張志斌 ，高偉 ，史源 ，2，3，陳靜 ，2，3，鄭虹 ，2，3，沈中陽 ，2，3（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，天津 30092；2.天津市器官移植重點實驗室，天津 30092；3.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室，天津30092）

肝病是我國人群高發(fā)疾病之一，肝病患者基數(shù)龐大，肝移植目前已經(jīng)成為治療終末期肝病的唯一有效手段。但隨著肝臟移植患者數(shù)量的不斷增加，供體短缺問題越來越嚴重，已成為世界性難題。美國器官分配網(wǎng)絡(luò)（United Network for Organ Sharing，UNOS）及歐洲肝臟移植注冊登記系統(tǒng)顯示，約有20%的患者在等待移植過程中死亡［1-2］。中國肝移植注冊系統(tǒng)（China Liver Transplant Registion，CLTR） 統(tǒng)計顯示，我國每年因肝病死亡的患者數(shù)量約為50萬，供體缺乏是制約肝移植發(fā)展的最主要問題之一，如何擴大供體來源是目前亟需解決的問題。

劈離式肝移植是基于肝臟奎諾功能性分段的理論，將完整的供肝分割成2個或2個以上的解剖功能單位分別移植給不同受者，達到“一肝兩受”或“一肝多受”，是擴大供體來源的主要手術(shù)方式之一［3］。理論上講，86%的供肝可用于劈離式肝移植手術(shù)，而我國只有0.4%的供肝用于劈離式肝移植手術(shù)。隨著技術(shù)的不斷進步，長期隨訪結(jié)果顯示，劈離式肝移植與尸體全肝移植存活率差異無統(tǒng)計學意義［4］。積極開展劈離式肝移植手術(shù)，必然可使有限的供體資源得到充分的利用。1988年，Pichlmayr等［3］首次報道了劈離式肝移植手術(shù)，隨后這一術(shù)式在歐洲、美洲、亞洲的各大移植中心相繼開展，并且取得了與全肝移植相似的生存效果［5］。與尸體全肝移植相比，劈離式肝移植供肝體外劈離過程延長了供肝冷保存時間，加重了缺血/再灌注損傷，研究表明，供肝的冷熱缺血時間嚴重影響肝移植的預后，冷缺血時間過長與移植物原發(fā)無功和術(shù)后膽道并發(fā)癥直接相關(guān)，且冷缺血時間會對肝再生產(chǎn)生影響［6］。美國UNOS數(shù)據(jù)顯示，缺血時間大于6小時與小于6小時差異有統(tǒng)計學意義［7］。而小體積移植肝損傷所致小肝綜合征的主要原因為供肝缺血/再灌注損傷以及供肝體積偏小所致移植術(shù)后門靜脈超灌注以及肝臟再生功能降低。

本研究利用體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）的原理，構(gòu)建自己的常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）體系，并通過對巴馬小型豬肝臟灌注保存過程中進行劈離，驗證其效果及穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及方法：健康巴馬小型豬4只，雌雄不限，12個月齡以上，體重30～35 kg，由解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2 供肝切取手術(shù)：麻醉后將小型豬取仰臥位固定于手術(shù)臺上，取上腹部正中縱行切口，長度30～35 cm，上端達劍突水平，逐層切開皮膚、皮下組織及腹白線入腹，放置腹腔自動拉鉤，充分暴露手術(shù)野。以電刀游離切斷肝鐮狀韌帶、肝胃韌帶、左三角韌帶、右三角韌帶以及下腔靜脈與后腹壁之間的韌帶。解剖肝十二指腸韌帶，于肝十二指腸韌帶下緣以電刀切開其表面腹膜，游離、切斷膽總管，近肝側(cè)插入膽管引流管。切斷結(jié)扎肝十二指腸韌帶內(nèi)的神經(jīng)結(jié)締組織，解剖出肝動脈及門靜脈，向近心端游離肝動脈至腹主動脈根部，游離門靜脈至脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處。向下游離下腔靜脈達腎靜脈水平。切除膽囊。經(jīng)頸靜脈快速補液，經(jīng)頸動脈采血約1 000 ml備用。向肝動脈、門靜脈近肝端分別插入肝動脈、門靜脈灌注管路，然后常溫下迅速離斷肝動脈、門靜脈、肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈，快速切取肝臟，連接NMP裝置開始灌注保存。NMP保存液的成分見表1。

