王 威，謝巖黎

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州450001）

蒜氨酸酶與凝集素的分離純化及質(zhì)譜鑒定分析

王 威，謝巖黎*

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州450001）

對大蒜中的蒜氨酸酶和凝集素分離純化并進(jìn)行質(zhì)譜分析。首次采用DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換層析法對大蒜中蒜氨酸酶和凝集素進(jìn)行了分離純化，并采用SDS－PAGE電泳、MALDI－TOF/MS質(zhì)譜法對目標(biāo)蛋白進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：以Tris－HCl作為浸提液，經(jīng)DEAESepharose Fast Flow柱純化的蒜氨酸酶和凝集素可達(dá)到電泳純，質(zhì)譜結(jié)果表明，所分離目標(biāo)物質(zhì)為蒜氨酸酶和大蒜凝集素，其分子質(zhì)量分別為54.147 ku和12.152 ku。

蒜氨酸酶；大蒜凝集素；分離純化；質(zhì)譜分析

0 引言

大蒜原產(chǎn)于西亞、中亞，與洋蔥、蔥、韭菜等屬于百合科蔥屬植物（Allium tuberosum）。大蒜味辛性溫，風(fēng)味獨特，是常見的飲食調(diào)味品，其營養(yǎng)組分多樣，種類較為齊全，含有大量對人體健康有益的物質(zhì)，如維生素、氨基酸、微量元素、含硫有機(jī)物、肽類和苷類等，具有很好的藥理活性和豐富的營養(yǎng)價值[1]。

凝集素（lectin）是一類能夠使細(xì)胞凝集的糖蛋白，具有高度的糖結(jié)合專一性，是生命科學(xué)和臨床科學(xué)常用的研究工具，廣泛應(yīng)用于刺激淋巴細(xì)胞分裂、腫瘤治療、艾滋治療等分子與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞相互作用中[2]。據(jù)Smeets等[3]報道大蒜凝集素的等電點為4.94。

蒜氨酸酶（Alliinase）在自然狀態(tài)下，穩(wěn)定地存在于細(xì)胞液泡中，與在蔥[4]、洋蔥[5]、韭菜[6]中發(fā)現(xiàn)的蒜氨酸酶具有較高的同源性，風(fēng)味物質(zhì)蒜素（Alliin）是經(jīng)大蒜組織破裂后，液泡中的蒜氨酸酶進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，作用于其中的蒜氨酸而形成的。且蒜素對環(huán)境較敏感，易分解，從大蒜中直接分離蒜素十分困難。因此有學(xué)者考慮通過從大蒜中分離蒜氨酸酶和蒜氨酸生產(chǎn)純品蒜素以保持其生物活性，Kao等[7]在磷酸鹽緩沖體系中采用 HiTrap Q Sepharose離子交換法，分離純化蒜氨酸酶，N端氨基酸測序為 KMTWTMKAAEEAEAVAN。據(jù) Rabimkov等[8]的報道，蒜氨酸酶的等電點為6.35。為此筆者以Tris－HCI為浸提液提取大蒜粗蛋白溶液，利用DEAE－Sepharose Fast Flow樹脂做進(jìn)一步的分離純化，并通過SDS－PAGE電泳和MALDITOF/MS質(zhì)譜法對蒜氨酸酶和凝集素進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜產(chǎn)自河南中牟；DEAE－Sepharose Fast Flow、SDS－PAGE試劑盒、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97 ku）、考馬斯亮藍(lán) R250、G250、Tris購自索萊寶（Solarbio）；溴酚藍(lán)、甘氨酸等購自天津科密歐；石油醚、鹽酸、SDS、β－巰基乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGT－10C真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；B13－3型智能恒溫定時磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；DHL－2電腦恒流泵、HD－9707電腦紫外檢測儀、DBS－160F 電腦自動部分收集器：上海精科實業(yè)有限公司；UV－6100雙光束紫外分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；EPS－300電泳儀、VE 180微型垂直電泳槽、Tanon 2500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；5800 MALDI－TOF/TOF串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜脫脂

