任順成，孫曉莎，陳茹雪

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

蘆丁、槲皮素對小麥蛋白的熒光猝滅作用

任順成，孫曉莎，陳茹雪

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

采用熒光光譜法，研究不同濃度的蘆丁和槲皮素對小麥蛋白內(nèi)源熒光的猝滅作用。結(jié)果表明：隨著蘆丁、槲皮素溶液濃度的增加，小麥清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的內(nèi)源熒光強度均逐漸降低，猝滅類型為靜態(tài)，表明蘆丁、槲皮素分別和4種小麥蛋白形成了新的復(fù)合物。相比于蘆丁，槲皮素對4種小麥蛋白熒光猝滅作用更強。蘆丁猝滅4種小麥蛋白內(nèi)源熒光強弱順序依次為：清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白；槲皮素猝滅4種小麥蛋白內(nèi)源熒光強弱順序依次為：谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白＞清蛋白。

熒光光譜法；蘆丁；槲皮素；小麥蛋白

0 引言

藥理研究表明，苦蕎麥具有治療糖尿病、降血糖、降低血脂以及抗氧化等作用[1－2]，作為苦蕎麥中的重要黃酮物質(zhì)——蘆丁和槲皮素，被證實對人體具有醫(yī)療保健的功效，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥開發(fā)[3－4]。

小麥蛋白包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，在不同溶劑中，4種蛋白質(zhì)的溶解性不同。由于蕎麥粉常被用來和小麥粉混合食用，蕎麥中的蘆丁和槲皮素與小麥蛋白之間的相互作用，會引起小麥蛋白結(jié)構(gòu)特性和功能特性的改變，如起泡性和乳化性。這種相互作用使得黃酮類化合物與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈形成復(fù)合物，主要結(jié)合力類型是氫鍵和疏水作用[5]，且兩者之間的相互作用受到黃酮類化合物的水溶性[6]、大小和結(jié)構(gòu)[7]、蛋白質(zhì)的大小、氨基酸組成以及結(jié)構(gòu)[8－9]等多種因素的影響。

由于蛋白質(zhì)分子具有熒光性，因此利用熒光光譜分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、特性的研究越來越多。分子熒光光譜分析具有靈敏度高、選擇性強、用量少、操作簡便等特點[10]，在生命科學中的應(yīng)用較多，如多種氨基酸的分析[11]、酶[12]和蛋白質(zhì)[13]作用研究等。但目前有關(guān)蘆丁和槲皮素對小麥蛋白的熒光猝滅研究較少，因此此次利用熒光光譜法，研究不同濃度蘆丁和槲皮素分別對4種小麥蛋白質(zhì)——清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的熒光猝滅類型和猝滅強度差異，比較兩者結(jié)合作用的強弱，為了解蘆丁和槲皮素與小麥蛋白的相互作用，以及兩者在小麥蛋白質(zhì)制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘆?。?7%）、槲皮素（95%）：上海源葉生物有限公司；甲醇（AR）：天津市科密歐化學試劑有限公司；Tris（AR）：上海山浦化工有限公司；鹽酸（36.0%～38.0%）：洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RF－5301PC型熒光分光光度計：日本島津公司；PHS－3C型雷磁酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；HZT－B5000型電子天平：福州華志科學儀器有限公司；FA1004數(shù)顯電子分析天平：上海上平儀器公司；GL－88B型漩渦混勻器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥蛋白的分離提取

以小麥面粉為試驗原料，利用Osborne法分級提取小麥蛋白，試驗流程如圖1所示。采用磁力攪拌器攪拌并控制試驗過程溫度。上清液A、B、C、D中分別含有小麥清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。采用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮蛋白提取液。

圖1 Osboren法分級提取小麥蛋白流程Fig.1 The flow chart of wheat protein extracted by Osboren method

