1×10-6、10-5、10-4mol/L FUC預(yù)處理細(xì)胞存活率均顯著升高(均P<0.01)，10-8及10-7mol/L FUC預(yù)處理細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中10-4mol/L FUC與保護(hù)MN9D細(xì)胞存活率最高，故為FUC最佳保護(hù)濃度。

2.2 各組間MN9D細(xì)胞SOD、GSH抑制率的比較 見表1。與對照組比較，MPP+組SOD、GSH抑制率顯著降低(均P<0.05)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組及SEL預(yù)保護(hù)組SOD、GSH抑制率顯著升高(均P<0.01)。FUC預(yù)保護(hù)組與SEL預(yù)保護(hù)組SOD、GSH抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組間MN9D細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH抑制率的比較(%)組別SODGSHMPP+組5．45±1．53?1．54±0．38?FUC預(yù)保護(hù)組16．01±2．14△2．86±0．72△SEL預(yù)保護(hù)組15．23±2．88△2．78±0．77△對照組19．86±4．414．84±0．99 注：與對照組比較?P<005；與MPP+組比較△P<001

2.3 各組細(xì)胞形態(tài)的比較 見圖1。對照組細(xì)胞形態(tài)正常，數(shù)目均勻；MPP+組細(xì)胞形態(tài)變圓，胞體變小，突起變短或消失，細(xì)胞數(shù)目減少；FUC預(yù)保護(hù)組細(xì)胞數(shù)目略多，形態(tài)完整，胞體突起變短，數(shù)量較MPP+組明顯增加； SEL預(yù)保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)好轉(zhuǎn)，突起變短，細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，數(shù)目較MPP+組增多。

圖1 各組MN9D細(xì)胞形態(tài) A：對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞數(shù)目均勻；B：MPP+組細(xì)胞形態(tài)變圓，胞體變小，突起變短或消失，細(xì)胞數(shù)目減少；C：FUC預(yù)保護(hù)組細(xì)胞數(shù)目略多，細(xì)胞形態(tài)完整，胞體突起變短；D：SEL預(yù)保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)好轉(zhuǎn)，突起變短，細(xì)胞數(shù)目較MPP+組增多

2.4 各組間LC3-Ⅱ、CatD、Bax蛋白表達(dá)水平比較 見表2、圖2。與對照組比較，MPP+組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表達(dá)顯著增加(均P<0.001)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平顯著下降(均P<0.001)。FUC組、SEL組及CatD抑制劑組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組間MN9D細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(x±s，OD值)組別LC3?Ⅱ蛋白CatD蛋白Bax蛋白MPP+組0．462±0．01?0．403±0．01?0．399±0．02?FUC預(yù)保護(hù)組0．308±0．02△0．280±0．01△0．263±0．02△SEL預(yù)保護(hù)組0．316±0．01△0．254±0．02△0．262±0．01△CatD抑制劑組0．311±0．07△0．250±0．01△0．260±0．01△對照組0．239±0．020．219±0．020．215±0．01 注：與對照組比較?P<0001；與MPP+組比較△P<0001

圖2 各組間LC3-Ⅱ、CatD、Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

PD是神經(jīng)系統(tǒng)慢性變性病[7]，主要病理改變是中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少，出現(xiàn)錐體外系癥狀。目前研究[8]認(rèn)為，PD是年齡老化、環(huán)境因素及遺傳因素相互作用的結(jié)果。其中氧化應(yīng)激、線粒體及溶酶體途徑及細(xì)胞凋亡在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用[9]，尋求神經(jīng)保護(hù)藥物是PD的研究熱點[10]。

氧化應(yīng)激是受到關(guān)注最多的一種PD發(fā)病機(jī)制[11]。尸檢[12]結(jié)果表明，PD患者黑質(zhì)部位存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，如游離鐵離子增多、GSH含量下降、線粒體復(fù)合體Ⅰ功能受損以及大量被氧化損傷的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)或6-羥多巴胺(6-OHDA)等神經(jīng)毒素也可在體內(nèi)產(chǎn)生自由基，破壞紋狀體多巴胺能神經(jīng)元。這些都提示氧化應(yīng)激可能與PD的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。自噬是溶酶體依賴的蛋白質(zhì)降解途徑[13]，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體甚至整個細(xì)胞器的降解，與PD 的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)[14-15]。研究[16]表明，自噬可能是凋亡的一個觸發(fā)因素。LC3-Ⅱ是目前公認(rèn)的自噬體標(biāo)記物，其表達(dá)增高表明細(xì)胞自噬增加進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來研究[17]發(fā)現(xiàn)，自噬可能是PD發(fā)病的原因。MPP+可致細(xì)胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，常用來制備PD細(xì)胞模型[18]。近年來有研究[19]認(rèn)為，MPP+通過溶酶體途徑導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷及自由基清除障礙，溶酶體釋放CatD，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，MPP+組LC3-Ⅱ蛋白水平顯著增加(P<0.001)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平顯著下降(均P<0.001)。本研究采用司雷吉蘭(SEL)作為陽性藥物對照組，SEL為單胺氧化酶B抑制劑，是臨床有效的PD治療藥物，證實了本研究的穩(wěn)定性。CatD抑制劑——PepstatinA可以特異性阻斷CatD蛋白表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡。而本研究結(jié)果提示，F(xiàn)UC可能具有類似CatD抑制劑的作用，降低MPP+導(dǎo)致的MN9D細(xì)胞溶酶體損傷。

