胡文娟, 方 天, 陳 莉, 劉 彪, 梁 磊, 許龍祥, 惲?xí)r峰

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 全軍實(shí)驗(yàn)動物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地, 南京 210002)

綠色熒光裸小鼠動情周期的觀察

胡文娟, 方 天, 陳 莉, 劉 彪, 梁 磊, 許龍祥, 惲?xí)r峰

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 全軍實(shí)驗(yàn)動物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地, 南京 210002)

目的 觀察綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)動情周期的變化。方法 采用陰道涂片法，連續(xù)15 d，分別對40只性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)進(jìn)行陰道涂片觀察，計(jì)算規(guī)律動情周期發(fā)生率，記錄動情周期各階段陰道涂片特征及持續(xù)天數(shù)，作比較分析。 結(jié)果 綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的規(guī)律動情周期發(fā)生率分別為77.5%和82.5%，明顯低于BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的90%及95%; 綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情周期總持續(xù)時(shí)間為7～8 d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的持續(xù)時(shí)間為5～6 d (P＜0.05)，其中綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期、動情期、動情后期持續(xù)時(shí)間與普通BALB/c裸小鼠的持續(xù)時(shí)間相差較大(P＜0.05)。結(jié)論 通過陰道涂片法可以確認(rèn)綠色熒光裸小鼠所處的動情周期階段，為后期在不同的動情周期內(nèi)研究雌性綠色熒光小鼠生殖功能提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。

綠色熒光; 動情周期; 陰道涂片; 生殖功能

綠色熒光蛋白(GFP)現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一。綠色熒光裸小鼠是將GFP基因?qū)隑ALB/c 裸小鼠而得來[1]。本科室自建立綠色熒光轉(zhuǎn)基因裸鼠以來，對該品系鼠進(jìn)行了多項(xiàng)研究，測定了主要的生理生化指標(biāo)及部分免疫學(xué)指標(biāo), 檢測了主要臟器質(zhì)量和臟器系數(shù),并研究了在主要組織中熒光蛋白的分布特點(diǎn)[2-5]。在日常繁育中，觀察到綠色熒光裸小鼠繁殖性能較為低下，對雄性綠色熒光裸小鼠研究顯示，該品系雄性小鼠精子質(zhì)量低下可能導(dǎo)致了繁殖性能的下降[6]。作者推測GFP基因可能對雌性小鼠的生理功能也產(chǎn)生影響。因在實(shí)際生產(chǎn)操作中，大多采用雄性純合子(GFP nu/nu)與雌性雜合子(GFP nu/+)交配，故本實(shí)驗(yàn)連續(xù)15 d對性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非 GFP nu/nu)及 BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)分別進(jìn)行陰道涂片觀察，以確定雌性綠色熒光裸小鼠的規(guī)律動情周期[7](動情前期、動情期、動情后期、動情間期)發(fā)生率以及動情周期各階段的陰道涂片特征及持續(xù)天數(shù)，為后期在不同動情周期內(nèi)研究GFP是否對綠色熒光裸小鼠生殖功能產(chǎn)生影響，提高實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、器材與試劑

分別取未生育的8～10周齡SPF級雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)各40只，綠色熒光裸小鼠及雜合子為本科室提供[SCXK(軍)2012-0014]，BALB/c裸小鼠及雜合子購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司[SCXK(蘇)2011-0003]。四組動物均在SPF級設(shè)施飼養(yǎng)[SYXK(軍）2012-0047]。光學(xué)顯微鏡、載玻片、醫(yī)用棉簽、生理鹽水。

1.2 方法

將40只雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠分別編號，于每日清晨8∶00～8∶30檢測小鼠動情周期。用左手食指和拇指捏住小鼠尾，余下三指輕輕按壓小鼠后腰背部，將其固定在操作臺上，翻起尾暴露陰道口，用浸潤了生理鹽水的醫(yī)用消毒棉簽緩緩插入小鼠陰道內(nèi)0.5～1 cm，轉(zhuǎn)動2～3周，蘸取脫落細(xì)胞，并將其均勻涂在載玻片上[8]。對涂片采用美蘭染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞，記錄小鼠動情周期變化情況。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法判斷動情周期各個(gè)階段：動情前期陰道脫落細(xì)胞以體積較大的有核上皮細(xì)胞為主；動情期陰道涂片多為無核的角化上皮細(xì)胞，像落葉一樣堆積在一起; 動情后期兼有白細(xì)胞，有核上皮細(xì)胞與無核角化細(xì)胞，三種細(xì)胞數(shù)量無明顯差別; 動情間期以白細(xì)胞為主。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算規(guī)律動情周期發(fā)生率(%)=(發(fā)生規(guī)律動情周期的小鼠數(shù)/總實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù))×100%[10]; 采用SPSS 軟件對記錄的動情周期變化維持時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x-± s表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 規(guī)律動情周期發(fā)生率

