尹利君 陳 路 劉 鈺 蒙蘭蘭 方秀玲 藍鳴生 吳無畏*

1. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；2. 桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541004

廣西大果山楂葉提取物對大鼠的長期毒性初步研究

尹利君1陳 路1劉 鈺1蒙蘭蘭2方秀玲2藍鳴生1吳無畏1*

1. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；2. 桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541004

目的：研究廣西大果山楂葉提取物對大鼠的長期毒性影響。方法：將大果山楂葉提取物以20 g/(kg·d)劑量(臨床推薦劑量的133倍)給雄性大鼠連續(xù)灌胃30d，每天觀察大鼠外觀行為情況、記錄體重和攝食量，30d后解剖大鼠，測定血液學和血生化指標、計算臟器指數(shù)并對主要臟器進行病理組織學檢查。結(jié)果：給藥組動物的外觀行為、體重、臟器系數(shù)，與正常對照組比較均無統(tǒng)計學差異，血液學和生化學個別指標有統(tǒng)計學差異，但均在正常參考值范圍內(nèi)，主要臟器未見明顯的異常。結(jié)論：大果山楂葉提取物樣品對雄性大鼠無明顯毒性作用，臨床推薦劑量是安全的。

大果山楂；毒性；血液學；血清生化；臟器指數(shù)；病理組織學

大果山楂又叫山楂(廣西)、澀梨、古蟬子、鳥嬋子(廣西苗語)，麻缺頓、墨雞屯(廣西壯族)，撒多、撒兩比(臺灣)，廣西楂(商品名)，為薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.的成熟果實[1]。臺灣林檎果實在廣西、廣東、貴州、云南等南方地區(qū)作為山楂使用已久，其味甘、酸、澀，性微溫，具有理氣健脾，消食導滯之功效；臺灣林檎葉味甘甜、微芬芳，性平，具有開胃、消滯、去濕的功效，在廣西、湖南、廣東、云南等南方地區(qū)作為代用茶飲料廣泛長期使用。廣西大果山楂及其葉收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》第二卷[2]。有研究報道廣西大果山楂具有降血壓、降血脂、保肝、抑菌、抗氧化等作用[3-4]。金雪萍等[5]對林檎葉提取物的小鼠急性毒性實驗進行了研究，潘瑩等[6]對大果山楂總黃酮的小鼠急性毒性進行了研究，但廣西大果山楂葉提取物對大鼠的安全性評價的研究尚未見有報道。本實驗參考國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導原則》[7]、《輔助降血脂功能評價方法》[8]等相關(guān)規(guī)定，將大果山楂葉提取物以20g/(kg·d)(為臨床推薦劑量的133倍[2])劑量給大鼠連續(xù)灌胃30d，觀察其對大鼠的毒性影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 藥物 大果山楂葉購自于廣西柳江縣，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園保育中心農(nóng)新東助理研究員鑒定為薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.的成熟葉片。

1.3 儀器 日本奧林巴斯AU400全自動生化儀；西森美康XT1800i全自動血球計數(shù)儀；德國徠卡DM6000B顯微鏡。

1.4 大果山楂葉提取物提取方法 首先采用70%乙醇提取，然后水提醇沉，最后將70%醇提濃縮液與水提醇沉濃縮液混合均勻，置于托盤中80℃以下,純水浴蒸發(fā)到足夠濃度(每g浸膏相當于藥材大于2.0g)，裝入大口具塞瓶中，冷藏備用，臨用前用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度。

1.5 分組及給藥 將20只大鼠隨機分為兩組，每組10只，即正常對照組和山楂提取物高劑量組(生藥濃度為20g/kg)，山楂組每天按照10mL/kg灌胃給藥1次，正常對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃30d，末次給藥后24h，動物采用5%水合氯醛按照0.4mL/100g劑量腹腔注射麻醉，解剖取血，檢測各項指標。

1.6 檢測項目

1.6.1 一般檢查 每周稱量體重1次，每天記錄采食情況，觀察動物毛發(fā)、排泄物、精神狀態(tài)、行為狀態(tài)。

1.6.2 血液學檢查 取EDTA抗凝的大鼠腹主動脈血，用全自動血球計數(shù)儀檢測大鼠白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞容積(HCT)、血小板計數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板比容(PCT)、 紅細胞平均體積(MCV)、 紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、淋巴細胞百分比(LYMPH%)、 單核細胞百分數(shù)(MONO%)、 嗜酸性粒細胞百分比(EO%)。

1.6.3 血清生化學檢查 大鼠腹主動脈取血，2500rpm/min，離心15min，取血清，全自動生化分析儀檢測大鼠葡萄糖( Glu) 、肌酐( Cr)、尿素氮( BUN) 、總蛋白( TP) 、白蛋白( ALB) 、谷丙轉(zhuǎn)氨酶( ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇( TCHO) 等指標。

