王彥剛，汲廣徐，殷學(xué)富，王 磊

(山東省臨沂市莒南縣人民醫(yī)院胸外科 276600)

膜聯(lián)蛋白Ⅱ、乙酰肝素酶在中早期非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

王彥剛，汲廣徐，殷學(xué)富，王 磊△

(山東省臨沂市莒南縣人民醫(yī)院胸外科 276600)

目的 探討膜聯(lián)蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)、乙酰肝素酶(HPA)在中早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)情況及臨床意義。方法 收集2011年1月至2013年1月該院收治的100例中早期NSCLC患者，采用開胸肺葉切除術(shù)進(jìn)行手術(shù)治療，檢測所有患者NSCLC組織及癌旁正常組織中Annexin Ⅱ、HPA的表達(dá)情況，采用SYBR GreenⅠ實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測HPA mRNA及Annexin Ⅱ在患者NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，并比較術(shù)后復(fù)發(fā)率及3年生存率。結(jié)果 在NSCLC癌組織和癌旁正常肺組織中均檢測到HPA mRNA及Annexin Ⅱ的表達(dá)。HPA mRNA及Annexin Ⅱ在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。Annexin Ⅱ和HPA的高表達(dá)與腫瘤病理類型、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(均P<0.05)，與患者年齡、性別無關(guān)(均P>0.05)。Annexin Ⅱ、HPA的表達(dá)與肺癌的復(fù)發(fā)率及患者3年生存率存在性相關(guān)。結(jié)論 Annexin Ⅱ、HPA在中早期NSCLC中高表達(dá)，其可以作為NSCLC預(yù)后評價的指標(biāo)。

癌,非小細(xì)胞肺；生存率；膜聯(lián)蛋白Ⅱ；乙酰肝素酶;預(yù)后

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率分別居各類惡性腫瘤的第2位和第3位[1]。對于中早期肺癌患者，手術(shù)無疑是目前最理想的治療措施。Li等[2]對NSCLC患者進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果顯示在中早期行手術(shù)切除的患者，其3年生存率為75%，而單純放化療或姑息治療的患者3年生存率僅為48%。

膜聯(lián)蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)是近來年發(fā)現(xiàn)的一種早期肺癌診斷的腫瘤標(biāo)記物，其在肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮著重要作用。國外亦有研究證實(shí),Annexin Ⅱ可以作為肺癌療效評估的指標(biāo)之一[3]。乙酰肝素酶(HPA)是目前發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一可以降解硫酸乙酰肝素活性的葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，通過釋放個性化肝素結(jié)合型的生長因子誘導(dǎo)血管的生成，從而為惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[4]。

本研究對醫(yī)院收治的中早期NSCLC患者均進(jìn)行開胸肺葉切除術(shù)，并進(jìn)一步檢查肺組織Annexin Ⅱ及HPA水平，旨在為中早期NSCLC的手術(shù)治療及預(yù)后指標(biāo)的選擇提供參考，現(xiàn)將研究成果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，選擇2011年1月至2013年1月本院收治的100例中早期NSCLC患者作為研究對象，其中男52例，女48例，年齡25～78歲，平均(61.3±4.1)歲；腺癌37例，鱗癌51例，腺鱗癌12例；病變部位在右肺上葉21例，右肺中下葉34例，左肺上葉13例，左肺下葉32例；瘤最大徑0.7～3.8 cm，平均(2.3±0.3)cm；其中臨床分期Ⅰb期24例，Ⅱa期54例，Ⅱb期22例。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前超聲、CT等檢查及術(shù)后病理切片證實(shí)為NSCLC；②按照美國癌癥聯(lián)合委員會[5](American Joint Committeeon Cancer,AJCC)NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)均為Ⅰ～Ⅱ期；③術(shù)前卡氏評分大于或等于60分；④患者及家屬獲知手術(shù)方案，并簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實(shí)為腺樣囊性癌、黏液表皮樣癌或類癌者；②既往接受過放療、化療或手術(shù)治療者；③合并有其他惡性腫瘤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④凝血功能異常、心肺功能不全或身體狀況無法耐受手術(shù)者。

1.2 方法 鼠抗人Annexin Ⅱ抗體購自武漢博士德公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，HPA ELISA試劑盒購自BD公司。按照S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；染色前組織標(biāo)本用微波高溫抗原修復(fù)，滴加兔抗人Annexin Ⅱ一抗(1∶1 500)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，再滴加羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酸性乙醇梯度洗脫，中性樹膠封片。對于HPA的測定步驟按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。采用SYBR GreenⅠ實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測HPA mRNA及Annexin Ⅱ mRNA在患者NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)水平。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)：顯微鏡下觀察，以細(xì)胞染色呈棕黃色，且染色強(qiáng)度明顯高于背景色判為陽性，每張切片隨機(jī)觀察10個400倍視野。按照染色強(qiáng)度計(jì)分，0分：無染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。按照染色面積計(jì)分，0分：細(xì)胞染色面積小于5%；1分：細(xì)胞染色面積5%～25%；2分：細(xì)胞染色面積26%～50%；3分：細(xì)胞染色面積大于50%[6-7]。以兩種計(jì)分結(jié)果乘積作為最終得分，參考標(biāo)準(zhǔn)：0～1分判為陰性(-)；2～3分判為弱陽性(+)；4～5分判為中等陽性(++)；≥6分判為強(qiáng)陽性(+++)；弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性均為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪 對所有患者均進(jìn)行3年隨訪，隨訪截止日期為2016年2月，隨訪采取門診復(fù)查、電話回訪等方式，起始日期以術(shù)后第2天開始計(jì)算，記錄兩組患者3年生存率、復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。

