張小文 崔傳寶 張平平 郗紅娟 高爾 李聃 劉玉珍 趙軍 朱凱 張開(kāi)蒂

·論著·

苦參堿通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

張小文 崔傳寶 張平平 郗紅娟 高爾 李聃 劉玉珍 趙軍 朱凱 張開(kāi)蒂

目的探究苦參堿通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法對(duì)人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后分為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組以及高濃度組，對(duì)照組中加入生理鹽水，分別向低濃度組、中濃度組以及高濃度組，加入濃度為30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦參堿，作用48小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀及MTT檢測(cè)法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，并采用Western Blotting和real time PCR檢測(cè)PI3K、p-AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平，比較四組之間的差異。結(jié)果高濃度組、中濃度組、低濃度組生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的升高生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05)；高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的升高PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論苦參堿可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，推測(cè)其作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

肺癌； A549細(xì)胞； 苦參堿； PI3K/Akt信號(hào)通路

肺癌多因肺支氣管黏膜在物理、化學(xué)等致癌因素的作用下發(fā)生基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞癌基因活化，抑癌基因失去活性[1]?？鄥A是中藥苦參所含的主要生物堿之一，提取于苦豆子根部。有研究指出[2]，苦參堿可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮其抗腫瘤作用。另有研究指出[3],苦參堿可通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)影響多種通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但關(guān)于苦參堿對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路影響的研究較少。本研究特探究苦參堿誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制以及與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，旨在為臨床重要抗腫瘤機(jī)制的研究提供新思路，同時(shí)為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人肺癌A549細(xì)胞株，由山東博德生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑

苦參堿，分子量為248.36，購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，避光保存，實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)用現(xiàn)配所需濃度。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，購(gòu)自Sigma公司，用錫箔紙包裝，避光保存?zhèn)溆?，使用前常溫下融化，有效期為一周。RPM1-1640溶液：購(gòu)自濟(jì)南美森特生物科技有限公司；二甲基亞砜與熒光染料均購(gòu)自Sigma公司；以及標(biāo)記液、孵育緩沖液、PI染液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳孵育箱：型號(hào)SANYO MCO-18M；流式細(xì)胞儀：型號(hào)BD FACSCalibur；微量移液器：型號(hào)HG211-WKYⅢ；倒置顯微鏡：日本奧林巴斯；離心機(jī)：德國(guó)，型號(hào)Eppendorf525L；熒光顯微鏡：日本奧林巴斯。培養(yǎng)液、培養(yǎng)板由Corning公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)、傳代：將濃度為4×105個(gè)/mL的A549細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。每孔滴入180 μL，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。對(duì)照組加入生理鹽水，低、中濃度組及高濃度組分別加入濃度為30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦參堿。

1.5 A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及凋亡率檢測(cè)方法

48小時(shí)后每孔滴入濃度為5 g/L的MTT液，共20 μL，作用時(shí)間為4小時(shí)，4小時(shí)后將培養(yǎng)基撇棄，加入150 μL DMSO，震蕩15分鐘，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm的吸光度值，觀察48小時(shí)后苦參堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制情況。48小時(shí)后將細(xì)胞收集，經(jīng)PBS洗滌后進(jìn)行重懸，采用70%的乙醇將其固定，并將碘化丙啶(PI)加入其中進(jìn)行30分鐘的染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。制作貼壁細(xì)胞，并使用PBS洗滌1次，可增加適量干燥樣品使細(xì)胞貼得更加牢固，使用免疫染色固定液固定細(xì)胞60分鐘，再用PBS洗滌1次，加入含有0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚的PBS，冰浴孵育2分鐘，采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。

1.6 Real time PCR法檢測(cè)PI3K、AKT mRNA表法

采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nm OD值，取樣品低溫保存?zhèn)溆谩＜尤?9 μL DEPC水，紫外分光光度計(jì)測(cè)OD 260、OD 280，當(dāng)其比值為1.8～2.0時(shí)，提示樣本中RNA純度合格。在37℃ 15分鐘，85℃ 5秒為1個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在反應(yīng)體系為20 μL，95℃ 0.5分鐘，1個(gè)循環(huán)，95℃ 5秒、60℃ 34秒、40個(gè)循環(huán)，95℃ 15秒、60℃ 60秒、95℃ 15秒，1個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解度曲線(xiàn)分析，根據(jù)系統(tǒng)給出的數(shù)值，使用內(nèi)參actin，計(jì)算各組PI3K、AKT mRNA的表法水平。