1.3.2 蘆丁和槲皮素對小麥蛋白的熒光猝滅光譜和猝滅效應(yīng)的Stern－Volmer曲線測定

用少量乙醇溶解一定量的蘆丁和槲皮素，將其配制成1×10－5mol/L溶液；將4種蛋白溶液稀釋配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%的分散溶液，置于4℃下冷存，備用。取9支試管，均加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的小麥蛋白溶液后，每支試管再分別加入0～8 mL的蘆丁溶液，最后用Tris－HCl(pH=7.40)緩沖液稀釋定容至10 mL；系列濃度的槲皮素溶液配制同蘆丁。用漩渦混勻器混勻后，置于37℃恒溫水浴鍋中溫浴45 min，固定激發(fā)波長為280 nm，熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)為5 nm，掃描290～450 nm范圍內(nèi)的熒光光譜，測蕎麥蘆丁、槲皮素溶液對小麥蛋白的內(nèi)源熒光猝滅光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素和蘆丁對小麥蛋白的熒光猝滅光譜測定

圖2—圖9為槲皮素和蘆丁分別對4種小麥蛋白的熒光強度猝滅光譜圖。由圖2—圖9可知，小麥蛋白溶液的濃度不變，隨著槲皮素、蘆丁溶液濃度的增加，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的內(nèi)源熒光強度均逐漸降低，表明蕎麥槲皮素、蘆丁能有效猝滅小麥蛋白的內(nèi)源熒光；最大發(fā)射峰位置藍移，表明槲皮素、蘆丁與小麥蛋白發(fā)生了相互作用，使小麥蛋白分子的熒光發(fā)色團微環(huán)境和空間構(gòu)象發(fā)生了變化，進而使色氨酸周圍的微環(huán)境疏水性更強，肽鏈伸展性降低[14]。分別對比圖2和圖 3、圖 4和圖 5、圖 6和圖 7、圖 8和圖 9，可知槲皮素對4種小麥蛋白熒光強度的猝滅程度均強于蘆丁。

早期研究表明多酚和蛋白質(zhì)的結(jié)合主要形式為氫鍵，然而深入研究發(fā)現(xiàn)，兩者的結(jié)合方式不止為氫鍵相互作用，疏水鍵也為一種重要的相互作用形式。影響兩者結(jié)合的影響因素包括蛋白質(zhì)和多酚兩個層面：分子質(zhì)量較大，結(jié)構(gòu)開放松散，脯氨酸或其他疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)和多酚親和性較高[15]；多酚的酚羥基和疏水基數(shù)量多者，具有柔性的分子構(gòu)型者以及水溶性低者，親和性較高，同時多酚的分子大小也會影響親和性[6]。由于槲皮素較蘆丁的水溶性更低，但酚羥基含量相同，因此前者對4種小麥蛋白的熒光強度影響較大。同時，有研究表明：植物多酚和蛋白質(zhì)的共價或非共價結(jié)合可使蛋白質(zhì)免于自由基的攻擊，兩者是通過氨基酸側(cè)鏈和多酚芳香環(huán)之間的各種弱作用力，一般是疏水相互作用，因此結(jié)合主要發(fā)生在暴露的疏水性表面[16－17]。蛋白質(zhì)的熒光發(fā)色基團主要為能吸收270～300 nm紫外光的酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸殘基[10]。

有研究表明：多酚能夠增強蛋白質(zhì)的多種功能特性，可作為奶制品的功能特性改良劑[6]，如兒茶素與蛋白質(zhì)形成了疏水鍵和氫鍵，因而有效增強了β－乳球蛋白的發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性，咖啡酸能增強牛奶的穩(wěn)定性；作為供體的多酚和作為受體的蛋白質(zhì)的結(jié)合是分子識別的典型例子；在食品工業(yè)方面，利用兩者的絡(luò)合作用可實現(xiàn)對多種蛋白質(zhì)的回收。因此，蘆丁和槲皮素與蛋白質(zhì)的相互作用可有效改善小麥蛋白的多種功能特性，大大提高小麥蛋白資源的利用率。

