王 雪，韓利文，何秋霞，韓 建，王榮春，陳維云，王希敏，侯海榮，劉可春(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014)

專題研究

斑馬魚模型在糖尿病研究中的應(yīng)用

王 雪，韓利文，何秋霞，韓 建，王榮春，陳維云，王希敏，侯海榮，劉可春*
(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014)

作為一種模式生物，斑馬魚具有其他動(dòng)物模型所不具備的諸多優(yōu)勢，非常適用于進(jìn)行人類疾病建模及機(jī)制研究。斑馬魚胰腺經(jīng)歷兩次發(fā)育分化過程，其間伴有多種信號途徑的活化參與。成魚的胰腺結(jié)構(gòu)與其他動(dòng)物胰腺相似，能分泌包括胰島素在內(nèi)的多種激素。斑馬魚胰腺及對胰島素敏感的肝臟、肌肉等這些與代謝調(diào)控相關(guān)的主要器官及外周組織，在進(jìn)化上具有保守性，糖代謝調(diào)控機(jī)制也與其他哺乳動(dòng)物相似，這使得斑馬魚非常適用于糖代謝調(diào)控研究。除利用STZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡造成斑馬魚糖尿病模型外，高糖溶液交替暴露及外源性干預(yù)代謝相關(guān)信號途徑也可以造成斑馬魚血糖升高。成魚血糖水平、幼魚組織糖含量、視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化是目前斑馬魚糖尿病模型研究中的常用檢測指標(biāo)。

斑馬魚；糖尿病；模式生物；胰腺；糖代謝

糖尿病是一組由多病因引起的、以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病。糖尿病患者體內(nèi)長期存在的高血糖狀態(tài)，會廣泛導(dǎo)致機(jī)體各組織，尤其是眼、腎、心臟、血管及神經(jīng)等的慢性損害和功能障礙，嚴(yán)重危害人體健康。糖尿病是全球流行性疾病，患病率呈逐年增高趨勢，并成為致死和致殘的重要原因，對糖尿病的研究一直是一項(xiàng)世界性的重要課題，但對糖尿病的病因，至今尚未完全闡明。

動(dòng)物模型是進(jìn)行人類疾病研究的重要工具，利用動(dòng)物模型不僅能直觀的體現(xiàn)人類疾病的病理生理改變，進(jìn)行疾病機(jī)制研究，還可以在模型基礎(chǔ)上篩選活性藥物。目前在利用動(dòng)物糖尿病模型研究糖尿病及其并發(fā)癥方面已有大量的報(bào)道，其中最為常用的動(dòng)物是大、小鼠，但還沒有哪種動(dòng)物模型能完全呈現(xiàn)人類糖尿病臨床癥狀。斑馬魚是一種理想的脊椎模式生物，體格小、產(chǎn)卵量大、生長周期短，成魚養(yǎng)殖簡單，能夠有效提高實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)，斑馬魚的基因信息已為人類熟知，針對斑馬魚的基因操作技術(shù)已非常成熟，通過靶向性地誘導(dǎo)或敲除體內(nèi)某些基因，改變其表達(dá)水平，可以較容易的在斑馬魚上復(fù)制人類的一些疾病狀態(tài)，非常適用于進(jìn)行人類疾病建模及機(jī)制研究。而在內(nèi)分泌腺體功能及糖代謝方面，斑馬魚有其自身的特點(diǎn)及優(yōu)勢，并已應(yīng)用于人類糖尿病等代謝類疾病方面的研究，本文對此作一綜述。

1 斑馬魚胰腺發(fā)育及生物學(xué)特點(diǎn)

