金 璐, 李 燕, 李志操, 吳西軍, 周艷華, 何志旭, 舒莉萍,3,4

(貴州醫(yī)科大學 1. 組織工程和干細胞實驗中心; 2. 兒童醫(yī)學中心;3. 基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室; 4. 實驗動物中心, 貴陽550004)

·第十六屆中國西部實驗動物管理與學術(shù)研討會論文專題

Irx5a 基因過表達對斑馬魚胚胎早期造血的影響

金 璐1,2, 李 燕2, 李志操1,2, 吳西軍1, 周艷華1, 何志旭1,2, 舒莉萍1,3,4

(貴州醫(yī)科大學 1. 組織工程和干細胞實驗中心; 2. 兒童醫(yī)學中心;3. 基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室; 4. 實驗動物中心, 貴陽550004)

目的 探討易洛魁族同源盒5a(Irx5a)基因?qū)Π唏R魚胚胎早期造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響。方法 于斑馬魚胚胎1細胞受精卵期，顯微注射Irx5a-EGFP mRNA斑馬魚胚胎作為實驗組、顯微注射增強型綠色熒光蛋白(EGFP) mRNA斑馬魚胚胎作為實驗對照組、野生型斑馬魚作為空白對照組，應用qPCR檢測相關(guān)造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在斑馬魚胚胎受精后9 h (9 hpf)、12 h、18 h、24 h和30 h時相的表達水平。結(jié)果 實時熒光定量PCR結(jié)果表明, 在原始造血轉(zhuǎn)錄因子lmo2、scl中, 實驗組從9 hpf～24 hpf較另外兩組間明顯減低; 在定向造血轉(zhuǎn)錄因子中，c-myb實驗組從12 hpf～24 hpf較另外兩組間明顯減低，runx1實驗組從9 hpf～30 hpf較另外兩組間明顯減低; 髓系造血轉(zhuǎn)錄因子pu.1和紅系造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子gata-1實驗組從9 hpf～30 hpf較另外兩組間明顯減低，且差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 Irx5a基因在斑馬魚原始造血、成體造血、紅系造血、髓系造血的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中發(fā)揮著抑制作用。

斑馬魚; 5a(Irx5a); 造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)屬多能干細胞，是存在于造血組織中的一群原始造血細胞，具有高度的自我更新、多向分化以及損傷后修復的能力，HSC的自我更新是由促進生長的正調(diào)控信號和導致凋亡的負調(diào)控信號之間的平衡來實現(xiàn)調(diào)控的。HSC以一個細胞分裂成兩個細胞時，其中一個細胞仍然保持干細胞的一切生物特性，而另一個細胞則進一步分化成為各類成熟血細胞[1]。造血干細胞在發(fā)育過程中的不同階段，其各系中有特異的造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如原始造血相關(guān)因子lmo2和scl; 定向造血相關(guān)因子c-myb和runx1; 紅系造血相關(guān)因子gata-1; 髓系造血相關(guān)因子pu.1等[2]。

