蘭露莎, 趙兵兵, 楊紅宇, 羅 紅, 江 滟(貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心, 貴陽 550004)

氧化苦參堿對小鼠哮喘模型保護作用的初步研究

蘭露莎, 趙兵兵, 楊紅宇, 羅 紅, 江 滟(貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心, 貴陽 550004)

目的 初步探討氧化苦參堿(OMT)對哮喘小鼠的保護作用。方法 用Al(OH)3和卵清白蛋白誘發(fā)BALB/c小鼠過敏性哮喘，每日觀察小鼠一般情況和體質(zhì)量變化。哮喘模型建立后，予OMT或地塞米松進行治療，分別在治療后5 d、15 d處死部分小鼠，留存肺組織和支氣管肺泡灌洗液進行檢測。將留存的肺組織行HE染色觀察其病理變化，BALF預(yù)處理后瑞氏染色行細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)。結(jié)果 OMT介入可改善哮喘小鼠體質(zhì)量降低，在治療后5 d和15 d時，各治療組肺組織亦出現(xiàn)與哮喘模型組相似的病理變化，但炎性細胞或嗜酸細胞浸潤不同程度減少。OMT的各治療組與哮喘模型組比較，BALF中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)均降低(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論 氧化苦參堿對哮喘小鼠具有治療作用。

氧化苦參堿(OMT); 哮喘; 病理變化; 保護作用; 小鼠

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞, 包括炎性細胞、氣道結(jié)構(gòu)細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥[1]。反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑, 導(dǎo)致不可逆氣流受限，其原因與氣道慢性炎癥間接引起氣道壁結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，被稱為是哮喘的一個重要特征[2]。目前對于哮喘的治療仍以糖皮質(zhì)激素為主，但副作用較大。尚缺乏療效滿意且副作用小的抑制氣道炎癥及抗氣道高反應(yīng)性藥物[3]。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)又名苦參素，是從豆科屬植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來的生物堿。OMT具有調(diào)節(jié)免疫、抗病原體、抗炎性反應(yīng)等廣泛的藥理作用[4]，并被臨床證實具有一定的抑制氣道炎癥及抗氣道高反應(yīng)性作用，但機制不詳。因此，本文通過OMT對建立的小鼠哮喘模型的介入初步探討OMT防治支氣管哮喘的治療作用。為拓寬OMT在臨床治療哮喘疾病的應(yīng)用，以及開發(fā)該藥的新用途提供實驗室依據(jù)，并為進一步探明OMT的作用及其作用機制等提供良好的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，54只，4～6周齡，體質(zhì)量18～24 g，購自貴州省實驗動物工程中心[SCXK(黔)2012-001]，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)[SYXK(黔)2012-001]。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

質(zhì)量分數(shù)2% Al(HO)3凝膠佐劑(Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant)，購自美國InvivoGen公司，10 mg/mL(Cat. Code： vac-alu-250, Lot #5113,Expiry date, Mar. 2017); 卵清白蛋白(Albumin from chicken egg white, OVA)，購自美國Sigma公司,A5378-1G(Lot #SLBD2313V, PCode 1001988500,CAS 9006-59-1); 注射用地塞米松磷酸鈉，購自馬鞍山豐原制藥有限公司, 5 mg/支, 批號150512-1。用無菌蒸餾水溶解稀釋; 藥物： OMT，購自中國藥品生物檢定所，為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號110780-201007; 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，C0105; 瑞氏染液購自北京索萊寶公司，G8220。小動物屏障系統(tǒng)和IVC籠具(FRI-42)，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司; 醫(yī)用霧化器(402B)江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司; 倒置顯微鏡(CKX41)日本Olympus公司。

1.3 小鼠哮喘模型的建立

根據(jù)文獻[5]方法并予以改進建立哮喘模型： 實驗1 d、8 d、15 d腹腔注射OVA及Al(HO)3凝膠混合液 0.2 mL(內(nèi)含 OVA 60 μg 及 2.25 mg Al(HO)3凝膠)致敏; 實驗21 d開始用5% OVA溶液8 mL行超聲霧化，每次30 min, 連續(xù)霧化5 d進行激發(fā)。通過觀察小鼠是否出現(xiàn)煩躁、呼吸急促、抽搐及口唇紫紺等癥狀，支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)和肺組織病理變化情況，以驗證建模是否成功。

