鄧 萌 郭 麗張 麗

（佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

·實驗報告·

參附注射液對心力衰竭大鼠氧化應激及細胞凋亡的影響*

鄧 萌 郭 麗△張 麗

（佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

目的 觀察參附注射液對心力衰竭大鼠氧化應激及細胞凋亡的影響并探討其機制。方法 將36只SD大鼠隨機分為假手術組（12只）、心衰模型組（12只）、參附治療組（12只），術后第4周開始給予參附治療組每日1次灌胃給藥［日劑量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。觀察評定左室舒張末徑（LVDS）、室收縮末徑（LVDd）、左室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）、血流動力學指標心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室壓變化速率最大值、心肌超氧化物歧化酶（SOD）含量、心肌丙二醛（MAD）含量及心肌目的蛋白質等的變化。結果 與假手術組比較，模型組LVDd、LVDS明顯增大，LVEF、FS明顯下降，BNP水平明顯升高（均P<0.05）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標均改善（均P<0.05）。與假手術組比較，模型組LVEDP明顯增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降（均P<0.01）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標均改善（均P<0.01）。與假手術組比較，心衰模型組心肌SOD活性明顯降低（P<0.01），給予參附注射液處理后，心肌SOD活性明顯高于心衰模型組（P<0.01）；心衰模型組 MDA含量明顯高于假手術組（P< 0.01），參附注射液處理后，MDA含量明顯低于心衰模型組（P<0.01）。Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax/Bcl-2的比值明顯降低（P<0.01）。SOD與Bcl-2/Bax線性相關性具有統(tǒng)計學意義（r=0.652，P<0.001），存在線性正相關關系；MDA與Bcl-2/Bax線性具有統(tǒng)計學意義（r=-0.644，P<0.001），存在線性負相關關系。結論 參附注射液可降低氧化應激水平，抑制蛋白凋亡，從而改善心衰大鼠心功能，其機制可能與上調凋亡抑制蛋白Bcl-2，下調促凋亡蛋白Bax的表達有關。

心力衰竭 參附注射液 氧化應激 細胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病的終末階段，近年來發(fā)病率居高不下。其發(fā)病機制是近年來研究熱點。而其藥物干預治療研究更為臨床提供了理論依據(jù)。有研究顯示，參附注射液可顯著地將氧自由基去除、使脂質的過氧化水平受到限制、降低血小板聚集、擴張冠狀動脈、使心肌細胞的耗氧量下降，并抑制大鼠心肌細胞凋亡、降低大鼠心肌細胞凋亡率，從而保護心?。?-2］。參附注射液影響CHF的發(fā)生、發(fā)展的機制，目前尚未完全闡明，與一些相關危險因素的關系還存在著不同的看法，有待于進一步深入研究。本實驗是通過測定心力衰竭大鼠氧化應激水平及細胞凋亡蛋白表達的變化，探討心力衰竭發(fā)生時氧化應激水平與細胞凋亡之間的相關性，進而闡明參附在慢性心力衰竭演變過程中所表現(xiàn)的保護作用及其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠36只，體質量180～220 g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證：SCXK（黑）2013-001。

1.2 實驗儀器與試劑 UV751GD紫外/可見分光光度計（上海分析儀器廠）；參附注射液（四川雅安三九藥業(yè)有限公司，50 mL/瓶，批號：Z2004-3117）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體為美國Santa Cniz公司產品，由武漢博士德公司提供。

1.3 造模與分組 大鼠實驗前普通基礎飼料喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為假手術組12只、心衰模型組12只、參附治療組12只。所有動物均常規(guī)喂養(yǎng)。心衰模型造模方法：采用腹主動脈縮窄法制備心臟壓力負荷超載心衰模型，主要步驟如下，以10%水合氯醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，備皮，常規(guī)強力碘消毒，逐層打開腹腔，左側腎動脈上方游離腹主動脈長約1 cm，與腹主動脈平行放置7號鈍針頭，一同結扎后，腎出現(xiàn)缺血外觀，抽出針頭，使腹主動脈部分縮窄，狹窄處內徑0.7 mm，關腹。大鼠術后均予青霉素10萬U 3 d預防感染。大鼠術后普通飼料喂養(yǎng)8周。假手術組除開腹暴露、分離雙側腎動脈間腹主動脈但不行縮窄處理外，其余步驟與心衰模型組處理一致。參附治療組造模后第4周開始每日1次，灌胃給藥［日劑量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。