易洛魁族同源盒(iroquois homebox, Irx)基因最早在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[3,4]，該基因編碼一個含高度保守同源盒序列的三氨基酸環(huán)延伸(thre amino acid, TALE)超家族蛋白。在哺乳動物中由A、B兩個基因簇組成的6個Irx基因，IrxA位于13號染色體，含有Irx1、Irx2和Irx4，IrxB位于8號染色體，含有Irx3、Irx5和Irx6。在斑馬魚中含有11個Irx基因4個基因簇，IrxAa (Irx1a, 2a 4a), IrxAb(Irx1b, 4b), IrxBa(Irx3a, 5a, 6a), and IrxB(Irx3b, 5b),另外還有Irx7，其中的Irx5a與高等的脊椎動物IrxB基因簇有著類似的功能[5-7]。例如在小鼠中IrxB基因的缺失可以引起腎母細胞瘤腫瘤細胞分化而導致腎母細胞瘤，在人類前列腺癌細胞中Irx5基因的下調(diào)可使細胞周期停止，凋亡細胞增加[8,9]。故本研究以Irx5a為研究對象，探討其對早期造血發(fā)育中相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所需野生型斑馬魚Tüebingen由本實驗室繁殖培育, 養(yǎng)殖條件： 28±2 ℃，用帶有過濾系統(tǒng)的循環(huán)水系統(tǒng)進行養(yǎng)殖，光照12 h/d。予豐年蟲早晚各喂食1次，雌雄魚分缸飼養(yǎng)，待斑馬魚發(fā)育至性成熟，按雌雄1∶2的比例配對，在次日0.5h后收集胚胎，對受精卵進行清洗后，移入斑馬魚受精卵培養(yǎng)用水(egg water)中并置于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)斑馬魚生長發(fā)育圖譜以了解斑馬魚胚胎發(fā)育不同時相。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol reagent (Ambion 15596026)，iQTM SYBR?Green super(Bio-Rad 1708882AP)，F(xiàn)irst strand cDNA synthesis(Fermentas MBIK1612)，KOD plus(Toyobo Kod-201)，無水乙醇(分析純，中國上海振興化工一廠)，氯仿(分析純，中國汕頭市西隴化工廠)，德國Eppendorf AG22331梯度PCR儀，德國Eppendorf低溫離心機，美國紫外分光光度儀(UV1700), 美國凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad), 美國Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR儀，上海生化培養(yǎng)箱(LRH系列，一恒科技有限公司)，中國北京愛生科技斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)。

1.3 Irx5a過表達模型的建立

將Irx5a-增強型綠色熒光蛋白(EGFP)正義mRNA經(jīng)顯微注射導入1～2細胞期的野生型斑馬魚Tüebingen胚胎中作為實驗組; 將EGFP正義mRNA經(jīng)顯微注射導入1～2細胞期的野生型斑馬魚Tüebingen胚胎中作為實驗對照組; 未進行任何處理的野生型斑馬魚作為空白對照組。注射后的胚胎均置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)液并挑出死胚胎，防止影響其他胚胎的發(fā)育。經(jīng)顯微注射后的胚胎在體視鏡下觀察胚胎發(fā)育時相，選取所需時相，并于熒光顯微鏡下篩選具有特異性綠色熒光蛋白表達的胚胎，按照斑馬魚形態(tài)發(fā)育圖譜辨認其發(fā)育過程，并收集實驗所需的時相。

1.4 提取斑馬魚胚胎RNA及制備cDNA

分別收集三個實驗組受精后不同時相(9 h、12 h、18 h、24 h、30 h)的胚胎, 每個時相20枚放于無酶Epp管中, PBS清洗一次后加150 μL Trizol液于室溫放置5 min, 每1 mL Trizol液加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s并室溫放置2～3 min, 12 000 g離心15 min (4 ℃), 將上清(約60%)轉(zhuǎn)移至新的無酶Epp管中, 加入等體積的異丙醇上下顛倒10次并靜置冰上10 min, 12 000×g再次離心15 min (4 ℃), 棄上清可見白色沉淀附于管壁, 加入1 mL的體積分數(shù)75%乙醇-DEPC-treated water洗滌沉淀并7 500 g×5 min (4 ℃)后棄上清, 室溫放置5～10 min使乙醇揮發(fā)后每管加入10 μL無酶水溶解RNA并用紫外分光光度計檢測其純度。最后將上述所得的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,從而得到斑馬魚不同時相的cDNA, 在-20℃中保存。

1.5 引物設(shè)計及合成

從GenBank中獲取下表斑馬魚基因的cDNA序列，應用Primer Express軟件，根據(jù)SYBR Green染料法的引物設(shè)計原則，在各自保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，以β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因。造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子： 原始造血lmo2、scl，成體造血c-myb、runx1，紅系造血gata-1，髓系造血pu.1作為目的基因，引物序列(表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.6 實時熒光定量PCR

在上述所得cDNA中分別加入SYBR和各轉(zhuǎn)錄因子引物, 95 ℃預變性3 min, 95℃變性10s, 55.8 ℃退火/延伸30 s, 39個循環(huán)。溶解曲線： 每5 s升高0.5 ℃，從55 ℃到95 ℃。以GAPDH、β-actin作為內(nèi)參基因，對lmo2、scl、C-myb、Runx1、Gata-1、Pu.1進行相對定量分析。利用Bio-Rad CFX manager 2.0軟件分析相對表達值，用內(nèi)參基因做標準，進行分析比較,最后通過SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

