趙鶴鵬，許秋達(dá)，周鴻立

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

玉米須多糖中糖醛酸含量的測(cè)定及抗氧化作用的研究

趙鶴鵬，許秋達(dá)，周鴻立*

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

研究玉米須多糖中糖醛酸的含量測(cè)定方法和抗氧化作用。采用間羥基聯(lián)苯法在528 nm處測(cè)定糖醛酸含量，利用4種抗氧化方法測(cè)定玉米須多糖的抗氧化活性。標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4，平均加樣回收率為100.43%，RSD為1.51%，玉米須多糖中糖醛酸含量為59.21 μg/mg。玉米須多糖清除羥基自由基、DPPH和超氧陰離子的IC50分別為0.99 mg/mL，0.44 mg/mL和6.05 mg/mL。間羥基聯(lián)苯法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，且多糖4種體系的抗氧化試驗(yàn)均證明其具有一定的抗氧化能力，均弱于Vc，得出玉米須多糖中糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關(guān)。

玉米須多糖；糖醛酸；間羥基聯(lián)苯法；抗氧化作用

0 引言

玉米須是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱頭，又名棒子毛，為常用藥材品種之一。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，玉米須有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老等作用，其中化學(xué)成分主要有多糖、甾醇、生物堿、有機(jī)酸、黃酮、多元醇、氨基酸等[1]。其中黃酮和多糖含量比較豐富。玉米須多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖所組成[2]。由于植物多糖按化學(xué)性質(zhì)可分為中性多糖和酸性多糖，后者由于結(jié)構(gòu)中引入了糖醛酸等基團(tuán)而具有酸性和相應(yīng)的特殊藥效。之前采用咔唑－硫酸法[3]和間羥基聯(lián)苯法[4]測(cè)定植物多糖中糖醛酸的含量，研究結(jié)果表明，采用咔唑－硫酸比色法時(shí)，由于待測(cè)溶液中的中性單糖、戊糖和己糖與糖醛酸的吸收波長(zhǎng)相同[5]，會(huì)使得糖醛酸的測(cè)定值偏離實(shí)際含量。而采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)糖醛酸含量更接近理論值。申明月等[6]采用液相色譜法測(cè)定糖醛酸含量發(fā)現(xiàn)，不同多糖的抗氧化活性與其糖醛酸含量呈正相關(guān)，糖醛酸含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究玉米須多糖中糖醛酸含量的測(cè)定方法，并驗(yàn)證其與抗氧化活性的相關(guān)性。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

SHB－IIIA循環(huán)水式多用真空泵、752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、FA－2004型分析天平、LDZ5－2型臺(tái)式離心機(jī)等。

玉米須采自吉林省吉林市玉米田，經(jīng)干燥處理后備用；咔唑（Aladdin）、半乳糖醛酸（國(guó)藥集團(tuán)）、1，1－二苯基苦基苯肼（Sigma）、 間羥基聯(lián)苯（Aladdin）、30%雙氧水（Aladdin）等試劑均為分析純。

1.2 糖醛酸的含量測(cè)定

1.2.1 溶液的配制

對(duì)照品溶液：精確稱取70℃干燥至恒質(zhì)量的半乳糖醛酸對(duì)照品4 mg置于50 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解定容，配成80 μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：分別精確稱取玉米須多糖50 mg，置于50 mL容量瓶中，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，離心（10 min，3 000 r/min），配成 1 mg/mL 的多糖溶液。

硼砂－硫酸溶液：稱取0.477 g硼砂加入濃硫酸100 mL超聲溶解，備用。

間羥基聯(lián)苯溶液：稱取間羥基聯(lián)苯0.15 g，用0.5%氫氧化鈉溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用阿里紅多糖中糖醛酸的含量測(cè)定[7]方法進(jìn)行測(cè)定，精確移取80 μg/mL半乳糖醛酸0.5 mL于10 mL容量瓶中，緩慢加入5 mL硼砂－硫酸溶液，搖勻后，至沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫后，加入0.15%間羥基聯(lián)苯溶液80 μL，混勻，靜置30 min。蒸餾水同上操作制得空白液調(diào)零，在400～800 nm波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為528 nm。結(jié)果如圖1所示。

圖1 全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Full wavelength scanning of corn silk polysaccharides