多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子，是動植物中的支持組織和重要的能量來源。研究[6]發(fā)現(xiàn)，GAG具有在細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體水平上對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生早期負(fù)調(diào)控的作用。FUC與GAG結(jié)構(gòu)成分非常類似。既往研究[20]表明，F(xiàn)UC有抗氧化及抗凝作用，對AD細(xì)胞模型具有抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用。本研究組前期研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UC通過抗炎作用影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對PD細(xì)胞模型有保護(hù)作用。本研究觀察了FUC對MPP+誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞模型抗氧化指標(biāo)及溶酶體相關(guān)蛋白影響發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，MPP+組SOD、GSH抑制率顯著降低(均P<0.05)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組及SEL預(yù)保護(hù)組SOD、GSH抑制率顯著升高(均P<0.01)。與對照組比較，MPP+組LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表達(dá)顯著增加(均P<0.001)。與MPP+組比較，F(xiàn)UC預(yù)保護(hù)組、SEL預(yù)保護(hù)組及CatD抑制劑組LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平顯著下降(均P<0.001)。提示FUC可能具有CatD抑制作用，可能通過保護(hù)溶酶體-線粒體通路，抑制了細(xì)胞凋亡途徑，抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，對PD細(xì)胞模型有保護(hù)作用。

本研究證實，F(xiàn)UC能減少PD細(xì)胞模型內(nèi)溶酶體相關(guān)LC3-Ⅱ蛋白及CatD蛋白表達(dá)，抑制凋亡蛋白Bax，增加細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH，對抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)MN9D細(xì)胞。提示溶酶體相關(guān)CatD-Bax及氧化應(yīng)激可能是FUC保護(hù)PD細(xì)胞模型的作用機(jī)制及靶點，需進(jìn)一步研究。

[1]Thomas B, Beal MF. Parkinson’s disease[J]. Hum Mol Genet, 2007, 16: 183.

[2]Dudas B, Rose M, Cornelli U, et al. Neuroprotective properties of glycosaminoglycans: potential treatment for neurodegenerative disorders[J]. Neurodegener Dis, 2008, 5: 200.

[3]Barbosa M, Valentao P, Andrade PB. Bioactive compounds from macroalgae in the new millennium: implications for neurodegenerative diseases[J]. Mar Drugs, 2014, 12: 4934.

[4] Luo D, Zhang Q, Wang X, et al. Fucoidan protects against dopaminergic neuron death in vivo and in vitro[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 617: 33.

[5]Riederer P, Laux G. MAO-inhibitors in Parkinson’s Disease[J]. Exp Neurobiol, 2011, 20: 1.

[6]Lehri-Boufala S, Ouidja MO, Barbier-Chassefisre V, et al. New roles of glycosaminoglycans in alpha-Synuclein aggregation in a cellular model of parkinson disease[J]. PLoS One, 2015, 10: e0116641.

[7]吳艷，杜娟，任義勝. 美多芭聯(lián)合恩他卡朋治療對帕金森病患者血漿同型半胱氨酸水平的影響[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志, 2016, 29: 333.

[8]Harris JR. Protein aggregation and fibrillogenesis in cerebral and systemic amyloid disease[DB/OL].springer：King’s College London, 2016[2012-12-06].https://link.springer.com/book/10.1007/978-94-007-5416-4.

[9]Von Stockum S, Nardin A, Schrepfer E, et al. Mitochondrial dynamics and mitophagy in Parkinson’s disease: A fly point of view[J]. Neurobiol Dis, 2016, 90: 58.

[10]Aldakheel A, Kalia LV, Lang AE. Pathogenesis-targeted, disease-modifying therapies in parkinson disease[J]. Neurotherapeutics, 2014, 11: 6.

[11]Kim GH, Kim JE, Rhie SJ, et al. The role of oxidative stress in neurodegenerative diseases[J]. Exp Neurobiol, 2015, 24: 325.