斑馬魚GAPDH、β-actin、lmo2、scl、C-myb、Runx1、Gata-1、Pu.1基因的溶解曲線均為單峰曲線，說明所擴增的目的基因引物設(shè)計良好，在使用所選擇的最適溫度時，無非特異性產(chǎn)物生成; 并且擴增曲線光滑、連續(xù)，多次重復，結(jié)果較好。

2.1 Imo2在不同組各時相中的變化

受精后9 h～24 h(9 hpf～24 hpf )中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降，lmo2在實驗組9 hpf有少量表達，12 hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降，30 hpf后基本無表達(P＜0.05，表2)。

2.2 Scl在不同組各時相中的變化

9 hpf～24 hpf 中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降，scl在實驗組9 hpf已有所表達，12hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降，30 hpf后基本無表達(P＜0.05，表3)。

2.3 C-myb在不同組各時相中的變化

12 hpf～24 hpf 中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降，c-myb在實驗組9 hpf少量表達，以后逐漸增加，18 hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降(P＜0.05，表4)。

表 1 實時熒光定量PCR引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 The sequences of primers and products length of qPCR

表 2 lmo2在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 2 Expression of lmo2 in the mRNA of Irx5a (n=3)

表 3 scl在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 3 Expression of scl in the mRNA of Irx5a (n=3)

表 4 c-myb在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 4 Expression of c-myb in the mRNA of Irx5a (n=3)

2.4 Runx1在不同組各時相中的變化

9 hpf～30 hpf 中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降, runx1在實驗組9 hpf少量表達，在9 hpf已有所表達，12 hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降，30 hpf后基本無表達(P＜0.05, 表5)。

2.5 Gata-1在不同組各時相中的變化

9 hpf～30 hpf 中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降，gata-1在mRNA實驗組9 hpf少量表達，18 hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降，30hpf后明顯減少(P＜0.05，表6)。

表 5 runx1在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 5 Expression of runx1 in the mRNA of Irx5a (n=3)

表 6 gata-1在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 6 Expression of gata-1 in the mRNA of Irx5a (n=3)

2.6 Pu.1在不同組各時相中的變化

9 hpf～30 hpf 中實驗組較另外兩組的相對表達量均下降，pu.1在實驗組9 hpf已有所表達，12 hpf表達量最高，隨著時相的增加逐漸下降，30 hpf后表達量明顯下降(P＜0.05，表7)。因組序列已全部被測出，其中有80多個與哺乳動物造血相關(guān)的基因，如scl、lmo2、gata-l和c-myb等[10]。斑馬魚的造血發(fā)育與人類有著許多相似之處，造血發(fā)育同樣具有原始造血(primitive hematopoiesis)和定向造血(definitive hematopoiesis)，

表 7 pu.1在Irx5a基因mRNA的相對表達量 (n=3)Table 7 Expression of pu.1 in the mRNA of Irx5a (n=3)

3 討論

斑馬魚作為一種新興的動物模型是研究基因功能的有效載體，相比較于其他模式生物，其優(yōu)勢在于其生殖周期短、生殖能力強、高產(chǎn)卵量、體積小、發(fā)育快且胚胎透明，經(jīng)濟適用等優(yōu)點，并且斑馬魚基因與人類基因保守度約85%。斑馬魚基這兩個造血峰存在于所有脊椎動物，包括斑馬魚。不同的是斑馬魚的原始造血存在于兩個區(qū)域，第一個區(qū)域分為兩部分即前部側(cè)板中胚層(anterior lateral mesoderm，ALM)和后部側(cè)板中胚層(posterior lateral mesoderm，PLM)，它是某些髓系前體細胞及早期巨噬細胞起源的區(qū)域，叫作側(cè)板中胚層。第二個區(qū)域稱為中間細胞群(intermediate cell mass,ICM)，位于脊索和軀干中胚層之間，相當于哺乳動物卵黃囊，原始造血過程中的造血干細胞來自于ICM區(qū)[10,11]。在人類中Irx5基因定位于第16號染色體，而在斑馬魚中則有兩個子基因，其中Irx5a位于第7號染色體，Irx5b位于第25號染色體[12]。

