韓延忠，王玉芝，劉如華，沈 娟,*

專(zhuān)題研究

兩種2型糖尿病小鼠潰瘍創(chuàng)面愈合比較

韓延忠1，王玉芝2，劉如華3，沈 娟1,3*

糖尿病潰瘍是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一[1]，是目前臨床治療性的難題，也是當(dāng)前創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[2，3]。針對(duì)糖尿病潰瘍的藥物研究，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)意義[4]。因此選擇穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)的糖尿病潰瘍的的動(dòng)物創(chuàng)面模型是該類(lèi)藥物研究與評(píng)價(jià)的一個(gè)重要問(wèn)題。

小鼠遺傳背景清楚，基因組測(cè)序已全部完成，易于飼養(yǎng)，成本較低，是實(shí)驗(yàn)室研究的理想動(dòng)物模型。瘦素受體基因缺陷導(dǎo)致的db/db小鼠和采用高脂詞料加鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠創(chuàng)面模型已被國(guó)內(nèi)外研究者廣泛應(yīng)用于糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究，然而，卻未對(duì)這兩種典型的糖尿病小鼠創(chuàng)面模型的愈合特點(diǎn)及愈合生物學(xué)特征的差異進(jìn)行比較、分析和研究。

因此，本研究將比較II型型糖尿病C57BL/6J-db/db和STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠的潰瘍創(chuàng)面愈合進(jìn)程、病理組織學(xué)特征及創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平等方面的差異，為進(jìn)一步開(kāi)展糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠30只，雄性，體重20～22 g，6～8周齡，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]，隨機(jī)分為正常組15只和糖尿病組15只。C57BL/6J-db/db糖尿病小鼠15只，雄性，體重50～55 g，7～8周齡，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供[SCXK(蘇)2015-0001]。以上動(dòng)物均在廣東藥科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)間飼養(yǎng)[SYXK(粵)2012-0125]。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗及二抗、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)一抗及二抗，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Collagen-IIIα基因序列：上游引物(5’→3’) ACGTAAGCACTGGT GGACAG，下游引物(5’→3’) AGCTGCACATCAAC GACATC、α-SMA 基因序列：上游引物(5’→3’)TGTGCTGGACTCTGGAGATG，下游引物(5’→3’) GAAGGAATAGCCACGCTCAG)基因引物,購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(SYBR Green)試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；其它試劑均用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 STZ誘導(dǎo)的II型糖尿病小鼠模型的建立

正常組小鼠和db/db組小鼠喂以基礎(chǔ)飼料，糖尿病(STZ)組小鼠喂以高脂飼料，持續(xù)4周后，STZ組小鼠禁食12 h，腹腔注射STZ 40 mg/kg，連續(xù)注射5 d，繼續(xù)飼喂高脂飼料，注射7 d后測(cè)量隨機(jī)血糖，血糖值大于16.67 mmol/L的個(gè)體被認(rèn)定為2型糖尿病小鼠[5-7]。

1.3.2 2型糖尿病小鼠潰瘍創(chuàng)面模型的建立

正常組、db/db組、STZ組共36只小鼠，按0.015 mL/g計(jì)算用量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后背部剃毛消毒，無(wú)菌條件下在背部正中兩側(cè)用無(wú)菌手術(shù)剪各剪一個(gè)0.8 cm的圓形創(chuàng)面，深至筋膜，無(wú)菌紗布包扎，小鼠單籠飼養(yǎng)。1.3.3 創(chuàng)面圖像采集和組織取材

分別在0、3、5、7、10、14 d時(shí)，數(shù)碼相機(jī)采集圖像，使用Adobe Photoshop CS 2.0軟件對(duì)采集的創(chuàng)面定焦圖像進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)裁，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)未愈合的創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率(%)=(初始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)初始創(chuàng)面面積 × 100%，并統(tǒng)計(jì)完全計(jì)愈合時(shí)間。在第7、14天時(shí)，隨機(jī)處死每組的6只小鼠，統(tǒng)取小鼠左側(cè)創(chuàng)面處皮膚用4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片。小鼠右側(cè)創(chuàng)面處皮膚采用RNA試劑盒提取RNA，-80℃保存。

1.3.4 HE染色

按蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒的說(shuō)明書(shū)，分別將正常組、STZ組、db/db組小鼠在第7、14天的皮膚石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟脫水并染色，顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織學(xué)與膠原沉積的變化。

1.3.5 免疫組化觀察CD31和PCNA的表達(dá)變化

在第7、14天的三組皮膚石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，免疫組化實(shí)驗(yàn)方法參照[8]，其中分別附PCNA鼠源多克隆一抗及辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，CD31兔源多克隆一抗及辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，CD31 定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性，顯微鏡200倍鏡下，各切片均選擇視野左、中、右三個(gè)部位，每個(gè)視野互不重疊，用Image J軟件進(jìn)行光密度分析，計(jì)算PCNA、CD31的表達(dá)量。