1.3 NMP保存裝置的連接及運行：NMP裝置連接示意圖見圖1，實物圖見圖2。開始灌注之前，灌注管路內(nèi)用灌注保存液預充，排除管路中的氣泡，調(diào)節(jié)數(shù)顯控溫水浴箱溫度在40～42℃之間。肝臟切取之后快速連接灌注管路開始進行NMP，氧氣流量控制在1～2 L/min，通過蠕動泵和限流閥調(diào)節(jié)門靜脈灌注壓力在8～10 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），肝動脈灌注壓力在80～100 mmHg。以微量注射泵持續(xù)向灌注液中泵入肝素1 000 U/h，胰島素6～10 U/h，每小時向灌注液中加入5%葡萄糖10 ml及復合氨基酸10 ml，根據(jù)灌注液中葡萄糖水平調(diào)節(jié)胰島素及葡萄糖用量。每小時監(jiān)測血氣及電解質(zhì)水平，根據(jù)結(jié)果調(diào)節(jié)酸堿平衡及電解質(zhì)紊亂。在劈離過程中，監(jiān)測門靜脈、肝動脈流量及壓力，通過調(diào)整總的灌注流量及壓力比例調(diào)節(jié)器以保證門靜脈、肝動脈壓力維持穩(wěn)定。

表1 NMP保存液的成分

圖1 NMP裝置連接示意圖（箭頭方向代表血流方向）

1.4 供肝NMP過程中劈離（圖3）：將肝臟平鋪于灌注容器內(nèi)，暴露肝臟膈面、肝上下腔靜脈。沿肝正中裂劈離。沿切開線用刀片銳性切開肝包膜，依次結(jié)扎管道組織，門靜脈左外側(cè)支采用粗線結(jié)扎，直至斷面剩下肝左靜脈，門脈鉗子鉗夾肝左靜脈起始部，于鉗子左側(cè)切斷肝左靜脈，移除左半肝，5-0 Prolene線連續(xù)縫合。5-0 Prolene線繼續(xù)縫合肝臟斷面撕裂小血管處，采用雙極電凝對肝組織止血。仔細檢查劈離面，確保無滲血、膽瘺。

圖2 NMP裝置

圖3 供肝常溫機械灌注過程中劈離

1.5 觀察指標及方法：通過壓力傳感器、溫度傳感器和多導生理記錄儀測量灌注期間門靜脈和肝動脈的壓力以及肝臟保存溫度（圖4），通過超聲血流儀測量門靜脈和肝動脈的血流量（圖5）；分別于供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后取保存液檢測pH值、PO2、乳酸、HCO3-、Na+、K+等血氣及電解質(zhì)指標，檢測采用GEM Premier 3 000血氣電解質(zhì)分析儀進行；記錄供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后每小時膽汁分泌量；分別于供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后取灌注液檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase， AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、乳酸等生化指標，評價肝臟損傷程度及功能，檢測方法采用常規(guī)生化學方法，由天津市第一中心醫(yī)院檢驗科使用LWC-320全自動生化分析儀協(xié)助完成；肝組織常規(guī)病理檢查：分別于NMP保存前及保存后劈離前、劈離后取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定，經(jīng)組織脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色等步驟，進行閱片。