本研究通過觀察實驗組，實驗對照組和空白對照組中各個造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的變化來探討Irx5a對斑馬魚早期造血的影響。對于原始造血發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子主要有l(wèi)mo2、scl、gata2、fli1a等。lmo2是具有LIM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在斑馬魚中l(wèi)mo2在10～11 hpf表達于ALM和PLM區(qū)，然后在ICM區(qū)域有所表達。Scl對于原始和定向造血及血管生成均發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與急性淋巴細胞白血病有著密切的關(guān)系[13-15]。從實驗結(jié)果中可以看出，原始造血lmo2和scl在過表達Irx5a 時對造血發(fā)育發(fā)揮著抑制作用。定向造血發(fā)育中發(fā)揮著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子主要有c-myb、runxl、cbfβ等，c-myb為myb原癌基因家族最早被鑒定成員之一，主要表達于不成熟血細胞，隨著血細胞不斷成熟分化而表達下降。runxl是runt家族成員之一, runt家族在多個發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用, 包括神經(jīng)發(fā)育、造血發(fā)育、骨發(fā)育及細胞分裂等, runxl在原始造血的成熟和定向造血的發(fā)育中均發(fā)揮著作用。從實驗結(jié)果中可以看出, c-myb和runxl均在過表達Irx5a基因時對造血發(fā)育發(fā)揮抑制作用[16,17]。gata-l通過與結(jié)合多個轉(zhuǎn)錄因子來產(chǎn)生效應, 在斑馬魚ICM區(qū)原始紅細胞和髓細胞間的平衡主要是通過gata-l和pu.1來調(diào)控的, gata-l的正常功能是部分限制細胞中pu.1的表達, 所以, gata-l不僅是促進紅系發(fā)育而且抑制髓細胞的表達[18]。實驗結(jié)果中可以證明gata-l和pu.1在紅系和髓系造血中發(fā)揮著相互抑制的作用。

綜上所述，過表達Irx5a基因可以下調(diào)造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，即Irx5a基因在斑馬魚原始造血、成體造血、紅系造血和髓系造血的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中發(fā)揮著抑制作用的。

[1] Huang X, Cho S, Spangrude GJ. Hematopoietic stem cells：generation and self-renewal[J]. Cell Death Differ, 2007, 14(11)：1851-1859.

[2] de Jong JL, Zon LI. Use of the zebrafish system to study primitive and definitive hematopoiesis[J]. Annu Rev Genet,2005, 39：481-501.

[3] Cavodeassi F, Modolell J, Gomez-Skarmeta JL. The Iroquoi family of genes： from body building to neural patterning[J]Development, 2001, 128(15)：2847-2855.

[4] Diez del Corral R, Aroca P, Gómez-Skarmeta JL, et al. Th Iroquois homeodomain proteins are required to specify bod wall identity in Drosophila[J]. Genes Dev, 1999, 13(13)1754-1761.

[5] Dildrop R, Ruther U. Organization of Iroquois genes in fis[J]. Dev Genes Evol, 2004, 214(6)：267-276.

[6] Gómez-Skarmeta JL, Modolell J. Iroquois genes： genomi organization and function in vertebrate neural developmen[J]. Curr Opin Genet Dev, 2002, 12(4)：403-408.

[7] Lecaudey V, Anselme I, Dildrop R, et al. Expression of th zebrafish Iroquois genes during early nervous system forma tion and patterning[J]. J Comp Neurol, 2005, 492(3)：289 302.

[8] Mengelbier LH, Karlsson J, Lindgren D, et al. Deletions of 16 in Wilms tumors localize to blastemal-anaplastic cells an are associated with reduced expression of the IRXB rena tubulogenesis gene cluster[J]. Am J Pathol, 2010, 177(5)2609-2621.

[9] Myrthue A, Rademacher BL, Pittsenbarger J, et al. Th iroquois homeobox gene 5 is regulated by 1,25 dihydroxyvitamin D3 in human prostate cancer and regu lates apoptosis and the cell cycle in LNCaP prostate cance cells[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(11)：3562-3570.