1.4 觀察指標 1）超聲心動圖檢測：大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg，腹腔注射麻醉后備皮，應用超聲工作站測定左室收縮期內徑（LVDS）、舒張期內徑（LVDd）、左室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）。2）血流動力學指標檢測：末次給藥后24 h后，采用10%水合氯醛（3 mg/kg）進行腹腔注射麻醉。取大鼠頸前正中切口，經右頸總動脈插管至左心室，連接BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)檢測大鼠心功能。分別測定左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）以及左心室內壓最大上升速率（+dp/dt max）及左心室內壓最大下降速率（-dp/dt max）以及心率 （HR）。3）心肌SOD和心肌MDA含量測定：取心室部分，用0.9%氯化鈉注射液制備心臟勻漿，1500 r/min，離心10 min，黃嘌呤氧化酶法測定心肌SOD含量，采用硫代巴比妥酸顯色法測定心肌MDA含量。4）細胞凋亡檢測：取出心臟，置冰上去除心耳心房，取左心室心尖部用于Western blotting檢測，得出目的蛋白表達的相對光密度。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。實驗數(shù)據(jù)中兩種變量存在一定的相關性，使用Pearson線性相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組超聲心動指標比較 見表1。結果示，與假手術組比較，模型組LVDd、LVDS明顯增大，LVEF、FS明顯下降，BNP水平明顯升高（均P<0.05）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標均改善（均P<0.05）。

表1 各組LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指標比較（±s）

表1 各組LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指標比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n LVDd（cm） LVDS（cm） LVEF（%）FS（%） BNP（pg/mL）術組 12心衰模型組 8 6.19±0.72 2.81±0.68 81.62±4.60 6.83±0.28*4.57±0.45*61.74±3.17*53.24±3.85 131.82±3.77 32.90±2.01*1088.39±199.21*參附治療組 106.65±0.42△3.33±0.49△71.30±3.24△41.02±2.63△305.28±123.01△

2.2 各組血流動力學指標檢測結果比較 見表2。結果示，與假手術組比較，模型組LVEDP明顯增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降（均P<0.01）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標均恢復（均P< 0.01）。

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指標比較（±s）

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指標比較（±s）

組 別 n LVEDP（mmHg）LVSP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）dp/dtmax（mmHg/s） HR（bpm）假手術組 12心衰模型組 8 7.07±0.27 144.51±3.76 4523.00±368.27 26.20±1.66**105.99±3.09**2615.38±382.93**3875.25±156.26384.75±3.25 2074.38±160.03**423.88±3.00**參附治療組 1015.61±2.85△△123.65±5.59△△3625.30±365.49△△2968.5±172.94△△400.90±3.78△△

2.3 各組大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影響及Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較 見表3。結果示，與假手術組比較，心衰模型組心肌SOD活性明顯降低（P< 0.01），給予參附注射液處理后，心肌SOD活性明顯高于心衰模型組（P<0.01）；心衰模型組MDA含量明顯高于假手術組（P<0.01），參附注射液處理后，MDA含量明顯低于心衰模型組（P<0.01）。Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax/Bcl-2的比值明顯降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比較（±s）

表3 各組大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比較（±s）

組 別 n SOD（KU/L） MDA（μmol/mg） Bcl-2/Bax假手術組 12心衰模型組 8 140.37±7.84 4.48±1.26 1.58±0.20 80.89±6.65**15.99±2.44**0.45±0.65**參附治療組 10108.95±6.64△△11.59±2.35△△1.14±0.52△△

圖1 各組大鼠心肌細胞Bcl-2/Bax比值比較

2.4 Bcl-2/Bax與大鼠心肌SOD活性和MDA含量進行直線回歸分析 結果示，SOD與Bcl-2/Bax線性相關性具有統(tǒng)計學意義（r=0.652，P<0.001），存在線性正相關關系；MDA與Bcl-2/Bax線性具有統(tǒng)計學意義（r= -0.644，P<0.001），存在線性負相關關系。