圖4 壓力和溫度監(jiān)測

圖5 門靜脈和肝動脈血流量監(jiān)測

1.5 統(tǒng)計分析：使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組樣本均數(shù)比較使用t檢驗及方差分析。計數(shù)資料比較使用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 保存劈離期間門靜脈和肝動脈的壓力和流量及保存溫度（表2）：供肝灌注保存劈離期間持續(xù)監(jiān)測門靜脈和肝動脈的壓力和流量及肝臟保存溫度發(fā)現(xiàn)，隨著劈離的進行，門靜脈壓力升高但仍控制在8.75～9.75 mmHg，肝動脈壓力變化不明顯，維持在92.00～92.75 mmHg；在劈離過程中，隨著調(diào)整后總灌注流量的降低，門靜脈及肝動脈流量均降低，門靜脈流量從劈離前的（455.00±107.55） mmHg降至劈離后的（392.50±125.27）mmHg，肝動脈流量從劈離前的（180.75±59.46）mmHg降至劈離后的（126.25±6.99）mmHg；肝臟保存溫度劈離前相對較低（37.45±0.33）℃，隨著劈離的進行，持續(xù)的加溫，穩(wěn)定控制在38.83～38.93℃。

2.2 保存劈離期間的血氣及電解質(zhì)等指標變化（表3）：劈離前，保存液的pH值（7.24±0.10）較基礎(chǔ)值（7.50±0.08）降低，隨著劈離的進行，pH值逐漸升高，劈離結(jié)束后pH值（7.60±0.13）略高于基礎(chǔ)值；PO2在保存劈離過程中相對穩(wěn)定，維持在482.25～521.00 mmHg，較基礎(chǔ)值明顯增高；HCO3-劈 離 前（10.10±5.04） mmol/L較 基 礎(chǔ) 值（24.05±0.31）mmol/L明顯降低，隨著劈離的進行，HCO3-逐漸升高（16.15±13.22 mmol/L），劈離結(jié)束后，HCO3-為（14.55±13.14）mmol/L；Na+在保存劈離過程中相對穩(wěn)定；K+在保存劈離過程中逐漸升高，從基礎(chǔ)值（3.45±0.33）mmol/L升高至劈離結(jié)束后的（4.98±1.12）mmol/L；乳酸在劈離前（2.86±1.77） mmol/L較基礎(chǔ)值（3.85±2.58） mmol/L有所降低，隨著劈離的進行直到劈離結(jié)束后，乳酸逐漸升高至（6.00±3.73）mmol/L。

2.3 每小時膽汁分泌量（表4）：經(jīng)膽管引流管引流膽汁，分別記錄供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后的膽汁量，記錄每小時膽汁分泌量。保存劈離期間隨著劈離的進行，膽汁分泌量逐漸減少，劈離前（16.75±3.30）ml/h，劈離中（10.55±1.83） ml/h，劈離后（6.53±1.33） ml/h。

2.4 保存劈離期間灌注液ALT、AST、LDH、ALP等生化指標（表4）：灌注保存的開始，ALT處于較基礎(chǔ)值 （48.93±12.40） U/L的低水平（17.40±7.47）U/L，隨著劈離的進行，ALT水平逐漸增高，劈離結(jié)束后ALT維持在（70.48±22.41） U/L；AST在灌注保存開始時的水平（89.28±56.59） U/L和基礎(chǔ)值（74.10±30.30） U/L接近，隨著劈離的進行，AST水平逐漸增高，劈離中（444.55±258.03）U/L，劈離后（647.50±221.89） U/L；LDH與ALT的變化趨勢相似，基礎(chǔ)值維持在（452.04±115.52）U/L，劈離前、劈離中、劈離后分別為（149.13±52.89）U/L、（361.75±142.70）U/L、（493.98±110.62）U/L。ALP在劈離前（14.80±4.05） U/L處于較基礎(chǔ)值的低水平（62.00±14.69） U/L，在劈離進行的過程中，ALP始終維持在一個較低的水平，劈離中（17.33±3.95）U/L，劈離后（14.85±2.61） U/L。

2.5 肝組織常規(guī)病理檢查：NMP保存前和保存劈離后分別取肝組織。光鏡下見保存劈離后肝組織匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，未見粒細胞、淋巴細胞浸潤（圖6a），肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝竇內(nèi)無淤血及血栓形成，肝細胞無明顯空泡變性及壞死（圖6b）。與保存前比較（圖6c、圖6d），NMP保存劈離后肝組織細胞結(jié)構(gòu)無明顯改變。