2.2 蘆丁和槲皮素對小麥蛋白熒光猝滅效應(yīng)的Stern-Volmer曲線測定

熒光猝滅過程可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞使光的強度減弱，而靜態(tài)猝滅是指處于基態(tài)熒光分子與猝滅劑之間形成不發(fā)光的復(fù)合物。動態(tài)猝滅可由Stern-Volmer方程表示。

圖2 槲皮素溶液濃度對清蛋白熒光強度的影響Fig.2 Effect of quercetion solution concentration on the fluorescence intensity of wheat albumin

圖3 蘆丁溶液濃度對清蛋白熒光強度的影響Fig.3 Effect of rutin solution concentration on the fluorescence intensity of wheat albumin

圖4 槲皮素溶液濃度對球蛋白熒光強度的影響Fig.4 Effect of quercetion solution concentration on the fluorescence intensity of wheat globulin

圖5 蘆丁溶液濃度對球蛋白熒光強度的影響Fig.5 Effect of rutin solution concentration on the fluorescence intensity of wheat globulin

圖6 槲皮素溶液濃度對醇溶蛋白熒光強度的影響Fig.6 Effect of quercetion solution concentration on the fluorescence intensity of wheat gliadin

圖7 蘆丁溶液濃度對醇溶蛋白熒光強度的影響Fig.7 Effect of rutin solution concentration on the fluorescence intensity of wheat gliadin

圖8 槲皮素溶液濃度對谷蛋白熒光強度的影響Fig．8 Effect of quercetion solution concentration on the fluorescence intensity of wheat glutenin

圖9 蘆丁溶液濃度對谷蛋白熒光強度的影響Fig.9 Effect of rutin solution concentration on the fluorescence intensity of wheat glutenin

式中：F0為無猝滅劑情況下的熒光強度；F為猝滅劑存在時的熒光強度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，L·mol-1·s-1，τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[18]；KSV為Stern-Volmer常數(shù)；[Q]為猝滅劑（蘆丁或槲皮素）溶液的濃度。Stern-Volmer方程表明，F(xiàn)0/F與猝滅劑的濃度具有線性關(guān)系，若以F0/F對[Q]作圖可得一條直線，從而求出直線的斜率KSV。

靜態(tài)猝滅的方程為：

這個關(guān)系式與動態(tài)猝滅的相似，只是猝滅常數(shù)被配合物的形成常數(shù)K所替代。兩種猝滅方式的區(qū)別是：動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，所以其吸收光譜不改變，但基態(tài)配合物卻能引發(fā)熒光物質(zhì)吸收光譜的變化。

先假設(shè)蘆丁、槲皮素和小麥蛋白的相互作用為動態(tài)猝滅方式，根據(jù)Stern-Volmer方程，以[Q]為自變量，F(xiàn)0/F為因變量，通過線性擬合得圖10、圖11，由圖中直線的斜率和τ0可得到不同濃度下蘆丁和槲皮素與小麥蛋白相互作用的KSV和Kq，結(jié)果見表1。

結(jié)合圖10、圖11、表1可看出，蘆丁和槲皮素對小麥面粉中的4種蛋白溶液內(nèi)源熒光均有猝滅作用，但猝滅強度不同。蘆丁和槲皮素對小麥蛋白的雙分子猝滅常數(shù)Kq均遠遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散常數(shù) 2.00×1010L·mol-1·s-1，因此，其猝滅類型為靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞使光的強度減弱，兩者之間并不形成復(fù)合物，而靜態(tài)猝滅是指處于基態(tài)熒光分子與猝滅劑之間形成不發(fā)光的復(fù)合物，由此可知，蘆丁和槲皮素均與4種小麥蛋白發(fā)生了化學作用，形成了新的復(fù)合物。蘆丁對小麥4種蛋白的結(jié)合作用強度強弱為清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白；槲皮素對小麥4種蛋白的結(jié)合作用強度強弱為谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白＞清蛋白。

圖10 蘆丁溶液對小麥蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer方程曲線Fig.10 The Stern-Volmer linear plot of fluorescence quenching of wheat protein by rutin solution