將新鮮大蒜剝皮、洗凈、切薄片。真空冷凍干燥后粉碎，用石油醚脫脂。

1.3.2 蛋白浸提

將脫脂大蒜粉末與Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）料液比為 1∶5混合，4℃磁力攪拌 4 h后，4℃，6 000 g離心 40 min，沉淀部分用 Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）反復(fù)浸提 2次。

1.3.3 蒜氨酸酶和凝集素的純化

采用陰離子交換樹脂 DEAE－Sepharose Fast Flow（Φ1.0 cm×30 cm）分離純化，用 Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）平衡柱子，待柱子洗脫平衡后，添加15 mL大蒜粗蛋白溶液，并用Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）進(jìn)行洗脫，洗脫至基線；然后用含 0～0.2 mol/L NaCl的 Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）連續(xù)梯度洗脫，流速為 1.5 mL/min，6 mL/管，紫外吸收法(A280nm)在線檢測。

1.3.4 SDS－PAGE分離蛋白

采用不連續(xù)SDS－PAGE電泳法分離蒜氨酸酶和凝集素，將收集到的蛋白溶液對應(yīng)收集峰分別取樣，濃縮膠含量為12%，分離膠含量為5%，膠厚為1.7 mm。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定

將目標(biāo)蛋白條帶從電泳膠中切下，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入400 μL NH4HCO3/30%ACN脫色液，多次清洗，直至將目標(biāo)蛋白條帶的顏色洗至透明，棄去脫色液，加入100 mmol/L NH4HCO3，室溫下孵育15 min。棄去上清液，真空冷凍干燥后，加入 5 μL 10 ng/μL測序級 Trypsin溶液，37℃反應(yīng)過夜。酶解液轉(zhuǎn)入新的離心管中，原管中加入100 μL 60%ACN/0.1%TFA，超聲15 min，合并酶解液，凍干。

取2 μL 20%乙腈加入到酶解樣品中，復(fù)溶。取1 μL復(fù)溶樣品，點樣于樣品靶上，溶劑自然干燥后，再取0.5 μL過飽和CHCA基質(zhì)溶液（溶劑為50%ACN 0.1%TFA）點至對應(yīng)靶位上并自然干燥、氮氣吹凈。放入串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀分析。

質(zhì)譜檢測條件設(shè)置為正離子檢測、反射模式，一級質(zhì)譜肽段掃描范圍設(shè)置為800～4 000。使用Data Explorer軟件將所得的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將分析結(jié)果與Mascot數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換層析分離純化蒜氨酸酶和凝集素

在本試驗中，以Tris－HCl作為浸提液、DEAESepharose Fast Flow陰離子交換層析法從大蒜粗蛋白溶液中分離純化蒜氨酸酶和凝集素，其層析曲線見圖 1（A），電泳鑒定結(jié)果見圖 1（B）。

電泳泳道1（對應(yīng)圖1（A）中收集峰）中的雜蛋白為在pH 7.2的條件下帶正電荷，與DEAESepharose Fast Flow樹脂無親和力而被Tris－HCl緩沖液直接洗脫下來。

將NaCl濃度增大到0.05 mol/L時，出現(xiàn)洗脫峰2。從SDS－PAGE電泳圖中發(fā)現(xiàn)洗脫峰2對應(yīng)的蛋白液中含有一條高純度的蛋白條帶（圖1泳道2），分子質(zhì)量約 54 ku，這與 Rabimkov等[8]報道的蒜氨酸酶分子質(zhì)量數(shù)據(jù)相吻合，灰度掃描該蛋白純度大于90%，將通過質(zhì)譜做進(jìn)一步的鑒定。

圖1 陰離子交換層析法分離純化蒜氨酸酶和大蒜凝集素Fig.1 Anion－exchange chromatography on DEAE－Sepharose Fast Flow of garlic alliinase and lectin