表2 NMP保存劈離期間的壓力、流量和溫度變化（±s）

表2 NMP保存劈離期間的壓力、流量和溫度變化（±s）

時間 門靜脈壓力（mmHg） 肝動脈壓力（mmHg） 流量（ml/min） 溫度（℃）門靜脈 肝動脈基礎(chǔ)值 - - 507.5±189.98 180.75±54.45 -劈離前 8.75±0.96 92.75±6.60 455.00±107.55 180.75±59.46 37.45±0.33劈離中 9.25±0.96 92.00±9.09 432.5±113.25 111.75±17.91 38.93±0.43劈離后 9.75±0.50 92.25±9.32 392.5±125.27 126.25±6.99 38.83±0.24

表3 NMP保存劈離期間保存液的血氣、電解質(zhì)等指標變化（±s）

表3 NMP保存劈離期間保存液的血氣、電解質(zhì)等指標變化（±s）

時間 pH 值 Lac（mol/L） PO2（mmHg） HCO3-（mol/L） Na+（mol/L） K+（mol/L）基礎(chǔ)值 7.50±0.08 3.85±2.58 304.00± 78.11 24.05± 0.31 142.75± 1.89 3.45±0.33劈離前 7.24±0.10 2.86±1.77 507.5 ± 20.68 10.10± 5.04 142.75±12.01 4.25±1.10劈離中 7.53±0.08 4.35±2.78 482.25±158.55 16.15±13.22 145.75± 8.26 4.45±0.89劈離后 7.60±0.13 6.00±3.73 521.00± 8.08 14.55±13.14 149.25±10.94 4.98±1.12

表4 NMP期間每小時膽汁分泌量和保存液的生化指標變化（±s）

表4 NMP期間每小時膽汁分泌量和保存液的生化指標變化（±s）

注：ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；LDH為乳酸脫氫酶；ALP為堿性磷酸酶；NMP為常溫機械灌注

時間 膽汁分泌量（ml/h） ALT（U/L） AST（U/L） LDH（U/L） ALP（U/L）基礎(chǔ)值 19.00±4.55 48.93±12.40 74.10± 30.30 452.04±115.52 62.00±14.69劈離前 16.75±3.30 17.40± 7.47 89.28± 56.59 149.13± 52.89 14.80± 4.05劈離中 10.55±1.83 51.35±26.73 444.55±258.03 361.75±142.70 17.33± 3.95劈離后 6.53±1.33 70.48±22.41 647.50±221.89 493.98±110.62 14.85± 2.61

圖6 NMP保存前及保存劈離后肝臟組織結(jié)構(gòu)正常a為保存劈離后匯管區(qū)結(jié)構(gòu)；b為保存劈離后肝細胞結(jié)構(gòu)；c為NMP保存前匯管區(qū)結(jié)構(gòu)；d.NMP保存前肝細胞結(jié)構(gòu)（HE 低倍放大）

3 討 論

肝臟移植已經(jīng)成為治療終末期肝病的唯一方式。然而，隨著這項技術(shù)的在該領(lǐng)域的日趨成熟與完善，可獲得的供體數(shù)量無法趕上日益增長的受體數(shù)量。為了克服逐漸增長的不平衡，移植中心通過各種方法擴大供肝池，其中包括劈離式肝移植。Nesher等［8］認為與活體肝移植相比，劈離式肝移植膽管及血管并發(fā)癥的發(fā)生率較相對較低，而且劈離式肝移植另一個優(yōu)點是排除了同活體肝移植相關(guān)的潛在的供體并發(fā)癥和死亡風險。劈離式肝移植分體外劈離和體內(nèi)劈離［9］。體內(nèi)劈離同體外劈離相比，具有如下優(yōu)勢：① 減少冷缺血時間；② 更好地辨認膽管和血管組織，確切處理肝斷面，減少斷面出血及膽瘺的發(fā)生；③ 同體外劈離相比減少復溫時的損傷［8］；④ 可觀察肝臟劈離后各肝段的血液供應及回流，以便更合理地分配供肝血管；⑤ 劈離過程中斷面止血徹底，當在受體體內(nèi)再灌注后減少劈離斷面的出血［5］。在NMP下劈離模擬體內(nèi)劈離的方式，可以充分發(fā)揮體內(nèi)劈離的優(yōu)勢。

