謝新華，毋修遠(yuǎn)，仵心軍，郝明遠(yuǎn)，范逸超，邢彩云，薛振丹

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄭州450002 2 鄭州市食品藥品檢驗所 鄭州450003）

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉，被認(rèn)為是控制小麥制品的最重要的組成部分，并對其加工性能起主要作用[1]。谷蛋白和麥醇溶蛋白是小麥面筋蛋白中兩種主要蛋白，占小麥總蛋白的85%以上，其充分吸水可形成蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其面筋蛋白具有彈性及黏性等特質(zhì)，并直接影響面制品品質(zhì)[2]。谷蛋白是由多個亞基通過鏈外二硫鍵聚合形成的聚合體蛋白，分子質(zhì)量約40～300 ku，其中包含低分子質(zhì)量（LMW）和高分子質(zhì)量（HMW）谷蛋白亞基，同時谷蛋白在控制面團(tuán)彈性和強(qiáng)度方面起著關(guān)鍵作用[3]?，F(xiàn)階段有研究表明，冷凍面團(tuán)中面筋蛋白的劣變可能是谷蛋白聚合物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量分布以及因冷凍引起的構(gòu)象重排和水再分配等原因所致。先前的研究也表明凍藏期間谷蛋白大分子（GMP）會出現(xiàn)不同程度的解聚現(xiàn)象[4]，從而影響面團(tuán)特性及其制品品質(zhì)[5]。

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基聚合而成的直鏈氨基酸聚合物，因具有良好的增稠性、吸水性、抗凍性及可食用性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。Lim等[6]在美式甜甜圈中添加γ-PGA 使得甜甜圈吸油量降低5 倍左右，且孔隙度及感官等多方面體現(xiàn)出更好的狀態(tài)。姬曉月等[7]的研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA 可減少可凍結(jié)水的增加，阻礙淀粉結(jié)晶，從而保護(hù)冷凍面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)，使煮后的速凍水餃皮具有較佳的質(zhì)構(gòu)特性，改善速凍水餃的感官特性，γ-PGA還可抑制面筋蛋白在凍藏期間的劣變[8]。為明確γ-PGA 在凍藏期間在面筋蛋白中的作用機(jī)制，本試驗通過核磁共振儀器 （NMR）、傅里葉紅外儀（FITR）、差示掃描量熱儀 （DSC）、動態(tài)流變儀（DHR）和掃描電子顯微鏡（SEM）測定凍藏過程中谷蛋白的保水力、水分子分布、蛋白二級結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)及流變學(xué)特性、微觀結(jié)構(gòu)，研究γ-PGA 在凍藏期間對谷蛋白水合及結(jié)構(gòu)的影響，為探究γ-PGA 在減緩面筋蛋白凍藏中劣變機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

面筋蛋白，購自一加一天然面粉有限公司，蛋白質(zhì)含量82%；γ-聚谷氨酸，購自西安四季生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Flexi-Dry 冷凍干燥機(jī)，美國FTSSYSTEM 公司；DHR-2 旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA 儀器有限公司；Micro MR 型核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；QUANTAFEG250 型場發(fā)射掃描電鏡，美國FEI 公司；TENSOR Ⅱ型傅里葉紅外光譜儀（FITR），布魯克科技有限公司；DSC-214 型差示掃描量熱儀，耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備及凍藏 采用Wang 等[9]的方法制得谷蛋白，將其冷凍干燥后粉碎備用。將1 g 谷蛋白粉與1.5 mL 的水均勻混合（谷蛋白與水按4∶6 質(zhì)量比混合），整個混合過程為避免蛋白局部結(jié)塊現(xiàn)象采用混漩渦振蕩的方式。試驗設(shè)置空白組和γ-PGA 組，γ-PGA 組中加入占谷蛋白質(zhì)量1%的γ-PGA。將制得的濕谷蛋白塊置于4 ℃保溫箱平衡1 h 后于-40 ℃低溫速凍2 h，后置于-18 ℃下凍藏0，1，3，5 和7 周，即為冷凍谷蛋白。在凍藏不同周期后，部分樣品于室溫解凍2 h 后直接測定，部分樣品采用冷凍干燥處理后經(jīng)粉碎、研磨，過120 目篩后放置于干燥器中備用。