2 結(jié) 果

2.1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織及癌旁組織中的表達(dá) NSCLC組織Annexin Ⅱ陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(P=0.000)，肺癌組織中Annexin Ⅱ蛋白主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，而癌旁正常組織僅在細(xì)胞質(zhì)中有低表達(dá)，見表1、圖1。

表1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(n)

A：癌旁正常組織，B：NSCLC組織

圖1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 HPA mRNA在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(dá) NSCLC組織HPA mRNA(63.18±4.39)ng/mL的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織(40.12±3.72)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 HPA和Annexin Ⅱ的高表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 HPA和Annexin Ⅱ的高表達(dá)與腫瘤病理類型、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(均P<0.05)，與患者年齡、性別無關(guān)(均P>0.05)，見表2。

表2 HPA和Annexin Ⅱ的高表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系(n)

續(xù)表2 HPA和Annexin Ⅱ的高表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系(n)

2.4 隨訪 全部患者隨訪1～36個月，中位隨訪時間18.9個月；有效隨訪91例，失訪率9.0%(9/100)，局部復(fù)發(fā)率13.0%(13/100)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率21.0%(21/100)，3年生存率為57.6%，Annexin Ⅱ陽性表達(dá)患者3年生存率為35.1%，陰性表達(dá)患者3年生存率為58.7%，Annexin Ⅱ陰性表達(dá)者3年生存率顯著高于陽性表達(dá)者(P=0.001)，見圖2。HPA高表達(dá)的患者3年生存率(25.1%)明顯低于低表達(dá)(45.7%)的患者(P=0.000)，見圖3。

1：Annexin Ⅱ陰性表達(dá)組；2：Annexin Ⅱ陽性表達(dá)組

圖2 不同Annexin Ⅱ表達(dá)肺癌患者生存曲線

1：HPA低表達(dá)組；2：HPA高表達(dá)組

圖3 不同HPA表達(dá)量肺癌患者生存曲線

3 討 論

目前對肺癌預(yù)后評價依然缺乏有效的生物指標(biāo)，臨床上更多依賴于影像學(xué)觀察，而一旦確診復(fù)發(fā)，會使治療難度進(jìn)一步加大。

Annexin Ⅱ是膜聯(lián)蛋白家族新發(fā)現(xiàn)的成員，大量研究均證實(shí)Annexin Ⅱ與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[6，8]。de Graauw等[7]報(bào)道稱Annexin Ⅱ在肺癌中高表達(dá)，且與分化程度呈負(fù)相關(guān)。本研究中，肺癌組織Annexin Ⅱ陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，說明肺癌組織中Annexin Ⅱ高表達(dá)，這亦為Annexin Ⅱ作為預(yù)后評價指標(biāo)提供了基礎(chǔ)。岳紅梅等[9]報(bào)道稱Annexin Ⅱ介導(dǎo)纖維蛋白酶的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步激活基質(zhì)金屬蛋白激酶，并使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解，使組織屏障發(fā)生破壞，腫瘤侵襲性增加。這也從另一方面證實(shí)Annexin Ⅱ與肺癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Annexin Ⅱ?qū)SCLC預(yù)后的影響，本研究對Annexin Ⅱ表達(dá)陽性和陰性患者3年生存率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Annexin Ⅱ表達(dá)陽性患者3年生存率為35.1%，表達(dá)陰性患者3年生存率為58.7%，Annexin Ⅱ表達(dá)陰性者3年生存率顯著高于表達(dá)陽性者。說明Annexin Ⅱ表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，術(shù)后切片分析Annexin Ⅱ表達(dá)情況，能夠?yàn)樵u價患者遠(yuǎn)期預(yù)后提供一定幫助。

正常情況下，HPA表達(dá)主要限于胎盤、免疫器官和免疫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在其他組織及器官中低表達(dá)或者不表達(dá)，但在炎癥、損傷或者惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等多種病理改變中HPA會出現(xiàn)明顯的高表達(dá)[10]。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HPA在乳腺癌[11]、食管癌[12]、宮頸癌[13]中存在明顯的高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA方法檢測中早期NSCLC組織及癌旁正常組織中HPA mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在肺癌組織中HPA的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，說明HPA的高表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生有關(guān)。本研究還進(jìn)一步分析了HPA相對表達(dá)量與NSCLC的復(fù)發(fā)及3年生存率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HPA的表達(dá)量與腫瘤患者的術(shù)后復(fù)發(fā)及生存期密切相關(guān)，HPA表達(dá)量越高，患者術(shù)后復(fù)發(fā)的概率越大，3年生存率越低，這可能與HPA參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，Annexin Ⅱ及HPA可以作為NSCLC預(yù)后評價的有效指標(biāo)。

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王彥剛(1966-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事胸外科相關(guān)研究。

△通信作者，E-mail:Cerebrm99@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.040

R734.2

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1671-8348(2017)23-3288-04

2017-04-18

2017-05-16)

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