3.1 NMP保存下劈離灌注液的配置：NMP的灌注液可分為含血液成分和不含血液成分的灌注液，前者又可分為全血和經(jīng)稀釋后的血液。共同點為都具有極好的運輸氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)的能力，并且具有適當?shù)哪z體滲透壓能夠阻止機械灌注期間間質(zhì)水腫的進展［10］。多數(shù)動物實驗采用全血或稀釋的血液為灌注液。Butler等［11］研究表明，用全血作為機械灌注液灌注狗的肝臟72小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有明顯的肝臟損傷。Xu等［12］在豬的DCD肝臟模型中使用的灌注液共2 000 ml，其中包含全血、血漿、激素、胰島素、抗菌藥物及肝素，但該研究并未提及營養(yǎng)物質(zhì)，保肝藥物及其他一些必需物質(zhì)的添加。Fondevila等［10］在研究中同樣使用豬的自體血，另外加入了甘露醇、碳酸氫鈉、萬汶和乳酸林格液。另外，Perk等［13］在大鼠的DCD肝臟模型中使用了與Fondevila等［10］類似的灌注液，不同的是灌注液中添加了L-谷氨酰胺。然而，在既往研究中并沒有完整地提到在生理狀態(tài)下肝臟所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)、各種物質(zhì)所占的比例以及確切的用量。Op den Dries等［14］在臨床研究中，首次明確提出了灌注液所需的主要成分以及各種成分在灌注液中所占的比例，包括滿足一個正常肝臟代謝所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和保護性物質(zhì)，這是一個突破性的進展。究竟哪一種灌注液的效果更佳，目前尚無定論，在既往多數(shù)研究中，血液被廣泛應用以達到攜帶氧氣的目的，同時在灌注過程中可以在灌注液中加入必要的營養(yǎng)物質(zhì)（糖、氨基酸）、促進膽汁排泄、預防血栓形成及抗感染等相關(guān)藥物。

本研究中參考既往的文獻報道，將血液稀釋后（全血800 ml+0.9氯化鈉注射液750 ml），加入抗菌藥物 （注射用頭孢呋辛鈉1.5 g）、水溶性維生素1支、10%氯化鈣注射液20 ml、肝素鈉注射液5 000 U、10%氯化鉀注射液10 ml、胰島素10 U、地塞米松10 mg、5%碳酸氫鈉注射液20 ml、前列地爾注射液10 μg，注射用還原型谷胱甘肽鈉600 mg，配制成灌注保存液，并在灌注保存過程中持續(xù)泵入肝素（12 500 U+50 ml 0.9氯化鈉注射液，4 ml/h）、胰島素（100單位胰島素+ 47.5 ml 0.9氯化鈉注射液，6～10 U/h，3～5 ml/h），每小時加入10%葡萄糖注射液5 ml和氨基酸5 ml等營養(yǎng)底物。在灌注劈離過程中，實時根據(jù)血氣分析結(jié)果，調(diào)整保存液中的電解質(zhì)濃度和酸堿平衡。對豬肝進行體外常溫機械灌注保存過程中劈離，肝臟持續(xù)有膽汁分泌，隨著劈離的進展，有功能肝細胞的減少，膽汁每小時分泌量逐漸減少。病理提示肝組織匯管區(qū)及肝細胞結(jié)構(gòu)正常，無明顯水腫、壞死，取得了良好的保存效果。

3.2 劈離過程中參數(shù)的控制：NMP時灌注壓力應該為生理壓力，但是目前的文獻對常溫機械灌注時門靜脈和肝動脈的灌注壓力報道各不相同，波動較大，肝動脈灌注壓力選擇在40～100 mmHg，門靜脈的灌注壓力選擇在5.0～29.5 mmHg；而對常溫機械灌注時的肝動脈流量及門靜脈流量的控制波動也較大，肝動脈流量一般控制在100～400 ml/min，門靜脈流量一般控制在 250 ～ 1 750 ml/min［10，14-21］。Gravante等［16］的研究認為，灌注的速度應該根據(jù)即時獲得的動靜脈血氣結(jié)果調(diào)整，灌注應該通過調(diào)節(jié)泵的速度及改變灌注管路的阻力來維持生理狀態(tài)下動脈、靜脈的流量及壓力。op den Dries等［14］的研究認為在灌注過程中，應當通過調(diào)整流經(jīng)肝臟的血流，從而維持恒定的壓力（即變動的流量，恒定的壓力）同Brockmann等［22］的研究結(jié)果一致。