1.3.6 熒光定量PCR檢測(cè)collagen-IIIα、α-SMA mRNA基因的表達(dá)變化

Real-time PCR反應(yīng)20 μL體系：上下游引物(10 μM)各0.6 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free dd H2O 7.8 μL。按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置預(yù)變性和PCR擴(kuò)增條件上機(jī)檢測(cè)，系統(tǒng)自動(dòng)分析顯示Ct。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率

5 d，STZ組創(chuàng)面結(jié)痂，傷口填補(bǔ)縮合，而db/db組7 d才出現(xiàn)創(chuàng)面肉芽組織，傷口縮合。14 d，正常組已愈合，STZ組上皮大部覆蓋，未完全愈合，db/db組瘢痕收縮不完全，未愈合，如圖1所示。STZ組與db/db組的創(chuàng)面愈合率有顯著性差異(3～10 d，P< 0.001)。db/db組與STZ組比較創(chuàng)面愈合時(shí)間顯著性延遲，由(16.6±0.8) d延長(zhǎng)至(20.2±1.3) d(P< 0.001)。因此，db/db組相比于STZ組的創(chuàng)面愈合更為緩慢、穩(wěn)定。如圖2所示。

圖1 小鼠創(chuàng)面愈合變化Fig.1 Changes of wound healing in the mice

注：(A)正常小鼠、STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠、db/db小鼠在術(shù)后0、3、5、7、10、14 d時(shí)創(chuàng)面愈合率；(B)各組100%創(chuàng)面愈合的時(shí)間。STZ組和db/db組分別與正常組小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；db/db組與STZ組小鼠比較，#P< 0.05，###P< 0.001。圖2 創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間Note.(A)Wound healing rate from three groups (normal mice and diabetic mice induced by STZ, db/db mice) each at 0, 3, 5, 7, 9 and 14 days after surgery；(B) 100% wound healing time in each group；Compared with the normal group mice, *P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001；The db/db mice group compared with STZ group,#P < 0.05，###P < 0.001.Fig.2 Wound healing rate and healing time in the mice

2.2 創(chuàng)面HE染色結(jié)果

7 d，db/db組較STZ組，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，無(wú)成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，紅細(xì)胞極少，肉芽組織不明顯，膠原纖維排列混亂且間質(zhì)疏松，正常組含有大量成纖維細(xì)胞、紅細(xì)胞，并伴有炎性細(xì)胞存在，已明顯看到肉芽組織。14 d，db/db組相比于STZ組仍有大量炎性細(xì)胞存在且間質(zhì)疏松，膠原纖維排列較為混亂，愈合較差，正常組膠原纖維緊密，上皮完整覆蓋，創(chuàng)面已愈合。如圖3、圖4所示。

注：(A,D)db/db小鼠；(B,E)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠；(C,F)正常小鼠在術(shù)后7 d時(shí)創(chuàng)面組織HE染色。圖3 小鼠7 d時(shí)創(chuàng)面HE染色Note. A,D: db/db mice; B,E: STZ-induced diabetic mice; C,F: Normal mice.Fig.3 Histology of the wound surface in mice at 7 days after surgery. HE staining

注：(A,D)db/db小鼠; (B,E)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠; (C,F)正常小鼠在術(shù)后14 d時(shí)創(chuàng)面組織HE染色。圖4 實(shí)驗(yàn)小鼠14 d各組創(chuàng)面HE染色Note. A,D: db/db mice; B,E: STZ-induced diabetic mice; C,F: Normal mice.Fig.4 Histology of the wound surface in mice at 14 days after surgery. HE staining

2.3 抗體CD31和PCNA的表達(dá)結(jié)果

新生血管密度(CD31抗體標(biāo)記)和細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)的多少是創(chuàng)面的修復(fù)的重要指標(biāo)。7 d，db/db組(0.45± 0.06)%較STZ組(0.68±0.06)%新生血管密度更低(P< 0.01)，如圖5、圖6所示；并且，db/db組(4.10±0.60)%較STZ組(5.84±0.64)%的PCNA顯著性的低表達(dá)(P< 0.01)，如圖7、圖8所示?？梢?jiàn)，db/db組的創(chuàng)面修復(fù)能力要顯著低于STZ組。

圖5 CD31抗體免疫組化染色(Bar=20 μm)Fig.5 Comparison of neovasculature formation in the skin of db/db and STZ-induced diabetic mice. CD31 antibody immunohistochemical staining