1.6.4 臟器指數(shù)及病理組織學檢查 大鼠麻醉放血后解剖，對主要臟器進行全面檢查并稱重，按照下列公式計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。對肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸、睪丸等組織進行病理組織學檢查。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 給藥期間，所有大鼠全部存活，與正常組相比，大鼠毛色、精神狀態(tài)、呼吸、行為活動、飲食、排泄等均未見異常。

2.2 大果山楂葉提取物對大鼠體重和攝食量的影響 給藥前2周，大鼠體重增長緩慢，較正常對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，隨著時間延長，體重逐漸增長，給藥3周、4周后，體重與正常組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。隨著時間延長，給藥組攝食量明顯大于正常組(P<0.05)，表明山楂葉提取物給藥3周后可增加大鼠的食欲。見表2。

組別起始體重第1周第2周第3周第4周正常對照組183.30±6.95240.40±7.96290.70±15.25327.20±21.80354.80±26.02山楂葉提取物組185.40±5.27226.00±13.04**275.50±13.84*307.70±20.02351.10±25.36

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別例數(shù)第1周第2周第3周第4周正常對照組1023.81±0.7224.89±0.7723.56±0.7623.41±0.96山楂葉提取物組1018.73±3.81*24.93±2.1625.03±1.20*26.39±1.47**

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 大果山楂葉提取物對大鼠血液學指標的影響 大果山楂葉提取物可以增加淋巴細胞百分比(LYMPH%)(P<0.05)，降低中性粒細胞百分比(NEUT%)(P<0.05)。但是均在正常參考值范圍內(nèi)，不屬于藥物引起的病理變化，可能是由于大鼠之間的個體差異導致，以上指標兩組之間有統(tǒng)計學差異。其余指標較正常對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

參數(shù)正常對照組山楂葉提取物組實驗室參考值范圍WBC/×109/L7.19±1.397.49±2.517～11RBC/×1012/L8.49±0.488.80±0.657～9HGB/g/L157.11±5.84164.22±1.46120～170HCT/%47.96±1.8550.93±3.3543～58

續(xù)表3

參數(shù)正常對照組山楂葉提取物組實驗室參考值范圍PLT/×109/L982.44±117.48983.78±251.78800～1100MPV/fL7.18±0.217.31±0.246.9～7.6PCT/%0.71±0.090.72±0.180.52～0.84MCV/fL56.58±1.7457.91±2.3853～58MCH/pg18.53±0.6118.68±0.8117～20MCHC/g/L327.67±2.83322.67±5.52317～335NEUT%/%23.14±7.0614.17±4.76**7.9～31.6LYMPH%/%75.13±7.8183.91±5.89*65～91MONO%/%1.01±0.870.98±1.210～2.3EO%/%0.71±0.250.94±0.640.4～1.1

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 大果山楂葉提取物對大鼠血清生化學指標的影響 大果山楂葉提取物可以升高大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量(P<0.05)，降低BUN 尿素氮、膽固醇(TCHO)的含量(P<0.05)，但是各項指標值均在正常參考值范圍內(nèi)，不屬于藥物引起的病理變化，可能是由于大鼠之間的個體差異導致以上指標兩組之間有統(tǒng)計學差異。大果山楂葉提取物對血糖無影響(P>0.05)。見表4。

參數(shù)正常對照組山楂葉提取物組本實驗室參考值范圍ALT/U/L50.59±8.9869.68±12.2**39～79AST/U/L111.82±10.02131.2±18.26**103～185BUN/mmol/L5.57±0.784.78±0.90*4.3～10Cr/umol/L25.1±1.9327.08±2.19*17.7～70.8Glu/mmol/L6.79±0.456.64±0.644.04～7.52TP/g/L71.82±3.2074.98±3.20*70.4～91.2ALB/g/L40.68±1.5443.45±1.85**31.5～41.9TCHO/mmol/L1.44±0.181.19±0.218**0.85～2.12TG/mmol/L0.97±0.480.89±0.160.53～1.15

注：與正常組對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 大果山楂葉提取物對大鼠臟器指數(shù)的影響 大果山楂葉提取物可提高肝指數(shù)(P<0.05)，但給藥組肝指數(shù)在正常范圍內(nèi)，不屬于藥物引起的病理變化。腎指數(shù)、脾指數(shù)、睪丸指數(shù)相比較正常對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表5。

組別肝指數(shù)腎指數(shù)脾指數(shù)睪丸指數(shù)正常對照組2.59±0.340.73±0.040.21±0.190.92±0.07山楂葉提取物組2.92±0.27*0.74±0.080.14±0.020.93±0.10