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精確吸取半乳糖醛酸對(duì)照品溶液 2、3、4、5、6 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取系列濃度半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，其余同1.2.2。

1.2.4 方法學(xué)考察

對(duì)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等試驗(yàn)考察，之后測(cè)定玉米須多糖中糖醛酸的含量。

1.3 抗氧化試驗(yàn)

1.3.1 清除羥基自由基能力的測(cè)定

取2.0 mmol/L鄰二氮菲40 μL于酶標(biāo)儀板中，依次加入 PBS（pH 7.40）40 μL，蒸餾水 20 μL，充分混勻后，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵20 μL，混勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的H2O220 μL，于37℃恒溫箱中保存60 min，在505 nm處測(cè)定其吸光度；用蒸餾水代替H2O2，測(cè)定其吸光值；取系列濃度梯度的玉米須多糖溶液代替蒸餾水20 μL，測(cè)定其吸光值[8]。用VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 總還原能力的測(cè)定

依次在10支10 mL試管中加入系列濃度梯度的玉米須多糖溶液1.0 mL，磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混勻后以 3 000 r/min離心 10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和2.5 mL的蒸餾水，搖勻后在700 nm處測(cè)定吸光值，平行測(cè)定3次取平均值[9]。用VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3 清除DPPH自由基能力測(cè)定

取系列濃度梯度的玉米須多糖溶液100 μL于酶標(biāo)儀板中，加入等體積濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液（無(wú)水乙醇配制），混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。取上述濃度梯度的玉米須多糖溶液100 μL加上等體積無(wú)水乙醇，在517 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次取平均值?？瞻讓?duì)照組為100 μL DPPH溶液加上等體積無(wú)水乙醇，在517 nm處測(cè)定吸光值[10]。用VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

（1）取 50 mmol/L Tris－HCl緩沖溶液 200 μL于25℃恒溫箱中預(yù)熱20 min后，分別加20 μL系列濃度梯度的玉米須多糖溶液和20 μL鄰苯三酚，25℃條件下反應(yīng)5 min，在325 nm處測(cè)定吸光值；（2）用 20 μL 10 mmol/L 鹽酸代替（1）中的鄰苯三酚溶液；（3）用 20 μL 蒸餾水代替（1）中的多糖溶液，分別在25℃條件下反應(yīng)5 min，在325 nm處測(cè)定吸光值[11]。用Vc溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖醛酸含量的測(cè)定

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

由圖1可知，對(duì)照品和供試品溶液在528 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。因此選528 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 玉米須多糖最低檢測(cè)限的測(cè)定

由圖1可知，玉米須多糖溶液稀釋到0.2 mg/mL時(shí)，目測(cè)出最低檢測(cè)限。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在n=5時(shí)，得到線性回歸方程：y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4。 半乳糖醛酸含量在 20～100 μg/mL之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照溶液在相同的操作條件下，連續(xù)操作6次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 The precision experiment

RSD為1.86%＜3.0%，符合測(cè)定紫外分光光度計(jì)的要求，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性考察

為使分析方法可用于常規(guī)檢驗(yàn)所規(guī)定的時(shí)間，以確保方法可行，在操作條件下，進(jìn)行一系列穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 The stability experiment

RSD為1.77%＜3.0%，表明溶液在80 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，可進(jìn)行測(cè)定。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

用規(guī)定的方法平行測(cè)定樣本5份，結(jié)果如表3所示。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 The repetitive experiment

RSD為1.90%＜3.0%，符合重現(xiàn)性的要求范圍。

2.1.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

為考察其他成分對(duì)測(cè)定的干擾，分別用咔唑－硫酸法與間羥基聯(lián)苯法測(cè)定其加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 間羥基聯(lián)苯法和咔唑－硫酸法加樣回收率試驗(yàn)（n=5）Table 4 The recovery test of m－h(huán)ydroxydiphenyl and carbazole method（n=5）

從表4可以看出，間羥基聯(lián)苯法的測(cè)定結(jié)果較之咔唑－硫酸法的測(cè)定結(jié)果距真實(shí)值更為接近。因此，選擇采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定玉米須多糖中糖醛酸的含量。