我們通過測量生理狀態(tài)下巴馬小型豬供體的門靜脈和肝動脈的流量，并根據(jù)既往實驗NMP對DCD供肝修復的實驗研究經(jīng)驗，門靜脈灌注壓力控制在8～10 mmHg，肝動脈灌注壓力控制在80～100 mmHg，門靜脈流量控制在（455±107.5）ml/min，肝動脈流量控制在（180.75±59.5）ml/min。在劈離過程中，隨著血管的離斷，門靜脈壓力會逐漸升高，我們通過減小總的灌注流量及調(diào)整壓力比例調(diào)節(jié)器來保證門靜脈壓力的穩(wěn)定，劈離結(jié)束后門靜脈流量控制在（392.5±125.3）ml/min。而在此過程中，肝動脈壓力及流量變化不明顯，取得了良好的保存效果。豬的正常體溫為38.7～39.7℃，劈離前，肝臟保存溫度僅為（37.45±0.33）℃，在實驗初始階段，我們考慮同灌注液加溫時間短，灌注液溫度未能達到豬的正常體溫有關(guān)，但在我們將灌注液溫度維持在豬的正常體溫后開始灌注，肝臟保存溫度仍低于正常。最終考慮同肝臟離體后，整個肝臟溫度下降（雖然離體時間較短，一般小于5分鐘）有關(guān)，即使灌注液溫度正常，但低于正常體溫的肝臟最終使整個灌注液溫度下降，導致肝臟保存溫度的下降。若在灌注前將灌注液溫度升高至正常體溫以上（以減少開始灌注后低于正常體溫的肝臟對灌注液造成的溫度下降），則可能對肝臟造成一定程度的損傷。因此，實驗中仍堅持灌注前灌注液溫度維持在正常體溫之內(nèi)，雖然劈離前灌注液溫度低于正常，但肝臟灌注后，保存溫度逐漸升高直至正常，在整個劈離過程中及劈離后，肝臟保存溫度維持穩(wěn)定。

NMP劈離過程中定時監(jiān)測血氣分析。整個過程中Na+基本保持穩(wěn)定；pH值和HCO3-變化趨勢相似，劈離前均低于基礎(chǔ)值，通過在灌注液中加入5%碳酸氫鈉注射液，HCO3-逐漸升高，pH值也逐漸接近生理范圍，甚至在劈離后高于基礎(chǔ)值，但HCO3-始終未達到基礎(chǔ)值水平。乳酸在劈離過程中呈緩慢上升趨勢，考慮同肝臟代謝過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，而整個灌注系統(tǒng)沒有血液透析系統(tǒng)，無法清除代謝產(chǎn)物有關(guān)，這可能是HCO3-始終未達到基礎(chǔ)值水平的另一個原因。K+在灌注劈離期間也呈逐漸升高趨勢，考慮與劈離期間肝細胞破壞，細胞內(nèi)鉀釋放，整個灌注系統(tǒng)沒有血液透析系統(tǒng)，無法清除有關(guān)。高鉀血癥導致細胞內(nèi)H+和細胞外K+交換增加，導致灌注液中H+增多，這可能是HCO3-始終維持在低水平的另一個原因。Ca2+灌注開始劈離前一過性降低，通過添加葡萄糖酸鈣注射液，將其逐漸穩(wěn)定在基礎(chǔ)值水平；PO2在劈離過程中通過持續(xù)給予1～2 L/min的氧氣而保持基本穩(wěn)定。