注：與正常組小鼠比較，*P< 0.05，***P< 0.001； db/db組與STZ組小鼠比較， ##P< 0.01。圖6 CD31抗體陽(yáng)性表達(dá)面積百分比Note.Compared with the normal mice，*P <0.05,***P < 0.001； db/db mice compared with STZ-treated mice,##P < 0.01.Fig.6 The percentage of CD31 positive expression area

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)Collagen-IIIα、α-SMA mRNA基因的表達(dá)

Collagen-IIIα和α-SMA mRNA基因的表達(dá)上調(diào)水平與愈合修復(fù)水平正相關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，各組創(chuàng)面組織7 d到14 d的Collagen-IIIα mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，其中STZ組基因表達(dá)量呈5倍量上調(diào)，db/db組基因表達(dá)量呈2倍量上調(diào)，上調(diào)的倍數(shù)顯著低于STZ組。因此，db/db組愈合效果明顯低于STZ組，如表1所示。7 d，STZ組和db/db組的α-SMA mRNA的表達(dá)量都顯著低于正常組，均較正常組愈合緩慢；14 d，STZ組基因表達(dá)量呈多倍量上調(diào)，顯著高于db/db組的上調(diào)倍數(shù)，因此db/db組比較STZ組的創(chuàng)面愈合效果較差。

圖7 PCNA抗體免疫組化染色Fig.7 PCNA expression in the mouse wound skin. Immunohistochemical staining.

注：與正常組小鼠比較，*P< 0.05，***P< 0.001；db/db組與STZ組小鼠比較， ##P< 0.01。圖8 PCNA抗體陽(yáng)性表達(dá)面積百分比Note.Compared with the normal group，*P < 0.05,***P < 0.001；The db/db group compared with STZ group,##P < 0.01.Fig.8 The percentage of PCNA-positive expression area in the mouse skin wouds

組別Groups7d14d正常組Normalgroup0 93±0 051 41±0 49STZ組STZgroup0 24±0 05???1 05±0 15db/db組db/dbgroup3 55±0 27???###6 45±0 32???###

注：與正常組小鼠比較，***P< 0.001；db/db組與STZ組小鼠比較，###P< 0.001。

Note.Compared with the normal group，***P< 0.001；The db/db group compared with STZ group,###P< 0.001.

表2 潰瘍創(chuàng)面α-SMA mRNA的表達(dá)結(jié)果Tab.2 Expression of α-SMA mRNA in the skin wounds of diabetic mice

注：與正常組小鼠比較，***P< 0.01；db/db組與STZ組小鼠比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note.Compared with the normal group，***P< 0.01；The db/db group compared with STZ group,#P< 0.05.

3 討論

STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型與由于瘦素受體缺陷導(dǎo)致的先天肥胖性糖尿病db/db小鼠模型在國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道，在兩種小鼠模型之上構(gòu)建的糖尿病創(chuàng)面潰瘍模型也同樣均有研究應(yīng)用，兩種小鼠模型在一定的程度上均模擬了臨床糖尿病創(chuàng)面潰瘍難愈合的病癥特點(diǎn)，但是兩種模型的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值卻少有比較研究的報(bào)道。

創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間是評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合最直觀的指標(biāo)之一[9]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)糖尿病潰瘍創(chuàng)面組較正常組具有顯著性愈合緩慢，并且db/db組相比于STZ組具有顯著性的愈合延遲。HE染色組織病理觀察，在創(chuàng)面愈合早期，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加快創(chuàng)面的愈合，但是在后期，尤其是db/db組中大量的炎性細(xì)胞阻礙了創(chuàng)面的愈合，與創(chuàng)面愈合的宏觀觀察一致。劉宸等[10]研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠創(chuàng)面中的巨噬細(xì)胞早期浸潤(rùn)數(shù)量較低，與創(chuàng)面愈合率具有正相關(guān)性，而晚期殘留巨噬細(xì)胞數(shù)量較多且與創(chuàng)面愈合率具有負(fù)相關(guān)性。

創(chuàng)面的修復(fù)伴隨血管的新生來(lái)提供大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，CD31能夠特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管密度可作為血管新生的指標(biāo)[11,12]。PCNA存在于細(xì)胞核中，是 DNA 聚合酶δ的輔助蛋白，在S期為DNA 復(fù)制所必需，對(duì)于細(xì)胞增殖起重要作用[13]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面愈合的第7天時(shí)，db/db組與STZ組比較，CD31和PCNA都具有顯著性的低表達(dá)，db/db組的創(chuàng)面明顯更加難以愈合。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積是創(chuàng)面愈合修復(fù)的重要組成部分，collagen-IIIα基因主要調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于collagen-IIIα的調(diào)控，db/db鼠的ECM沉積要少于STZ[14]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的重要標(biāo)志，肌成纖維細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特性[15]。它廣泛存在于機(jī)體各組織中，通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、趨化因子等物質(zhì)，從而在組織損傷的修復(fù)過(guò)程中占有重要的地位[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，7、14 d，STZ組的collagen-IIIα和α-SMA基因多倍量的上調(diào)，db/db組的上調(diào)倍數(shù)顯著低于STZ組。這初步明確了db/db組的愈合時(shí)間較STZ組延遲在基因調(diào)控方面的原因。