自1996年，研究者開始從分子、遺傳及形態(tài)學(xué)等多個(gè)角度對斑馬魚胰腺進(jìn)行研究[1]。在胚胎早期發(fā)育中，斑馬魚胰腺經(jīng)歷兩次發(fā)育分化過程。胰腺第一次發(fā)育出現(xiàn)于胚胎受精后24 h(hours post-fertilization，hpf)，主要是形成一些分泌胰島素的細(xì)胞[2]，即為初級胰島；5 dpf (days post-fertilization) 時(shí)，位于胰腺管內(nèi)的前體細(xì)胞開始轉(zhuǎn)化并聚集，形成次級胰島，只有在第二次分化中形成的內(nèi)分泌細(xì)胞具有增殖潛能，并形成后來成魚的胰腺[3，4]。與其他脊椎動(dòng)物一樣，斑馬魚胰腺的內(nèi)分泌腺及外分泌腺均來源于內(nèi)胚層。繼內(nèi)胚層分化及與中胚層分離之后，消化管前后軸的分化是胰腺發(fā)育的重要一步，這個(gè)過程直接伴隨有多種信號途徑的活化參與，包括Wnt、RA(retinoic acid)、BMP(bone morphogenetic protein), FGF(fibroblast growth factor)和 Hh (Hedgehog)等[5]。每種信號途徑具有不同的作用，這些信號的綜合作用實(shí)現(xiàn)了胰腺原基的精確定位，及胰腺一些早期標(biāo)志物的區(qū)域化表達(dá)，如Pdx1 因子，研究表明Pdx1 因子在脊椎動(dòng)物胰腺原基的形成及后期的分化中發(fā)揮重要作用。與哺乳動(dòng)物一樣，斑馬魚胰腺β細(xì)胞的分化過程受Notch 信號控制，胰腺內(nèi)一些對Notch信號敏感的腺管相關(guān)的前體細(xì)胞(notch-responsive cells，PNCs)，具有分化成β細(xì)胞的潛能[6]。同時(shí)，幼魚期β細(xì)胞的形成與腺管上皮細(xì)胞密切相關(guān)，研究表明，腺管上皮細(xì)胞具有向胰腺β細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力[5]。

與其他動(dòng)物胰腺的細(xì)胞結(jié)構(gòu)一樣，斑馬魚胰腺由一個(gè)外分泌腺(腺管結(jié)構(gòu))和一個(gè)內(nèi)分泌腺組成，其中內(nèi)分泌腺由α、β、δ和PP 細(xì)胞組成，這些細(xì)胞分別具有表達(dá)分泌胰高血糖素(glucagon)、胰島素(insulin)、 生長抑素(somatostatin)和胰多肽(pancreatic polypeptide)的功能[7，8]。在胚胎發(fā)育第一周，斑馬魚胰腺結(jié)構(gòu)簡單，僅有一個(gè)胰島[9]。在斑馬魚成魚，一部分胰腺β細(xì)胞聚集于胰腺頭部的邊緣部位，形成單個(gè)大的胰島，另一部分則形成一些小的胰島，嵌入外分泌腺組織中，并沿胰腺管散在分布[10]。

2 斑馬魚在糖尿病模型研究中的應(yīng)用

2.1 斑馬魚糖尿病模型的應(yīng)用基礎(chǔ)及優(yōu)勢

硬骨魚類體內(nèi)分布有一些包含激素分泌細(xì)胞的內(nèi)源性腺體，這些腺體分泌產(chǎn)生包括胰島素在內(nèi)的多種激素，用于機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)，研究表明，這些腺體與人類的具有同源性[11]。在斑馬魚，與代謝調(diào)控相關(guān)的主要器官，如胰腺，及一些對胰島素敏感的外周組織組織肝臟、肌肉等在進(jìn)化上具有保守性[12]，一些與糖代謝調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵機(jī)制與其他哺乳動(dòng)物非常相似[13]，使得斑馬魚可以作為糖代謝調(diào)整控的研究模型，用于人類糖尿病研究[11]。另外，對魚類在碳水化合物利用方面的研究表明，如斑馬魚類生活在溫水、雜食性的硬骨魚對碳水化合物的利用度遠(yuǎn)高于生活在冷水、肉食性硬骨魚，其糖代謝速度也比肉食性魚類要快。碳水化合物是斑馬魚食物中的重要成分，斑馬魚生長速度與其含量成正比。一些與糖代謝有關(guān)的重要基因如己糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在斑馬魚體內(nèi)活躍表達(dá)，而這些基因的缺失會引發(fā)斑馬魚胚胎發(fā)生一系列嚴(yán)重的神經(jīng)缺陷，因此，糖代謝是斑馬魚機(jī)體代謝的重要組成部分，斑馬魚是進(jìn)行糖尿病相關(guān)研究的理想模型。

由于基因組部分復(fù)制，斑馬魚的許多基因包含兩個(gè)相應(yīng)的直向同源基因，兩個(gè)同源基因含的增強(qiáng)子不同，使其在不同的組織存在職能化表達(dá)。如胰腺的nkx2.2a、pax6b及jagged1b基因等即存在這一現(xiàn)象[7,14]。利用斑馬魚基因表達(dá)的特點(diǎn)，現(xiàn)已構(gòu)建了大量的斑馬魚突變體及轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，如綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚，這種斑馬魚體內(nèi)的器官或組織細(xì)胞能特異表達(dá)綠色熒光蛋白，加上斑馬魚幼魚魚體透明的特點(diǎn)，直接在顯微鏡下即可觀察器官形態(tài)及組織成分的變化，可以有效的簡化實(shí)驗(yàn)過程，非常適于藥物的高通量篩選。