1.3.2 谷蛋白保水力測定

谷蛋白保水力計算公式為：M=m1-m2

式中M——谷蛋白保水力，g；m1——不同凍藏周期的谷蛋白質(zhì)量，g；m2——不同凍藏周期谷蛋白在105 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重后質(zhì)量，g。

1.3.3 谷蛋白中水分分布測定 谷蛋白弛豫時間T2測定參考Zhang 等[10]的方法稍作修改，參數(shù)設(shè)置：共振頻率22 MHz，磁體溫度32 ℃，90°脈沖時間P90 為18 μs，180°脈沖時間P180 為36 μs，采樣點(diǎn)數(shù)TD 為416 616，累加次數(shù)NS 為32，回波個數(shù)NECH 為5 000，數(shù)字增益DRG 為3。

1.3.4 谷蛋白二級結(jié)構(gòu)測定 采用傅里葉紅外儀對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，參數(shù)設(shè)置：掃描范圍400～4 000 cm-1；掃描256 次；分辨率4 cm-1。其中1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊；1 646～1 664 cm-1為α-螺旋；1 637～1 645 cm-1為無規(guī)卷曲；1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[11]。

1.3.5 谷蛋白熱力學(xué)特性測定 準(zhǔn)確稱取5 mg谷蛋白凍干后的樣品，密封在DSC 專用坩堝內(nèi)，以空坩堝作為對照。程序設(shè)定為：初始溫度20 ℃，升溫速度5 ℃/min，最終溫度100 ℃，面筋蛋白變性起始溫度（T0）、變性峰值溫度（Tp）及焓變（ΔH）通過耐馳公司系統(tǒng)軟件分析計算。

1.3.6 谷蛋白流變學(xué)特性測定 將凍藏不同周期的谷蛋白于室溫下解凍2 h 后，采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定動態(tài)流變學(xué)特性。平板直徑為40 mm，測量間隙為1.2 mm，下壓平板后用塑料刀對多余谷蛋白進(jìn)行切除修邊處理，表面涂硅油防止水分揮發(fā)。掃描頻率范圍為0.01～100 Hz，應(yīng)力設(shè)置為1%，測定溫度為25 ℃[10]。

1.3.7 谷蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察 取冷凍干燥后樣品的中心部位，制成5 mm×5 mm×5 mm 體積后表面噴金，在掃描電鏡進(jìn)行1 000 倍觀察。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-PGA 對谷蛋白保水力的影響

γ-PGA 對谷蛋白保水力影響如圖1所示?？芍鹊鞍孜磧霾貢r，其添加1%的γ-PGA 能有效提升其保水能力。隨著凍藏時間延長，兩組均呈現(xiàn)保水力下降，空白組在凍藏0 至1 周期間保水力急劇下降至0.003 g 左右，之后下降趨勢趨于平緩。而γ-PGA 組的谷蛋白在凍藏7 周后其保水力僅下降了0.015 g 左右，相比空白組保留了更多水分。這是因為γ-PGA 中大量羧基使其具有極強(qiáng)的吸水性，凍藏期間很好地鎖住了水分，抑制了水分流失[12]。Shyu 等[13]通過在面團(tuán)中添加γ-PGA 得知其可有效增強(qiáng)面團(tuán)持水性能，在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)面筋蛋白持水能力隨γ-PGA 濃度的增大而提升。試驗結(jié)果表明γ-PGA 可促使谷蛋白保留更多水分。