[10] Jing L, Zon LI. Zebrafish as a model for normal and malignan hematopoiesis[J]. Dis Model Mech, 2011, 4(4)：433-438.

[11] Chen AT, Zon LI. Zebrafish blood stem cells[J]. J Cel Biochem, 2009, 108(1)： 35-42.

[12] Kerner P, Ikmi A, Coen D, et al. Evolutionary history of th iroquois/Irx genes in metazoans[J]. BMC Evol Biol, 2009, 9 74.

[13] Davidson AJ, Zon LI. The 'definitive' (and 'primitive') guid to zebrafish hematopoiesis[J]. Oncogene, 2004, 23(43)： 7233 7246.

[14] Hsia N, Zon LI. Transcriptional regulation of hematopoieti stem cell development in zebrafish[J]. Exp Hematol, 2005, 3(9)：1007-1014.

[15] Paik EJ, Zon LI. Hematopoietic development in the zebrafis[J]. Int J Dev Biol, 2010, 54(6-7)：1127-1137.

[16] Gering M, Patient R. Hedgehog signaling is required for adul blood stem cell formation in zebrafish embryos[J]. Dev Cell 2005, 8(3)：389-400.

[17] Jin H, Xu J, Wen Z. Migratory path of definitive hematopoi etic stem/progenitor cells during zebrafish development[J]Blood, 2007, 109(12)：5208-5214.

[18] Rhodes J, Hagen A, Hsu K, et al. Interplay of pu.1 and gata determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafis[J]. Dev Cell, 2005, 8(1)：97-108.

Effects of Irx5a Gene Overexpression on Early Hematopoietic in Zebrafish Embryos

JIN Lu1,2, LI Yan2, LI Zhi-cao1,2, WU Xi-jun1, ZHOU Yan-hua1, HE Zhi-xu1,2, SHU Li-ping1,3,4
(1. Tissue Engineering and Stem Cell Research Center, 2. Deptartment of Pediatrics,3. Department of Immunology, 4. Laboratory Animal Center,Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Objective To investigate the expression and influence of early hematopoietic related genes in zebrafish embryos. Method The single-cell-stage zebrafish embryos were micro-injected with iroquois homebox 5a-enhanced green fluorescent protein (Irx5a-EGFP) mRNA as experimental group, EGFP mRNA as experimental control group, wild type zebrafish as blank control group. Comparised the hematopoietic transcript factor genes with three groups by quantificational reverse transcription-PCR (qPCR). Such as primitive hematopoiesis scl and lmo2, definitive hematopoiesis c-myb and runx1,erythroid hematopoiesis gata-1, myeloid hematopoiesis pu.1. The zebrafish embryos’ time point are 9 h、12 h、18 h、24 h、30 h post fertilization (pf). Results From the real-time fluorescence quantitative PCR can be seen in the original hematopoietic transcription factor lmo2 and scl, the experimental group from 9 hpf to 24 hpf significantly lower than the other two groups. In the targeted hematopoietic transcription factor, c-myb experimental group from 12 hpf to 24 hpf significantly lower than the other two groups, runx1 experimental group from 9 hpf to 30 hpf significantly lower than the other two groups. Myeloid hematopoietic transcription factor pu.1 and erythroid hematopoietic transcription factor gata-1, the experimental group from 9 hpf to 30 hpf were significantly lower than the other two groups. The differences were statistically significant. Conclusion Irx5a gene plays an inhibitory role in the transcriptional regulators of primitive hematopoiesis, adult hematopoiesis, erythroid hematopoiesis and myeloid hematopoiesis in the zebrafish.

Zebrafish; Iroquois homebox 5a(Irx5a); Hematopoietic transcription factor

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0309-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.011

2017-05-30

國家自然科學基金(31460312)

金 璐(1991-), 女, 臨床醫(yī)學碩士研究生, 貴州醫(yī)科大學組織工程和干細胞實驗中心,E-mail： 326687520@qq.com

舒莉萍, 教授。E-mail： gyslp-456@163.com

何志旭, 教授。 E-mail： hzx@gmc.edu.cn