3.3 NMP下劈離保存效果的評價：肝臟血流動力學的穩(wěn)定和良好的肝臟微循環(huán)狀態(tài)密切相關(guān)。本研究所構(gòu)建的NMP保存系統(tǒng)，在進行肝臟劈離保存期間，門靜脈和肝動脈的壓力自始至終均十分恒定，隨著劈離過程的結(jié)束，逐漸減少總流量以保證壓力的穩(wěn)定，因為肝動脈的流量所占總流量比重較小，所以變化不明顯。這說明在常溫條件下，選擇適當?shù)膲毫M行門靜脈以及肝動脈的雙重灌注，對肝臟的微循環(huán)沒有明顯的損傷。

膽汁形成是一個極其復雜的肝臟細胞內(nèi)物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化和膽管系統(tǒng)排泌的過程，膽汁的分泌和引流情況是反映肝臟、膽道功能的重要指標，因此常用來衡量和觀察NMP保存系統(tǒng)的效果［23］。既往研究報道，膽汁分泌量能夠評價肝功能［24］，肝移植后大鼠膽汁分泌量的多少是評價移植肝臟術(shù)后肝功能的一個重要指標，膽汁分泌量的減少可能預示著肝功能的損害［25］。因此，在NMP保存下劈離的研究中觀察膽汁的分泌量是評價劈離過程中肝臟功能的重要指標之一。在本實驗中自體外灌注開始，肝臟膽汁分泌的速度比較恒定，隨時劈離的進行，分泌膽汁的有效肝細胞數(shù)量逐漸減少，膽汁量逐漸下降至穩(wěn)定值，膽汁的持續(xù)分泌較直觀地反映了劈離過程中供肝的生理活性和功能狀態(tài)。

肝細胞或線粒體膜損傷的時候會引起血液中許多有關(guān)肝臟酶學的變化。在肝細胞中，ALT主要存在于非線粒體中，而約80%的AST存在于線粒體內(nèi)。當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT與AST釋放入血漿，使血清ALT與AST的酶活性升高，在中等程度肝細胞損傷是，ALT漏出率遠大于AST，但在嚴重肝細胞損傷時，線粒體膜亦損傷，可導致線粒體內(nèi)AST的釋放，血清中AST/ALT升高。一部分LDH也存在于肝臟組織中，肝細胞損傷時LDH水平也會明顯升高。ALP主要分布在肝臟中，膽道疾病時可能由于ALP生成增加而排泄減少，引起血清中ALP升高。本研究在肝臟NMP保存下劈離期間，分段取灌注液檢測上述酶學指標，發(fā)現(xiàn)在灌注開始時ALT、LDH、ALP出現(xiàn)一定程度的下降，考慮與血液稀釋有關(guān)，與Xu等［12］的研究結(jié)果一致。隨著劈離的進行直至劈離結(jié)束，ALT、LDH逐漸升高，可能與劈離過程對肝組織造成損傷，細胞內(nèi)酶大量釋放入血有關(guān)；而ALP則持續(xù)維持在低水平，表明在灌注劈離過程中膽道引流通暢，無膽道梗阻出現(xiàn)；但AST水平在劈離前沒有明顯降低，隨著劈離的進行直至劈離結(jié)束，AST水平逐漸升高，也考慮同劈離過程對肝組織造成的嚴重損傷有關(guān)。

肝組織病理學檢查是從形態(tài)學上評價肝臟損傷的客觀指標。本研究在NMP保存劈離后留取肝臟組織行常規(guī)病理檢查。與保存前相比，NMP保存劈離后常規(guī)病理示肝臟組織結(jié)構(gòu)正常、匯管區(qū)正常，肝竇內(nèi)無淤血、血栓形成，小葉中央靜脈內(nèi)無血栓形成，肝竇、血管內(nèi)皮細胞、匯管區(qū)內(nèi)無粒細胞及淋巴細胞浸潤。常規(guī)病理在形態(tài)學上提示本研究構(gòu)建的NMP裝置用于肝臟保存劈離期間，未造成明顯肝細胞損傷。本研究構(gòu)建的NMP裝置可用于供體肝臟保存下劈離，而且保存劈離期間對保存的肝臟無明顯的損傷。