2.2 糖醛酸含量測(cè)定

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得玉米須多糖中糖醛酸含量為 59.21 μg/mg。

2.3 抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 清除羥基自由基能力測(cè)定

按1.3.1的方法進(jìn)行試驗(yàn)。計(jì)算出不同質(zhì)量濃度玉米須多糖和Vc對(duì)羥基自由基的清除率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 多糖和Vc對(duì)羥基自由基清除率的影響Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由圖2可以看出，二者對(duì)羥基自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而升高。玉米須多糖對(duì)羥基自由基的IC50為0.99 mg/mL，Vc對(duì)羥基自由基的IC50為 0.26 mg/mL。

2.3.2 總還原能力測(cè)定

按1.3.2方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 多糖和Vc的總還原能力測(cè)定曲線Fig.3 Total reduction ability of corn silk polysaccharide and Vc

由圖3可以看出，二者的總還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，但玉米須多糖的還原力比Vc的要低。

2.3.3 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

按1.3.3的方法進(jìn)行試驗(yàn)。計(jì)算出不同質(zhì)量濃度下二者對(duì)DPPH自由基的清除率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由圖4可以看出，二者對(duì)DPPH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而升高。玉米須多糖對(duì)DPPH自由基的IC50為0.44 mg/mL，Vc對(duì)DPPH自由基的IC50為0.044 mg/mL。

2.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

按1.3.4的方法進(jìn)行試驗(yàn)。計(jì)算不同質(zhì)量濃度下二者對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 多糖和Vc對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.5 Superoxide anion radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由圖5可以看出，二者對(duì)超氧陰離子自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而升高。玉米須多糖對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為6.05 mg/mL，Vc對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為0.54 mg/mL。

3 結(jié)論

本文采用間羥基聯(lián)苯法對(duì)糖醛酸含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示在20～100 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4，穩(wěn)定性RSD值為1.77%，精密度RSD值為1.86%，重復(fù)性RSD值為1.90%，加樣回收率RSD值為1.51%，結(jié)果表明此法準(zhǔn)確率較高，重復(fù)性較好。同時(shí)也說(shuō)明中性糖對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小，測(cè)定出玉米須多糖中糖醛酸的含量為59.21 μg/mg。

玉米須多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的 IC50分別為0.44 mg/mL、0.99 mg/mL、6.05 mg/mL。結(jié)果表明玉米須多糖具有一定的抗氧化能力，為玉米須多糖的開(kāi)發(fā)與研究提供了理論依據(jù)。

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DETERMINATION OF URONIC ACID IN CORN SILK POLYSACCHARIDES AND ITS ANTIOXIDATION ACTIVITY

ZHAO Hepeng，XU Qiuda，ZHOU Hongli
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022，China）

The present study was to investigate the uronic acid content in the corn silk polysaccharides and its antioxidant activity.The content of uronic acid was determined using 3－phenylphenol colorimetry method at 528 nm，while 4 kinds of classical antioxidant methods were used to examine the antioxidant activity of corn silk polysaccharide.The results showed that a good linearity relation existed between the absorbency and the concentration of standard galacturonic acid in the range of 20～100 μg/mL（y=0.009 3x+0.076 1，r=0.999 1），and the average recovery and RSD were 100.43%and 1.51%，respectively.The content of uronic acids in polysaccharides from corn silk was59.21 μg/mg.The IC50valuesofscavenging ability ofcorn silk polysaccharides on hydroxyl radical， DPPH radicals and superoxide anion radical were 0.99 mg/mL，0.44 mg/mL and 6.05 mg/mL， respectively.It was concluded that the 3－phenylphenol colorimetry method had the advantages of available， accurate and reproducible on the determination of uronic acid.In addition，corn silk polysaccharide had certain antioxidant ability，which was positively correlation with the uronic acid content.This study will provide a theoretical basis for the development and research of corn stigma polysaccharide.

corn silk；uronic acid；3－phenylphenol colorimetry；antioxidation activity

TS201.2

：B

1673－2383(2017)04－0081－05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.030.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017－8－28 8:57:23

2017－01－10

吉林省科技廳科研項(xiàng)目（20150311044YY）

趙鶴鵬（1988—），男，吉林省吉林市人，碩士研究生，主要從事天然有機(jī)化學(xué)的研究工作。

*通信作者