[12]Uttara B, Singh AV, Zamboni P, et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options[J]. Curr Neuropharmacol, 2009, 7: 65.

[13]Damme M, Suntio T, Saftig P, et al. Autophagy in neuronal cells: general principles and physiological and pathological functions[J]. Acta Neuropathol, 2015, 129: 337.

[14]Nah J, Yuan JY, Jung YK. Autophagy in neurodegenerative diseases: from mechanism to therapeutic approach[J]. Mol Cells, 2015, 38: 381.

[15]Xilouri M, Stefanis L. Autophagic pathways in Parkinson disease and related disorders[J]. Expert Rev Mol Med, 2011, 13: e8.

[16]Ghavami S, Shojaei S, Yeganeh B, et al. Autophagy and apoptosis dysfunction in neurodegenerative disorders[J]. Prog Neurobiol, 2014, 112: 24.

[17]Radad K, Moldzio R, Al-Shraim M, et al. Recent advances in autophagy-based neuroprotection[J]. Expert Rev Neurother, 2015, 15: 195.

[18]Keane H, Ryan BJ, Jackson B, et al. Protein-protein interaction networks identify targets which rescue the MPP+cellular model of Parkinson’s disease[J]. Sci Rep, 2015, 5: 17004.

[19]Cai ZL, Shi JJ, Yang YP, et al. MPP+impairs autophagic clearance of alpha-synuclein by impairing the activity of dynein[J]. Neuroreport, 2009, 20: 569.

[20]Jhamandas JH, Wie MB, Harris K, et al. Fucoidan inhibits cellular and neurotoxic effects of beta-amyloid(A beta)in rat cholinergic basal forebrain neurons[J]. Eur J Neurosci, 2005, 21: 2649.

[21]Zhang FL, He Y, Zheng Y, et al. Therapeutic effects of fucoidan in 6-Hydroxydopamine-Lesioned rat model of parkinson’s disease: role of NADPH oxidase-1[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20: 1036.

[22]Cui YQ, Jia YJ, Zhang T, et al. Fucoidan protects against Lipopolysaccharide-Induced rat neuronal damage and inhibits the production of proinflammatory mediators in primary microglia[J]. CNS Neurosci Ther, 2012, 18: 827.

Effect of fucoidan on introcelleral oxidative stress and Cathepsin D-Apoptosis associated protein Bax of the 1-methyl-4-phenylpyridinium intoxicated MN9D cell model

LIANGZhi-gang,SUNXu-wen,LIMin,etal.

DepartmentofNeurology,YuhuangdingHospital,Yantai264000,China

Objective To explore the effect of fucoidan(FUC) introcelleral oxidative stress and Cathepsin D-Apoptosis(CatD) associated protein Bax of the 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+) intoxicated MN9D cell model. Methods PD cell model was established by MN9D cells model which damaged by 100 mol/L MPP+. The cell viability of PD cell model was observed after FUC pretreatment. The inhibitory rate of superoxide dismutase(SOD) and glutathione reductase (GSH) were measured by fluorescence detection. The expression of Bax, CatD and microtubule-associated protein light chain3(LC3-Ⅱ) were measured by western blot.Results Compared with MPP+group, the cell viability were significantly increased than those after 1×10-6, 10-5, 10-4mol/L FUC pretreatment(allP<0.01). Compared with control group, the inhibitory rate of SOD and GSH in MPP+group were significantly decreased(allP<0.05). Compared with MPP+group, the inhibitory rate of SOD and GSH in FUC pretreatment group and SEL pretreatment group were significantly higher(allP<0.01). There was no significant difference in inhibitory rate of SOD and GSH between FUC pretreatment group and SEL pretreatment group. The expression of CatD, LC3-Ⅱ and Bax protein in MPP+group were significantly increased than those in control group(allP<0.001). The expression of CatD, LC3-Ⅱ and Bax protein in FUC pretreatment group, SEL pretreatment group and CatD inhibitor group were significantly decreased than those in MPP+group(allP<0.001). There was no significant difference of expression of CatD, LC3-Ⅱand Bax protein between FUC pretreatment group, SEL pretreatment group and CatD inhibitor group. Conclusions FUC has protective effect on PD cell model. The mechanism are protecting cell lysosomes, inhibiting expression of CatD-Bax, reducing oxidative stress and inhibiting apoptosis.

fucoidan;MN9D cells;1-methyl-4-phenylpyridinium;oxidation stress;apoptosis

煙臺市科技發(fā)展項目資助(2012077)

264000青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(梁志剛，孫旭文，李敏，竇連偉，陶曼麗)；首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究院(王曉民)

R539

A

1004-1648(2017)04-0285-05

2016-04-13

2016-08-13)