2.2 斑馬魚糖尿病模型的造模方法

糖尿病動(dòng)物模型來源有兩種，一種是由于動(dòng)物自身基因的缺陷自發(fā)形成的糖尿病[15]，另一種是通過藥物誘導(dǎo)使動(dòng)物發(fā)生糖尿病。藥物誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物糖尿病模型是目前最常用的，常用藥物有鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan)，兩者均是通過烷化或誘導(dǎo)DNA破壞造成胰島β細(xì)胞凋亡，造成胰島素分泌量不足使血糖升高。嚙齒類動(dòng)物模型普遍存在成本高、周期長的缺點(diǎn)。

STZ易溶于水，但其水溶液在室溫下極不穩(wěn)定。Olsen[16]研究中將STZ注入斑馬魚成魚體內(nèi)，斑馬魚出現(xiàn)血糖升高癥狀，而血液及胰腺中胰島素含量顯著降低。Michael等[17]用同樣方法建立了斑馬魚糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)在去除STZ后2周內(nèi)，斑馬魚胰腺β細(xì)胞完成再生修復(fù)，血糖恢復(fù)至正常水平。眾所周知，糖尿病會引起傷口愈合困難，Michael實(shí)驗(yàn)中的糖尿病斑馬魚同樣出現(xiàn)鰭再生及皮膚傷口的愈合障礙，而且，在血糖水平恢復(fù)正常后，這種現(xiàn)象仍持續(xù)存在[18]，這與臨床糖尿病表現(xiàn)是一致的，即一旦發(fā)生糖尿病后，即使通過藥物干預(yù)將血糖控制到正常水平，但一些并發(fā)癥會依然存在并繼續(xù)進(jìn)展[19]。其他的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也證明最初的高血糖階段會造成靶器官出現(xiàn)持久的功能異常。這一現(xiàn)象被命名為“代謝記憶效應(yīng) (metabolic memory，MM)”。Michael進(jìn)一步對糖尿病高血糖期及血糖恢復(fù)后這兩種狀態(tài)下基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這兩種狀態(tài)下基因的表達(dá)模式發(fā)生了相似的改變，這也是血糖恢復(fù)正常后仍出現(xiàn)鰭及皮膚再生障礙的原因，即使血糖水平等指征恢復(fù)正常，高血糖對靶器官造成的損害仍無法逆轉(zhuǎn)[17]。

斑馬魚對環(huán)境中糖的攝取與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)，體內(nèi)高滲狀態(tài)使環(huán)境中的水分進(jìn)入體內(nèi)，葡萄糖隨之?dāng)z入體內(nèi)。Gleeson等[20]利用高糖溶液浸泡法建立斑馬魚糖尿病模型，研究中將斑馬魚交替暴露于無葡萄糖的水與含2%葡萄糖的水溶液中，每24 h更換一次，持續(xù)28 d，會導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)持續(xù)高血糖癥狀，在每次浸入2%葡萄糖溶液中時(shí)會重復(fù)出現(xiàn)血糖峰值。實(shí)驗(yàn)中將斑馬魚持續(xù)暴露于含糖溶液中，血糖也出現(xiàn)升高，但這種升高是短暫的，而且連續(xù)浸入糖溶液，尤其是高濃度糖溶液中，會導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)游動(dòng)及鰓功能異常，甚至出現(xiàn)死亡。

NF-κB是一類核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，能調(diào)節(jié)炎性相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生與炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB經(jīng)典與旁路兩種信號途徑均與代謝綜合癥相關(guān)，與糖尿病中胰島素抵抗及β 細(xì)胞功能異常有重要關(guān)系。在肥胖病人的肌肉組織中，NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB-inducible kinase，NIK)呈高水平狀態(tài)，說明NF-κB旁路信號途徑被活化。Malle等[12]利用藥物誘導(dǎo)提高斑馬魚幼魚體內(nèi)的NIK水平，外源性激活NF-κB旁路信號途徑，6 h后幼魚血糖水平出現(xiàn)顯著升高，說明體內(nèi)的糖平衡調(diào)節(jié)功能受到影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理組幼魚的β細(xì)胞功能出現(xiàn)異常，雖然細(xì)胞內(nèi)胰島素能正常生成，但其分泌明顯受阻。