1.4 OMT治療哮喘小鼠的實驗分組

54只小鼠隨機分為6組，每組9只： ①正常對照組(CON), 用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化,不給藥; ②哮喘模型組(AST)，按上述方法進行致敏和激發(fā), 不給藥; ③治療對照組(TRE), 按上述方法進行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg); ④OMT高劑量組(OMT-H)、中劑量組(OMT-M)和低劑量組(OMT-L), 按上述方法進行致敏和激發(fā), 于每次激發(fā)前30 min分別腹腔注射OMT 25 mg/kg、12.5 mg/kg和6.25 mg/kg。于治療后5 d每組處死小鼠3只，同時①摘眼球取血并制備血清凍存于-20 ℃; ②從氣管注射無菌生理鹽水 0.5 mL入肺，抽吸3次后將抽出液體即BALF凍存于-20 ℃; ③稱小鼠體質(zhì)量并記錄; ④取右下肺葉置于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定; ⑤余下肺組織凍存于-80 ℃。各組小鼠不再激發(fā)，隔日給予相應(yīng)藥物1次，持續(xù)5次后，處死小鼠，留存標(biāo)本及相應(yīng)檢查同前。

1.5 BALF 細胞計數(shù)

取150 μL BALF細胞懸液與細胞計數(shù)液按1∶1稀釋混勻，顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)，余下BALF在4 ℃、以2 000 r/min離心10 min，取沉淀物涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察，每個標(biāo)本計數(shù)200個細胞，共觀察10個視野計數(shù)。

1.6 肺組織切片HE染色觀察

質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定24 h后的肺組織按常規(guī)病理學(xué)方法進行石蠟包埋、切片及HE 染色，顯微鏡下觀察并留存圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及體質(zhì)量觀察

每日觀察小鼠一般情況，并稱各組小鼠的體質(zhì)量。在致敏階段，各組小鼠一般情況均好，無明顯差別。開始激發(fā)后，AST、TRE、OMT-H OMT-M和OMT-L組小鼠均出現(xiàn)煩躁、精神萎靡進食減少、腹肌抽搐和口唇發(fā)紺等變化，各組間無明顯差異。AST組小鼠體質(zhì)量較CON組下降其他治療組小鼠體質(zhì)量介于二者之間(圖1)。

2.2 BALF 細胞計數(shù)

AST組小鼠在激發(fā)后5 d或15 d，BALF中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)較正常組都顯著增高(P＜0.01)。使用地塞米松或OMT的各治療組與AST組比較，BALF中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)均降低(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

2.3 肺組織切片HE染色觀察結(jié)果

HE染色片可見，CON 組氣管、肺組織中無明顯病理改變，肺泡、小血管、支氣管等結(jié)構(gòu)完整(圖2A); AST組肺組織中肺大泡形成，肺充血肺泡內(nèi)出現(xiàn)泡沫樣滲出物，間質(zhì)水腫，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤；肺組織中氣道上皮增厚管腔狹窄，肺間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤氣管壁和肺泡周圍無炎性浸潤(圖2B)。各治療組亦出現(xiàn)于AST組相似的病理變化，但炎性細胞或嗜酸細胞浸潤不同程度減少(圖2C、D、E和F)。

3 討論

哮喘是一種世界范圍的呼吸道常見疾病，近年來，哮喘的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢造成的社會負擔(dān)不斷增加[6]。已知哮喘是由多種細胞，包括炎性細胞、氣道結(jié)構(gòu)細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥[7]。哮喘會引起支氣管壁出現(xiàn)炎性增厚改變，肥大細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞的活性增加，使肺組織開始出現(xiàn)纖維化，肺泡和肺間質(zhì)就會隨著纖維化不斷受損，哮喘患者就會出現(xiàn)呼吸困難、心律失常等一系列呼吸衰竭癥狀,還會導(dǎo)致哮喘猝死、肺心病等病癥[8]。但是，關(guān)于哮喘確切的發(fā)病機理目前尚不清楚，目前的治療措施難以取得滿意效果。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

表 1 BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)(n=3) 109/L

圖2 OMT治療5 d哮喘小鼠肺組織病理觀察(HE×200)

苦參堿來源于豆科植物苦參等，藥理作用廣泛，尤其在哮喘病的應(yīng)用方面受到關(guān)注。OMT是豆科槐屬植物中提取的一種生物堿，其結(jié)構(gòu)中均具有四環(huán)的嗪啶。它是一類具有苦參次堿-15-酮化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有多方面的藥理活性[9-14]。本文研究結(jié)果表明，OMT能有效改善哮喘動物模型的一般情況, 對抗哮喘動物模型肺組織炎性細胞浸潤，肺組織炎性反應(yīng)得到明顯改善。這為OMT治療哮喘奠定了一定的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。OMT減輕肺組織炎癥反應(yīng)的機制，以及對抗氣道高反應(yīng)性和肺組織纖維化進行調(diào)節(jié)是我們需要進一步關(guān)注的問題。

[1] 陳欣, 林江濤. 我國支氣管哮喘防治現(xiàn)狀[J]. 內(nèi)科急危重癥雜志, 2008, 14(5)：225-226.