3 討 論

CHF是各種因素引起的心肌損傷，進而引起心肌結構和功能改變，引發(fā)組織灌注量不足。CHF是各種心臟疾病的終末期表現(xiàn)，發(fā)病率近年來呈上升趨勢，死亡率高，已引起臨床高度關注［3-5］。

氧自由基可改變心臟結構、導致心臟功能異常，促進心衰的演變進程［6-7］。近年來研究表明，心衰動物模型中氧自由基顯著增多，抵抗被氧化的能力降低。當氧自由基抵抗物質活性下降或產生過度，將導致氧自由基沉積，進而刺激細胞膜脂質發(fā)生過氧化反應。MDA是自由基刺激細胞膜發(fā)生過氧化反應的產物之一，SOD為代表的抗氧化酶系統(tǒng)可清除體內自由基。CHF發(fā)生發(fā)展過程中，心肌細胞減少或（和）剩余心肌收縮功能代償不足導致心臟結構異常和功能改變，原因可能是細胞凋亡。研究表明，抑制凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax水平高低關乎凋亡調控；有證據(jù)顯示受凋亡刺激后的細胞生存能力由Bcl-2/Bax決定，Bcl-2/Bax升高，提升細胞生存率，否則反之。

本實驗發(fā)現(xiàn)心衰模型組心肌MDA、SOD、凋亡蛋白Bcl-2/Bax發(fā)生顯著變化，與假手術組對照均有明顯差異，說明氧化應激可導致心肌細胞的結構破壞和功能異常，心力衰竭演變進程中凋亡的程度明顯升高。相關性分析顯示由于氧化應激加速了心肌細胞凋亡的產生，進而引起心功能下降，導致心力衰竭。

CHF按其臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學 “心悸”“胸痹”“脫證”范疇，其病理基礎為心氣陰虛。虛標實證、心脾腎陽虛，其關鍵環(huán)節(jié)為瘀血、痰濁、水飲為標，血脈瘀滯。參附注射液主要治療陽虛所致的各種疾病，成分主要為人參皂苷和去甲烏頭堿，人參皂苷可改善心肌營養(yǎng)代謝，提高心肌收縮力。烏頭堿則能顯著提高心臟功能［9-10］。有證據(jù)顯示參附注射液可抗氧化，去除氧自由基，降低細胞膜受到羥自由基的攻擊［11-12］，改善微小循環(huán)［13-14］。顧云等發(fā)現(xiàn)參附注射液可降低大鼠心肌細胞凋亡，進而起到維護心臟的效用［15］。

綜上所述，本實驗采用腹主動脈部分縮窄方法誘導大鼠心功能的損害，并給予參附注射液抑制心肌損傷。結果表明與模型組比較，參附治療組SOD活性顯著升高，MDA含量、心肌凋亡蛋白Bcl-2/Bax顯著降低，說明參附注射液能夠通過抗氧自由基損傷，抑制心肌細胞凋亡和心臟功能的損害，這關乎參附注射液強大的抵擋被氧化的功能，詳細機制有待后續(xù)探討。

［1］ Zheng SD，Wu HJ，Yu SP，et al.Shenfu injection sup-presses inflammation by targeting haptoglobin and pen-traxin 3 in rats with chronic ischemic heart failure［J］.Chin J Integr Med，2015，21（1）：22-28.

［2］ 薛建軍，呼薈茹，齊兵獻，等.參附注射液對心肌缺血再灌注老年大鼠NF-κB及IκB-α表達的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26（2）：18-21.

［3］ Zheng SD，Wu HJ，Yu SP，et al.Shenfu injection sup-presses inflammation by targeting haptoglobin and pen-traxin 3 in rats with chronic ischemic heart failure［J］.Chin J Integr Med，2015，21（1）：22-28.

［4］ 高煒.心力衰竭［M］.2版.北京：北京大學醫(yī)學出版社，2013：629.

［5］ 候雅竹.參附注射液治療心力衰竭的系統(tǒng)評價［J］.中國循證醫(yī)學雜志，2011，11（3）：292-299.