2.3 斑馬魚糖尿病模型的評價(jià)指標(biāo)

血糖水平是反映胰腺β細(xì)胞功能的主要指標(biāo)，也是臨床糖尿病診斷或糖尿病動(dòng)物模型研究中的常用檢測指標(biāo)。Stefani等[21]對麻醉后的斑馬魚成魚取血，分別檢測了斑馬魚空腹血糖(fasting)、餐后血糖(feeding)及糖負(fù)荷值(a glucose challenge)等指標(biāo)，以研究斑馬魚體內(nèi)的糖代謝規(guī)律。發(fā)現(xiàn)斑馬魚血糖處于動(dòng)態(tài)地自我調(diào)節(jié)的狀態(tài)。禁食2 d時(shí)，血糖會出現(xiàn)應(yīng)激性升高，第3天時(shí)即回落到正常水平。注射葡萄糖后30 min內(nèi)血糖水平升高并達(dá)到峰值，在6 h時(shí)，血糖又重新回落到正常水平。在斑馬魚血糖檢測中，麻醉方法是影響血糖值的一個(gè)因素，多數(shù)麻醉劑是神經(jīng)細(xì)胞離子通道阻滯劑[22]，會直接作用于β細(xì)胞通道影響胰島素分泌。已有研究稱麻醉劑MS-222會干擾β細(xì)胞功能，引起硬骨魚血糖升高[23]。Stefani的實(shí)驗(yàn)中也顯示，MS-222麻醉組斑馬魚血糖的CV值較高，故在其研究中采用低溫麻醉法。一些脊椎動(dòng)物，包括硬骨魚在內(nèi)，血糖水平還受性別影響[23]，但Stefani實(shí)驗(yàn)中斑馬魚血糖水平未檢測出性別差異[21]。對于斑馬魚，由于其體格較小，要采集足夠體積的血液樣本比較困難[21]，因此，仍需要尋找一種更為簡易有效的胰島功能評價(jià)方法，用于斑馬魚胰腺功能及糖代謝研究。

斑馬魚是進(jìn)行糖尿病研究的理想模型，但對斑馬魚內(nèi)源性血糖水平的變化模式及胰島在血糖調(diào)節(jié)中的作用還不清楚，尤其是斑馬魚胚胎早期是否產(chǎn)生和利用糖，早期胚胎的胰島是否具有調(diào)節(jié)糖代謝功能仍是未知數(shù)。Jurczyk[13]用酶法檢測斑馬魚胚胎裂解物中的葡萄糖絕對含量，獲得了胚胎發(fā)育過程中體內(nèi)糖含量動(dòng)態(tài)變化資料。發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚發(fā)育早期，未檢測到葡萄糖存在，在16 hpf至24 hpf階段內(nèi)，胚胎體內(nèi)的葡萄糖含量逐漸上升，并在胰腺內(nèi)分泌腺分化及胰島形態(tài)發(fā)育早期達(dá)到峰值，這與鼠胚發(fā)育過程中的糖動(dòng)態(tài)變化模式非常相似。Jurczyk的研究結(jié)果也表明，在胚胎發(fā)育早期，胰島具有糖代謝調(diào)節(jié)功能。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是糖尿病人致盲的主要原因。斑馬魚的視覺系統(tǒng)與人類及其他哺乳動(dòng)物的非常相似，在斑馬魚能夠清楚的觀察到整個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞層結(jié)構(gòu), 包括從神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer)到視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層[24](圖1 B和C)，因此斑馬魚被廣泛用于視覺發(fā)育及修復(fù)研究中。Gleeson用高糖溶液暴露法建立斑馬魚糖尿病模型，并進(jìn)行DR研究。對視網(wǎng)膜形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，血糖持續(xù)升高28 d后，糖尿病模型組斑馬魚內(nèi)網(wǎng)層 (inner plexiform layer，IPL)和內(nèi)核層 (inner nuclear layer， INL)均比正常組明顯減少，IPL明顯變薄[20]，這與糖尿病患者及其他糖尿病動(dòng)物模型中的視網(wǎng)膜病變表現(xiàn)一致。因此，斑馬魚視網(wǎng)膜形態(tài)的變化，可作為斑馬魚糖尿病模型研究中的一項(xiàng)觀察指標(biāo)。