實(shí)驗(yàn)表明，31只綠色熒光裸小鼠出現(xiàn)規(guī)律的動情周期，9只并未出現(xiàn)動情周期或動情周期極為不規(guī)律，即綠色熒光裸小鼠的規(guī)律動情周期發(fā)生率為77.5%(31/40)。綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的規(guī)律動情周期發(fā)生率分別為 82.5%(33/40)、90.0%(36/40)和 95.0%(38/40)

2.2 動情周期脫落細(xì)胞觀察

鏡下觀察顯示，綠色熒光裸小鼠的動情周期脫落細(xì)胞情況與其他幾組小鼠并無明顯差異，故只附上綠色熒光裸小鼠的鏡下照片以供觀察。動情前期： 陰道分泌物中大多為膨大的有核上皮細(xì)胞，呈橢圓形，白細(xì)胞較少(圖1A); 動情期： 多為無核的角化上皮細(xì)胞，外形不規(guī)則，成堆聚集在一起呈落葉狀(圖1B); 動情后期： 白細(xì)胞開始增多，有核上皮細(xì)胞及無核角化上皮細(xì)胞均可見(圖1C); 動情間期： 以白細(xì)胞為主，偶見一些有核上皮細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)較少(圖1D)。

2.3 動情周期各階段

綠色熒光裸小鼠動情周期持續(xù)時(shí)間為(186.27±22.72) h, 其余3組小鼠的持續(xù)時(shí)間分別為(184.49±14.12) h、(131.12±18.87) h(P＜0.05)和(133.95±20.04) h(P＜0.05)。四組小鼠各階段所占時(shí)間見表1綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期動情期和動情后期持續(xù)時(shí)間與BALB/c裸小鼠存在明顯差異(P＜0.05); BALB/c雜合小鼠與BALB/c裸小鼠在動情周期中并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

表 1 四組小鼠動情周期各階段持續(xù)時(shí)間 h

研究GFP基因?qū)π∈笊彻δ艿挠绊懀私鈩忧橹芷谑莻€(gè)關(guān)鍵問題之一。因此，確定雌性綠色熒光小鼠所處動情周期的階段及各階段所持續(xù)的時(shí)間，可提高后期實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，使研究更為科學(xué)可靠。陰道涂片法是目前常用的動情周期判定方法之一，常見的3種細(xì)胞分別為角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞以及白細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)易區(qū)分[11]，所以采用此法判斷動情周期簡易實(shí)用。

本實(shí)驗(yàn)連續(xù)15 d分別對40只性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠分別進(jìn)行陰道涂片觀察, 結(jié)果顯示, 雌性綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的規(guī)律動情周期的發(fā)生率分別為77.5%和82.5%，明顯低于對BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的規(guī)律動情周期發(fā)生率(90.0%和95.0%)。出現(xiàn)規(guī)律動情周期的綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠，其動情周期總持續(xù)時(shí)間為7～8d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的持續(xù)時(shí)間為5～6 d (P＜0.05), 其中綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期、動情期、動情后期持續(xù)時(shí)間與普通BALB/c裸小鼠的持續(xù)時(shí)間相差較大(P＜0.05)，而動情間期持續(xù)時(shí)間無明顯差異。本文綠色熒光裸小鼠的動情周期與李娟等[12]對BALB/c小鼠動情周期觀察結(jié)果比較也存在較為明顯差異。

圖1 綠色熒光小鼠陰道涂片脫落細(xì)胞

研究表明[13]，在動情間期，雌激素含量低，孕酮含量高; 在動情前期，雌激素分泌開始增加，但是對陰道上皮的刺激作用仍然很低; 動情期，雌激素水平達(dá)到闕值; 動情后期是動情期向動情間期的過渡。雌性小鼠生殖周期的變化主要通過丘腦下部、垂體前葉和卵巢分泌的激素進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過陰道脫落細(xì)胞涂片法觀察動物動情周期的變化能夠合理地反映卵巢活性及其分泌性激素的能力。動情周期的紊亂是反應(yīng)性激素代謝失調(diào)的敏感指標(biāo)[14]。GFP基因可能對小鼠的激素調(diào)控基因表達(dá)方面造成影響，從而改變了雌性綠色熒光裸小鼠的激素水平，使激素代謝失調(diào)可能導(dǎo)致動情周期的變化，為確認(rèn)此推測，后續(xù)將進(jìn)一步研究雌性綠色熒光裸小鼠的生殖功能，包括臟器系數(shù)、激素水平等。

本實(shí)驗(yàn)通過陰道涂片法對雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的規(guī)律動情周期發(fā)生率以及動情周期各階段的陰道涂片特征及持續(xù)天數(shù)進(jìn)行了觀察，為后期在不同的動情周期內(nèi)研究雌性綠色熒光裸小鼠生殖功能提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性; 進(jìn)一步找出綠色熒光裸小鼠繁殖性能下降的原因，也有助于將綠色熒光裸小鼠更好、更為廣泛地運(yùn)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0300-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.009

2017-02-09

胡文娟(1990-), 女, 技師, 本科, 從事熒光裸小鼠的育種與科研。E-mail： 452665670@qq.com

惲?xí)r鋒(1965-), 男, 教授, 從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)專業(yè)。E-mail： yunshifeng1@163.com