兩種糖尿病潰瘍創(chuàng)面模型作為經(jīng)典模型均出現(xiàn)愈合延遲，而db/db小鼠相比于STZ誘導(dǎo)的糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合更為緩慢，潰瘍模型重復(fù)性、穩(wěn)定性更高，為應(yīng)用穩(wěn)定的糖尿病小鼠潰瘍模型進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

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(1.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣州 510006； 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510006； 3.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006)

目的 比較目前常用的基因自發(fā)突變2型糖尿病小鼠C57BL/6J-db/db和STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠的潰瘍創(chuàng)面愈合特征，為應(yīng)用穩(wěn)定的糖尿病小鼠潰瘍模型進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。方法 建立糖尿病小鼠潰瘍模型，統(tǒng)計(jì)0、3、5、7、10、14 d小鼠創(chuàng)面動(dòng)態(tài)愈合率及愈合時(shí)間；7、14 d取組織，HE染色和Masson染色，免疫組化(CD31和PCNA)觀察創(chuàng)面病理組織變化；熒光定量測(cè)定愈合相關(guān)因子collagen-IIIα、α-SMA的基因表達(dá)。結(jié)果 基因突變db/db小鼠較STZ誘導(dǎo)小鼠的創(chuàng)面愈合時(shí)間顯著延遲，由(16.6±0.8) d延長(zhǎng)至(20.2±1.3) d(P< 0.001)；db/db組較STZ組肉芽組織生長(zhǎng)緩慢，新生上皮長(zhǎng)度不足、膠原沉積紊亂，創(chuàng)面愈合較差；7 d，db/db組的CD31和PCNA顯著性低表達(dá)(P< 0.01)；7、14 d，db/db組基因上調(diào)量的倍數(shù)明顯低于STZ組。結(jié)論 兩種糖尿病小鼠創(chuàng)面均出現(xiàn)愈合延遲，但基因突變糖尿病db/db小鼠相比于STZ誘導(dǎo)組小鼠在創(chuàng)面愈合延遲的程度上和愈合難易程度上，更適合進(jìn)行糖尿病潰瘍創(chuàng)面的研究。

2型糖尿病小鼠；難愈性創(chuàng)面；動(dòng)物模型

Comparison of wound healing in two mouse models of type 2 diabetes

HAN Yan-zhong1， WANG Yu-zhi2， LIU Ru-hua3， SHEN Juan1,3*
(1.Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances, School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China； 2.General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510006； 3.School of Life Science & Biopharmacology, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006)

Objective To compare the characteristics of ulcer wound healing in current commonly used C57BL/6J-db/db mouse models of spontaneous gene mutation-induced type 2 diabetes and in C57BL/6J mice with diabetes induced by streptozotocin (STZ), and to provide a basis for related experimental studies on diabetic ulcer in animal models. Methods To establish the mouse models of diabetic ulcer wound, observe the healing time and calculate the wound healing rate at 0, 3, 5, 7, 10, 14 days. Tissue samples were collected at days 7 and 14. HE and Masson staining, and immunohistochemistry (CD31 and PCNA) were used to observe the pathological changes of the wound tissues. Gene expressions of collagen-IIIα, fibronectin and α-SMA were detected by fluorescent quantitative analysis. Results The wound healing time of db/db mice was significantly delayed compared with the STZ mice, which was extended from 16.6±0.8 d to 20.2±1.3 d (P< 0.001). Compared with the STZ group, the growth of granulation tissue in the db/db group was slow, the length of newly formed epithelium was insufficient, the collagen deposition was disordered, and the wound healing was poor. At 7 days, the expression of CD31 and PCNA was significantly lower in the db/db group (P< 0.01), and at 7 and 14 days, the increase of collagen-IIIα and α-SMA genes up-regulation was significantly lower in the db/db group than in the STZ group. Conclusions Both the two types of diabetic mice show delayed wound healing. However, compared with the STZ-induced diabetic mice, the gene mutation db/db mice are more suitable for studies of diabetic ulcer wound healing as regarding the extent of the delay and the degree of difficulty of wound healing.

Type 2 diabetes mice; Refractory wound; Animal model

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81502520)。

韓延忠(1991-)，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)：中藥學(xué)。E-mail: yanzhong0208@sina.com

沈娟(1981-)，女，副教授，研究方向：糖尿病難愈創(chuàng)面。E-mail: shenjuan0412@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0006-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.002

2017-03-17