注：A 斑馬魚視網(wǎng)膜血管形態(tài)；B和C 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)分層； ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內(nèi)核層；IPL: 內(nèi)叢狀層；GL: 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；方框：視網(wǎng)膜血管覆蓋于內(nèi)界膜(the inner limiting membrane，ILM)表面。圖1 斑馬魚視網(wǎng)膜血管形態(tài)及視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)Note. A: The retinal blood vessels；B,C: Layers of the zebrafish retina；ONL: Outer nuclear layer；OPL: Outer plexiform layer；INL: Inner nuclear layer；IPL: Inner plexiform layer；GL: Ganglion cell layer；The rectangle frame indicates the inner limiting membrane (ILM).Fig.1 Morphology of the retinal blood vessels and histological structure of the zebrafish retina

在DR，高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜部位的微血管發(fā)生病變，同時(shí)，視網(wǎng)膜損害會刺激新生血管生長，形成增殖性視網(wǎng)膜病變，因此，視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)觀察是糖尿病研究中一項(xiàng)必不可少的內(nèi)容。目前，已建立了一些特異的斑馬魚血管生成模型，可以用于DR中視網(wǎng)膜血管的觀察與研究。但是斑馬魚成魚視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)比較復(fù)雜[25](圖1 A)，內(nèi)核層血管的三級靜脈叢缺失，視網(wǎng)膜靜脈系統(tǒng)也與人類的不同，因此，在利用斑馬魚進(jìn)行DR研究時(shí)要注意可能帶來的細(xì)胞或血管層面的偏差。

3 結(jié)束語

動(dòng)物模型對于研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制、確定藥物靶點(diǎn)及發(fā)現(xiàn)新的活性藥物具有重要意義。斑馬魚作為一種脊椎模式生物，具有其他模型所不具備的獨(dú)特優(yōu)勢，非常易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作及藥物實(shí)施。斑馬魚胰腺結(jié)構(gòu)簡單，利用斑馬魚模型，可以在整體動(dòng)物水平對糖尿病的病理現(xiàn)象及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析，并開展高通量藥物篩選。同時(shí)，以早期胚胎為模型，通過正向遺傳藥物篩選技術(shù)，可以確定與代謝相關(guān)的特異基因、信號途徑或活性化合物。而從斑馬魚模型上獲得的活性藥物或數(shù)據(jù)，又可以進(jìn)一步在鼠等其他動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證。

隨著基因操作技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在的研究中已將斑馬魚模型與綠色熒光轉(zhuǎn)基因技術(shù)及Tilling- 或zinc finger介導(dǎo)的靶基因突變技術(shù)結(jié)合起來，可以更深入地剖析胰腺細(xì)胞發(fā)育、生長及再生機(jī)制，并從分子水平精確分析糖尿病發(fā)病機(jī)制，以用于糖尿病造模及治療方面的研究。由此可見，在不遠(yuǎn)的將來，斑馬魚這一動(dòng)物模型，將會在包括糖尿病在內(nèi)的人類胰腺疾病的治療中發(fā)揮更重要的作用。

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Application of zebrafish models in research of diabetes

WANG Xue， HAN Li-wen， HE Qiu-xia， HAN Jian， WANG Rong-chun， CHEN Wei-yun， WANG Xi-min， HOU Hai-rong， LIU Ke-chun*
(Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

As a model organism, zebrafish have many advantages over other animal models and is suitable for studies on establishment of human disease model and mechanism. In zebrafish, there are two phases of endocrine formation during early development, which are directed by concomitant activity of many signaling pathways. Zebrafish pancreas possess similar cell structure with that of other animals, which can express various endocrine hormones including insulin. The main organs required for metabolic control, such as the pancreas, islet, and insulin sensitive tissue (muscle, liver) are conserved in zebrafish, and the mechanisms of glucose regulation in zebrafish is similar to that seen in mammalian models. These render it an excellent model to study glucose metabolism. Hyperglycemia in zebrafish model can be induced by administration of the diabetogenic drug, streptozotocin (STZ), alternatively immersion of the fish in glucose solution and water, or disturbing of signaling pathways associated with glucose metabolism. Glucose levels in adult zebrafish blood or embryo tissue and phenotype of retinal cell layers or retinal vasculature are the commonly used measurement organs in zebrafish diabetic models.

Zebrafish; Diabetes; Model organism; Pancreas; Glucose metabolism

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400979)；山東省自主創(chuàng)新重大專項(xiàng)(2014ZZCX0215)。

王雪，高級工程師，碩士，研究方向：藥物毒性評價(jià)與活性篩選。E-mail: wangxue8809@163.com

劉可春，研究員，博士，研究方向：藥物活性篩選。E-mail: hliukch@sdas.org

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.001

2016-11-03