繼續(xù)加大NaCl濃度，出現(xiàn)洗脫峰3，收集該蛋白液，其中發(fā)現(xiàn)純度較高且分子質(zhì)量為12 ku的蛋白，即為大蒜凝集素，與Smeets等[3]報道的大蒜凝集素分子質(zhì)量數(shù)據(jù)相吻合，灰度掃描該蛋白純度大于95%，將通過質(zhì)譜做進(jìn)一步的鑒定。

2.2 蒜氨酸酶質(zhì)譜分析

將圖2泳道2的目標(biāo)條帶切下，對目標(biāo)條帶進(jìn)行酶解，將酶解后所得的肽段使用美國AB SCIEX公司的MALDI－TOF－TOF串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，得到一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖 2（A）），再根據(jù)該質(zhì)譜圖的信號源，選擇其中信號較強(qiáng)的一個肽段再次進(jìn)行分析，獲得二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將所獲得的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索比對，發(fā)現(xiàn)本試驗純化所得的蛋白與數(shù)據(jù)庫中蒜氨酸酶（序列號ACN78838.1）蛋白相匹配。匹配度為100%(圖略)，分子質(zhì)量為54.147 ku。而根據(jù)二級質(zhì)譜圖（1 402.8 u信號源），所得氨基酸序列VVAHAPFYPVFR與Kao等[7]所報道蒜氨酸酶序列196～207相同。

圖2 蒜氨酸酶質(zhì)譜圖Fig.2 The MALDI－TOF/MS spectrum of alliinase

2.3 大蒜凝集素的質(zhì)譜鑒定

操作同2.2，鑒定圖1（B）泳道3中的分子質(zhì)量約為12 ku的目標(biāo)蛋白，發(fā)現(xiàn)與NCBInr數(shù)據(jù)庫中大蒜凝集素（序列號AAA32643.1）蛋白相匹配。匹配度為100%（圖略），分子質(zhì)量12.152 ku。而根據(jù)二級質(zhì)譜圖（1 839.9 u信號源），所得氨基酸序列AVLQSDGNFVVYDAEGR與Smeets等[3]所報道蒜氨酸酶55～71序列相同。

圖3 凝集素質(zhì)譜圖Fig.3 The MALDI－TOF/MS spectrum of lectin

3 討論

試驗結(jié)果表明，以Tris－HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.2）作為浸提液浸提大蒜粗蛋白溶液，利用DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換層析法、SDS－PAGE電泳鑒定進(jìn)一步分離粗蛋白溶液中的蒜氨酸酶和大蒜凝集素，具有較高的純度，分別達(dá)到了90%、95%，均達(dá)到電泳純，目標(biāo)蛋白條帶經(jīng)質(zhì)譜分析、軟件分析所得一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)一步鑒定經(jīng)此方法分離的蛋白質(zhì)為蒜氨酸酶和大蒜凝集素，蒜氨酸酶分子質(zhì)量為54.147 ku，大蒜凝集素分子質(zhì)量為12.152 ku。

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THE PURIFICATION OF ALLIINASE AND LECTIN AND MASS SPECTROMETRY SPECTROMETRY IDENTIFICATION

WANG Wei，XIE Yanli
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

In this study，alliinase and lectin were extracted and purified from garlic and their mass spectrometry identification was also investigated.Garlic alliinase and lectin was isolated by Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography，and the target proteins were identified by SDS-PAGE and MALDI-TOF/MS.The results indicated that the purity of alliinase and lectin reached 90%and 95%respectively and was qualified for electrophoresis analysis by DEAE-Sepharose Fast Flow column purification using Tris-HCl （50 mmol/L，pH7.2） as an extract.The results of mass spectrometry showed that the target substances were alliinase and lectin with molecular weight of 54.147 ku and 12.152 ku respectively.

alliinase；lectin of garlic；isolation and purification；mass spectrometry

TS201.2

：B

1673－2383(2017)04－0020－04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.008.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017－8－28 8:57:13

2017－01－14

國家重點研發(fā)計劃專項課題（2016YFD0400203）

王威（1993—），男，河南周口人，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。

*通信作者