圖11 槲皮素溶液對小麥蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer方程曲線Fig.11 The Stern-Volmer linear plot of fluorescence quenching of wheat protein by quercetion solution

表1 蘆丁、槲皮素與小麥蛋白相互作用的Kq與KSV值Table 1 The Kqand KSVof rutin and quercetion interact with wheat protein

比較蘆丁對4種蛋白熒光猝滅強度可知，蘆丁對清蛋白的內(nèi)源熒光猝滅強度最大，其次是谷蛋白和醇溶蛋白，對球蛋白的熒光猝滅強度最小。同種多酚對不同蛋白質(zhì)的親和力不同，分子質(zhì)量較大，結(jié)構(gòu)開放松散，脯氨酸或其他疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)和多酚親和性較高，清蛋白分子呈球形，表面有孔，且溶解度大；谷蛋白分子質(zhì)量較大，呈纖維狀，不溶于水[19]，是大分子聚合體，結(jié)構(gòu)松散；醇溶蛋白分子質(zhì)量較小，呈球狀，是單體蛋白，組成多為非極性氨基酸，分子內(nèi)有二硫鍵；球蛋白表面疏松，分子質(zhì)量較小，易溶于水，經(jīng)側(cè)鏈環(huán)境分析得知酪氨酸殘基趨于全部暴露于溶劑中，而其色氨酸趨向于埋藏。由此可知，蘆丁對分子質(zhì)量大的蛋白熒光猝滅效果更加明顯，可歸因于此類蛋白質(zhì)中顯色基團較多；槲皮素對不溶于水的蛋白質(zhì)猝滅效果更加明顯，因此槲皮素對疏水性氨基酸含量高的小麥蛋白親和性較強。

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究蘆丁和槲皮素對小麥蛋白的熒光猝滅作用。結(jié)果表明：隨著蘆丁、槲皮素溶液濃度的增加，小麥清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的內(nèi)源熒光強度均逐漸降低，猝滅類型為靜態(tài)，槲皮素較蘆丁對小麥蛋白的熒光猝滅作用更強。蘆丁猝滅4種小麥蛋白內(nèi)源熒光強弱順序依次為清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白；槲皮素猝滅的強弱順序依次為谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白＞清蛋白。

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FLUORESCENCE QUENCHING OF WHEAT PROTEIN BY RUTIN AND QUERCETIN

REN Shuncheng，SUN Xiaosha，CHEN Ruxue
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

The interaction between rutin and quercetin and wheat protein can cause the changes of structural and functional characteristics of wheat protein，such as foaming and emulsifying properties.The effect of different concentrations of rutin and quercetin on endogenous fluorescence quenching of wheat protein was investigated by fluorescence spectroscopy.The results showed that the endogenous fluorescence intensity of wheat albumin，globulin，gliadin and glutenin decreased gradually with the increase ofrutin and quercetin solution concentrations，and the quenching type was static，which indicating that a new complex formed with rutin or quercetin and wheat proteins.Compared with rutin，quercetin had stronger effect on fluorescence quenching of four wheat proteins.The order of endogenous fluorescence intensity of four kinds of wheat protein quenching by rutin was as follows:albumin＞ glutenin＞ gliadin＞ globulin；while the order of endogenous fluorescence intensity quenching by quercetin was as follows:glutenin＞gliadin＞globulin＞albumin.Therefore,the fluorescence quenching effect of rutin was more obvious on the protein with higher relative molecular weight；which was attributed to this type of protein with more color groups；the quenching effect of quercetin on the protein insoluble in water was better，suggesting that the affinity of quercetin to wheat protein with high hydrophobic amino acid content was stronger.

fluorescence spectroscopy；rutin；quercetin；wheat protein

TS201.2

：B

1673－2383(2017)04－0001－05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.002.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017－8－28 8:57:11

2016－12－06

任順成（1963—），男，山東東明人，教授，研究方向為食品營養(yǎng)與功能食品。