［6］ Nokamura K，Miura D，Matsubara H，et al.Oxidativestress and calcium overload in heart failure［J］.Folia Pharmacologica Japonica，2012，140（6）：265-269.

［7］ Radovanovic S，Savic-Radojevic A，Pljesa-Ercegovac M，et al.Markers of oxidative damage and antioxidant enzymeactivities as predictors of morbidity and mortality in pa-tients with chronic heart failure［J］.J Card Fail，2012，18（6）：493-501.

［8］ 薛建軍，呼薈茹，齊兵獻，等.參附注射液對心肌缺血再灌注老年大鼠NF-κB及IκB-α表達的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26（2）：18-21.

［9］ 蘇泓潔，趙興吉，向小勇.參附注射液對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.臨床合理用藥，2011，4（2）：77-79.

［10］Zheng SD，Wu HJ，Yu SP，et al.Shenfu injection sup-presses inflammation by targeting haptoglobin and pen-traxin 3 in rats with chronic ischemic heart failure［J］.Chin J Integr Med， 2015，21（1）：22-28.

［11］李桂瓊，陳慶偉，柯大智.參附注射液對實驗心源性休克犬血漿NO、iNOS及心肌iNOS mRNA的影響［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2012，34（7）：673-675.

［12］吳運香，張野，謝春林，等.SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評價［J］.中國藥理學通報，2011，27（8）：1170-1173.

［13］季憲飛.參附注射液減輕心肺復蘇后心肌β-腎上腺能受體信號傳導損傷［J］.中華醫(yī)學雜志，2013，126（4）：698-699.

［14］李洪雷.參附注射液治療心力衰竭研究進展［J］.中國中醫(yī)急癥，2013，22（2）：276-277.

［15］顧云，辛毅，吳永濤，等.參附注射液抑制大鼠缺血再灌注損傷期間心肌細胞凋亡的作用機制［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2012，29（2）：85-88.

Effects of Shenfu Injection on Oxidative Stress and Apoptosis in Rats with Heart Failure

DENG Meng，GUO Li，ZHANG Li.First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Heilongjiang，Jiamusi 154002，China.

Objective：To investigate the effects of Shenfu Injection on oxidative stress and apoptosis in rats with heart failure.Methods：36 SD rats were randomly divided into three groups with 12 rats in each：the sham operation group，the heart failure model group and Shenfu treatment group.4 weeks after operation，the treatment group was given intragastric administration once a day daily dose：6.0 mL/（kg·d），for 4 weeks.The following data was detected：LVDS，LVDd，LVEF，F(xiàn)S，HR，LVSP，LVEDP，maximum rate of LVP，the content of the SOD and MAD and cardiac target protein.Results：Compared with the sham operation group，LVDd and LVDS of the model group increased obviously；LVEF and FS decreased obviously，and the level of BNP increased obviously（P< 0.05）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.05）.Compared with the sham operation group，LVEDP of the model group increased obviously；LVSP decreased，and+dp/ dt，Max，-dp/dt，Max and HR decreased obviously（P<0.01）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.01）.Compared with the sham operation group，the activity of SOD in the heart failure model group decreased obviously（P<0.01）.After treated with Shenfu Injection，the myocardial SOD activity was significantly higher than that in the heart failure model group（P<0.01）.The content of MDA in heart failure model group was significantly higher than that in sham operated group（P<0.01）.The content of MDA after the treatment of Shenfu Injection was lower than that in heart failure model group（P<0.01）.The expression of Bax protein was significantly decreased；the expression of Bcl-2 protein increased significantly，and theratio of Bax/Bcl-2 decreased significantly（P<0.01）.The linear correlation between SOD and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=0.652，P<0.001），and linear positive correlation existed.Linearity of MDA and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=-0.644，P<0.001），and linear negative correlation exists.Conclusion：Shenfu injection can decrease the level of oxidative stress，inhibit protein apoptosis，and thus improve cardiac function in heart failure rats and the mechanism may be related to the up-regulation of apoptosis inhibitory protein Bcl-2 and down-regulation of Pro apoptotic protein Bax.

Heart failure；Shenfu injection；Oxidative stress；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1401-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.025

2017-05-03）

黑龍江省佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目（YZ2016-024）

△通信作者（電子郵箱：332910182@qq.com）