[2] 王美玲, 李國華. 支氣管哮喘氣道炎癥發(fā)生機制的研究進展[J]. 中外醫(yī)療, 2014(8)：190-191.

[3] 于國華, 張風(fēng), 孫洪光. 中醫(yī)藥治療哮喘病[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘： 電子版, 2013(16)：287-287.

[4] 吳琴, 高云. 氧化苦參堿藥理作用的分子機制研究進展[J].中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(6)：759-762.

[5] 羅琿, 徐湛, 孫大勇. BCG-CpG-DNA對支氣管哮喘小鼠肺組織STAT4、STAT6表達的影響[J]. 國際呼吸雜志,2015,35(5)：321-324.

[6] 成琳, 吳小萍, 李智君,等. 苦參堿空氣壓縮霧化治療兒童哮喘急性發(fā)作的療效觀察[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師： 醫(yī)學(xué)專業(yè)2011, 13(33)：61-61.

[7] 雷澤林, 劉曉菊, 馬建秀, 等. 苦參堿對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥和早期氣道重塑的影響[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志2009, 32(3)：165-170.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組. 支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2008, 31(3)：177-185.

[9] 黃美蓉, 王志強. 氧化苦參堿對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)和CD54、CD44的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(10)：2026.

[10] 焦霞, 沈其昀, 王利民, 等. 氧化苦參堿對哮喘小鼠的抗炎作用及對ICAM-1 mRNA表達的影[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2006, 27(1)：28-31.

[11] 侯偉, 劉海燕, 王愛榮. 氧化苦參堿對小鼠哮喘模型氣道炎癥及細胞因子的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報： 醫(yī)學(xué)版2004, 25(6)：587-589.

[12] 劉艷豐, 張平. 氧化苦參堿治療支氣管哮喘的研究進展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2015(3)：377-379.

[13] Zhang TZ, Qiang FU, Chen T, et al. Anti-asthmatic effects o oxymatrine in a mouse model of allergic asthma throug regulating CD40 signaling[J]. 中國天然藥物, 2015, 13(5)368-374.

[14] Hou W, Liu H Y, Yang X D, et al.Effect of oxymatrine on th distribution of dendritic cells in lung and spleen tissues o asthmatic mice[J]. Chin J Contemp Pediatr, 2011, 13(13)40-43.

The Protective Effect of Oxymatrine on Asthma Mice

LAN Lu-sha, ZHAO Bing-bing, YANG Hong-yu, LUO Hong, JIANG Yan
(Experimental Animal Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Objective To study the protective effect of Oxymatrine (OMT) on asthma mice.Methods The asthmatic BALB/c mice were induced by ovalbumin (OVA) and aluminium hydroxide.The general situations and weights of mice were observed every day. Then these mice were treated by using OMT and/or dexamethasone and were sacrificed at 5 or 15 days after treatment. The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue of mice were obtained. Their pathological reaction was observed through HE stain. The total number of cells and eosinophilscells in BALF were counted. Result OMT can improve the weights of asthma mice. On day 5 and 15, the pathological reactions of the lung tissue in each treatment groups were the same with that of the asthma group, but the number of inflammatory cells in lung tissue was much less than that of the asthma group. The total number of cells and eosinophils cells in BALF were reduced compared with the asthma group (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion OMT has protective effect on the asthma mice.

Oxymatrine(OMT); Asthma; Pathological changes; Protection; Mice

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0320-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.013

2017-05-30

貴州省科技廳省科技合作計劃項目(黔科合LH字[2016]7369)

蘭露莎(1984-), 女, 碩士研究生, 實驗師。E-mail： 1558809668@qq.com

江 滟(1976-), 女, 醫(yī)學(xué)博士, 教授, 從事病毒致病機制及抗病毒免疫相關(guān)研究。E-mail： jiangyan3313@sina.com