圖1 γ-PGA 對谷蛋白保水力的影響Fig.1 Effect of γ-PGA on the water retention of glutenin

2.2 γ-PGA 對谷蛋白水分分布的影響

表1為γ-PGA 對谷蛋白水分子弛豫時間（T21、T22、T23）和對應(yīng)峰面積的影響，谷蛋白中水分子是由結(jié)合水T21、弱結(jié)合水T22和自由水T23三部分水分組成。可知隨凍藏時間增加，空白組中弱結(jié)合水呈下降趨勢，而自由水含量卻由6.7%左右顯著增大至8.2%左右，這是因為凍藏期間冰晶的重結(jié)晶現(xiàn)象使得谷蛋白之間的交聯(lián)作用減弱，導(dǎo)致蛋白與水的結(jié)合能力降低[14]，引發(fā)部分弱結(jié)合水向自由水轉(zhuǎn)化。而在γ-PGA 組，發(fā)現(xiàn)凍藏初期其自由水含量比空白組小2.5%，而弱結(jié)合水相對含量卻變大，表明γ-PGA 的添加改變了谷蛋白的水分分布，較少的自由水使其更加穩(wěn)定。同時γ-PGA 有效抑制了谷蛋白凍藏期間的水分遷移，凍藏7 周后其自由水含量較空白組低3.5%。對比γ-PGA 對面筋蛋白凍藏期間水分變化影響[8]，試驗發(fā)現(xiàn)谷蛋白與面筋蛋白凍藏期間弱結(jié)合水和自由水的變化趨勢一致，由此表明γ-PGA 通過抑制谷蛋白的水分遷移從而影響了面筋蛋白凍藏期間的水分遷移。

表1 γ-PGA 對谷蛋白水分子弛豫時間（T21、T22、T23）和對應(yīng)峰面積的影響Table 1 Effect of γ-PGA on the relaxation time （T21，T22，T23）and corresponding peak area of glutenin water molecules

2.3 γ-PGA 對谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

表2為γ-PGA 對谷蛋白二級結(jié)構(gòu)中各成分相對含量的影響，谷蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的相對含量分別為25.5%，40.8%，21.1%，12.5%。隨凍藏時間延長，γ-PGA 組β-折疊相對含量由41.4%下降至37.4%左右，無規(guī)則卷曲相對含量顯著增加1.5%。二級結(jié)構(gòu)的改變一方面可能是因為隨著凍藏時間的延長，谷蛋白中重結(jié)晶現(xiàn)象使得谷蛋白大分子因機(jī)械力而解聚，使其有序狀態(tài)向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)化，另一方面是因為凍藏導(dǎo)致蛋白分子間氫鍵的破壞，使得親水與疏水基團(tuán)暴露引發(fā)的蛋白分子間和分子內(nèi)部的重新交聯(lián)[15]。與空白相比，蛋白二級結(jié)構(gòu)中作為無序結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的增大幅度減緩，較為穩(wěn)定的有序狀態(tài)的α-螺旋、β-折疊降低幅度減小也表明γ-PGA 可以起到冰晶修飾作用，減少大冰晶的形成，從而保護(hù)谷蛋白大分子，削弱凍藏導(dǎo)致的有序向無序轉(zhuǎn)化。

2.4 γ-PGA 對谷蛋白熱力學(xué)的影響

變性溫度（Tp）和焓變（ΔH）是蛋白在熱變性過程中的主要參數(shù)，蛋白樣品熱力學(xué)特性如表3所示，因小麥蛋白對熱敏感性較低，故只能看到較小的吸收峰值。可知隨凍藏時間增加，谷蛋白的變性起始溫度顯著升高6.3 ℃，其變性溫度Tp也由58.5 ℃顯著升高至61.3 ℃，表明其低溫穩(wěn)定性升高，這可能與凍藏導(dǎo)致其疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)[16]，同時其熱焓值顯著降低，表明蛋白有序程度降低，與谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定結(jié)果相一致。Wang 等[9]試驗中面筋蛋白變性溫度隨凍藏時間延長而降低，同時焓變有下降趨勢，對比結(jié)果推測谷蛋白對凍藏期間的熱變性溫度的提升起到主要作用。而γ-PGA 組有效抑制了凍藏導(dǎo)致的變性起始溫度升高，凍藏7 周后使得變性溫度Tp增大至65℃，較空白組提升4 ℃，并發(fā)現(xiàn)其熱焓值并沒有隨凍藏時間延長而減小，這可能是γ-PGA 有效抑制了谷蛋白網(wǎng)絡(luò)的劣變，從而減緩了熱焓值的降低。

表2 γ-PGA 對谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of γ-PGA on secondary structure of glutenin

表3 γ-PGA 對谷蛋白熱力學(xué)特性的影響Table 3 Effect of γ-PGA on thermodynamic properties of glutenin