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

2.6 病理組織學檢查 正常對照組和山楂葉提取物組大鼠大體解剖檢查結(jié)果均未見明顯異常，主要臟器鏡檢結(jié)果示：肝臟被膜結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清楚，肝細胞索排列整齊，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，毛細膽管及小葉間膽管未見增生、壞死，無膽汁淤積或單栓形成，未見纖維組織增生及假小葉形成。腎臟被膜結(jié)構(gòu)正常，腎小球均勻分布，其毛細血管內(nèi)皮細胞及及間質(zhì)細胞未見增生纖維化。脾臟被膜結(jié)構(gòu)正常，無纖維組織增生，及炎細胞浸潤。脾小梁結(jié)構(gòu)正常，脾小結(jié)散在均勻分布，內(nèi)見有結(jié)構(gòu)正常的中央動脈，紅髓區(qū)淋巴細胞索網(wǎng)狀分布，血竇隙及小血管無擴張淤血。胃、腸道黏膜未見糜爛、潰瘍、增生、萎縮、出血及水腫，均可見黏膜層少量炎細胞浸潤。睪丸白膜完整，組織結(jié)構(gòu)正常?？梢娗毦埽鈬票〉幕啄?，內(nèi)襯以精原細胞，并可見初級精母細胞及次級精母細胞，大量成熟精子，初級精母細胞之間可見柱狀之支持細胞。睪丸間質(zhì)未見炎細胞浸潤，未見萎縮及精子成熟障礙。如圖1所示。

綜合上述,病理觀察結(jié)果顯示，主要臟器未見異常，表明大果山楂葉提取物對上述臟器組織無損害作用。

3 討論

大果山楂是為薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎Malusdoumeri(Boris) chev. 的干燥成熟果實。其果實、葉與普通的北山楂不同，有研究報道北山楂果實和葉具有降血脂的效果，與山楂果實和葉當中含有的黃酮類物質(zhì)有關(guān)[9-10]。有研究報道大果山楂中黃酮含量是普通北山楂的2倍[11-12]，因此大果山楂在開發(fā)降血脂藥物和保健品這方面很有研究價值。此前，金雪萍等[5]對林檎葉提取物的小鼠急性毒性實驗進行了研究，潘瑩等[6]對大果山楂總黃酮的小鼠急性毒性進行了研究，但是目前為止大果山楂葉提取物對大鼠的毒性實驗研究尚未見有報道。為開發(fā)基于廣西大果山楂葉提取物在治療高血脂癥方面的保健品，本研究根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《輔助降血脂功能評價方法》[8]要求，首先研究大果山楂葉提取物對雄性SD大鼠的長期毒性。結(jié)果顯示，將大果山楂葉提取物以20g/(kg·d)(為臨床推薦劑量的133倍)劑量給雄性大鼠連續(xù)灌胃30d，給藥期間，實驗組動物的外觀行為、體重、臟器系數(shù)，與正常對照組比較均無統(tǒng)計學差異，血液學和血清生化學個別指標有差異但均在正常參考值范圍內(nèi)，主要臟器未見異常，表明該樣品臨床推薦劑量是安全的，為后續(xù)大果山楂葉的保健品開發(fā)提供了依據(jù)。

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The Long-term Toxicity of the Extract ofMalusDoumeri(Bois) Chev. Leaves from Guangxi in Rat

YIN Lijun1CHEN Lu1Liu Yu1MENG Lanlan2FANG Xiuling2LAN Mingsheng1WU Wuwei1*

1. Guangxi Botanic Garden of Medical Plants, Nanning 530023, China;2. Guilin Medical University, Guilin 541004, China

Objective To investigate the long-term toxicity of the leaf extract of Malus Doumeri(Bois) Chev.(LEM) from Guangxi in rat. Methods The rats were

orally in dose of 20g/kg/d(133 times the clinical recommended dose) for 30 days, where normal controls were treated orally with distilled water. The body weight, behavior and food intake were recorded daily. All rats were sacrificed after 30 days and biochemical and hematological analyses, as well as macro-and microscopic observations of several organs were performed. Results Compared with the normal control group, the body weight, behavior and food intake in LEM-treated rats groups showed no obvious differences. Some hematological and biochemical indexes of experiment rats showed statistically difference from control rats, but all within the normal reference range. Major organs of two groups of rats were similar and showed no obvious abnormalities. Conclusion In summary, the leaf extract of Malus Doumeri(Bois) Chev.(LEM) samples showed no obvious toxicity on rats, the clinical recommended dose is safe.

Malus Doumeri(Bois) Chev.;Toxicity;Hematology;Serum biochemistry;Organ Index;Histopathology

廣西特聘專家專項經(jīng)費；廣西科技計劃項目(桂科AD16380013)。

尹利君，女，碩士研究生，研究實習員，研究方向為中草藥抗病毒。E-mail: 734292146@qq.com

吳無畏，男，博士研究生，副研究員，研究方向為中草藥抗病毒。E-mail: wuweiwu2013@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)15-0062-04

2017-05-26 編輯：陶希睿)