2.5 γ-PGA 對谷蛋白流變學(xué)特性的影響

黏彈性被認(rèn)為是評價面團(tuán)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，而谷蛋白是彈性的主要貢獻(xiàn)因素。谷蛋白流變學(xué)測量的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）如圖2所示。與面筋蛋白相一致，谷蛋白在頻率0.1～100 Hz范圍內(nèi)其G′和G″都隨著頻率的增加逐漸增大，且G′始終大于G″。當(dāng)凍藏時間延長，谷蛋白的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）均出現(xiàn)下降的趨勢，這與Xuan 等[17]研究結(jié)果保持一致。而添加了1%的γ-PGA 后，雖然凍藏初期谷蛋白的彈性模量（G′）低于空白組，但其受到凍藏影響的程度較小，凍藏7 周后其彈性模量（G′）比空白組高，表明其有效抑制了凍藏導(dǎo)致的谷蛋白彈性的降低，而黏性模量（G″）卻與之相反，在凍藏前后其黏性性能均低于空白組，這表明γ-PGA 并沒有對谷蛋白的黏性性能產(chǎn)生積極作用，前人研究也發(fā)現(xiàn)面團(tuán)及面筋蛋白的彈性性能主要由谷蛋白起主要貢獻(xiàn)[18]，故試驗結(jié)果表明γ-PGA 并不能通過改變谷蛋白的黏性性能來減緩凍藏期間面筋蛋白黏性性能的劣變，但可以通過對谷蛋白彈性的影響來抑制面筋蛋白彈性的減弱。

圖2 γ-PGA 對谷蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.2 Effect of γ-PGA on the rheological properties of glutenin

2.6 γ-PGA 對谷蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖3為不同凍藏周期谷蛋白微觀結(jié)構(gòu)圖，凍藏初期谷蛋白通過鏈內(nèi)和鏈外二硫鍵形成了高度網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)，使其具有連續(xù)的結(jié)構(gòu)及較小的孔洞。隨凍藏時間增加，發(fā)現(xiàn)其微觀結(jié)構(gòu)受到破壞。凍藏5 周后，谷蛋白網(wǎng)絡(luò)趨于斷裂，出現(xiàn)明顯結(jié)塊現(xiàn)象，主要原因可能是凍藏期間冷凍收縮作用使得相鄰的小冰晶聚合形成大冰晶引發(fā)的結(jié)構(gòu)斷裂[19-20]。與此相比，γ-PGA 組在凍藏初期谷蛋白網(wǎng)絡(luò)孔洞變大，但仍然呈現(xiàn)較好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是因為γ-PGA 具有良好的吸水性而與谷蛋白之間形成了競爭性吸水，導(dǎo)致其孔洞直徑變大，但與空白組不同，隨凍藏時間延長γ-PGA 組的谷蛋白網(wǎng)絡(luò)的連續(xù)性比空白組好，且斷裂得較少，γ-PGA 良好的增稠性能產(chǎn)生水分滯留效果，使得水分流動性降低可能是其中的主要原因[6]。較連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也使谷蛋白的熱穩(wěn)定性增加，與上述試驗結(jié)果相吻合。同時表明γ-PGA 有效緩解了凍藏期間谷蛋白的劣變，其效果可能在延緩面筋蛋白劣變中做出了貢獻(xiàn)。

圖3 γ-PGA 對谷蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of γ-PGA on the microstructure of glutenin

3 結(jié)論

研究表明添加γ-PGA 可以抑制凍藏期間谷蛋白水分的流失，促使谷蛋白中自由水向弱結(jié)合水轉(zhuǎn)換，增強(qiáng)其水分穩(wěn)定程度，并有效減緩凍藏期間自由水增大及弱結(jié)合水含量的減少。同時γ-PGA 有效延緩凍藏導(dǎo)致的谷蛋白熱焓值降低，提升谷蛋白變性溫度，表明γ-PGA 有效地保護(hù)了谷蛋白結(jié)構(gòu)。并較好地抑制了凍藏引發(fā)的結(jié)構(gòu)斷裂和結(jié)塊現(xiàn)象，有效地保護(hù)了蛋白網(wǎng)絡(luò)。凍藏導(dǎo)致了谷蛋白彈性及黏性性能都隨凍藏時間延長而降低，添加γ-PGA 減弱了其彈性性能的下降趨勢，但對黏性性能并沒有產(chǎn)生相應(yīng)作用。且γ-PGA 有效改善了凍藏導(dǎo)致β-折疊相對含量降低，無規(guī)則卷曲相對含量增大趨勢，減弱了蛋白二級結(jié)構(gòu)由有序向無序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化程度。