1.7 PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況檢測(cè)方法

根據(jù)PI3K、p-AKT蛋白質(zhì)分子量配置相應(yīng)的分離膠，混合均勻，置于烘箱中靜置30分鐘，直至水層與膠層出現(xiàn)明顯界限，向其中灌注濃縮膠，室溫靜置30分鐘，直至凝膠聚合。將制作的樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜制作成轉(zhuǎn)移“三明治”。將膜放入TBST沖洗1次，置于麗春紅染色液中染色5分鐘，放入盛有封閉液的容器中，封閉1小時(shí)，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)，使用脫脂奶粉溶液稀釋一抗，將其加入到封閉容器中，放置于冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育。清除一抗，后室溫下?lián)u床孵育2小時(shí)進(jìn)行二抗孵育。最后在暗盒內(nèi)進(jìn)行曝光鑒定。采用Quantity One凝膠圖像分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行分析光密度值。使用內(nèi)參GAPDH條帶的光密度比值表示PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及凋亡率比較

高濃度組、中濃度組、低濃度組生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的升高，生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05)，其中高濃度組生長(zhǎng)抑制率和凋亡率最高。詳見(jiàn)表1。

表1 四組肺癌A549細(xì)胞48生長(zhǎng)抑制率及凋亡率比較結(jié)果(%)

注： 與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低濃度組相比，bP<0.05；與中濃度組相比，cP<0.05。

2.2 四組PI3K、AKT mRNA表達(dá)情況比較

高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的升高PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，其中高濃度組PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平最低。詳見(jiàn)表2。

表2 四組PI3K、AKT mRNA表達(dá)情況比較結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低濃度組相比，bP<0.05；與中濃度組相比，cP<0.05。

2.3 四組PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，苦參堿處理細(xì)胞48小時(shí)后，隨濃度的增加，A549細(xì)胞可見(jiàn)染色質(zhì)凝集、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變，PI3K和Akt蛋白表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中的均明顯減弱，由棕黃色逐漸變淺，提示PI3K和Akt蛋白陽(yáng)性表達(dá)下降(見(jiàn)圖1、圖2)。Western Blotting定量分析結(jié)果與此一致，顯示出高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的升高PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖3。

3 討論

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前對(duì)于該病的治療臨床上多采用手術(shù)、放療、化療以及分子靶向藥物治療，但治療效果不理想[4-5]，且毒副作用明顯，尤其是化療藥物對(duì)患者骨髓造血功能有明顯的抑制作用，導(dǎo)致患者不得不中斷治療[6-7]。

近年來(lái)，PI3K/Akt信號(hào)通路引起國(guó)內(nèi)外研究人員的注意， 其傳導(dǎo)途徑為PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)PH結(jié)構(gòu)的信號(hào)蛋白Akt和PDKI結(jié)合，促進(jìn)PDKI磷酸化AKT蛋白的Ser308，進(jìn)而導(dǎo)致AKT激活，并通過(guò)磷酸化多種酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[8-9]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要作用機(jī)制為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素作用下，通過(guò)啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，減少細(xì)胞的凋亡[10-11]。

注：A對(duì)照組；B低濃度組；C中濃度組；D高濃度組

注：A對(duì)照組；B低濃度組；C中濃度組；D高濃度組

表3 四組PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果

注： 與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低濃度組相比，bP<0.05；與中濃度組相比，cP<0.05。

注：1高濃度組；2中濃度組；3低濃度組；4對(duì)照組

苦參堿屬于四環(huán)的喹嗪啶類(lèi)，分子骨架為2個(gè)喹嗪啶環(huán)的雜體。有研究表明[11-12]，苦參堿具有抗腫瘤作用，且可抑制多種細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。其主要作用機(jī)制可能為苦參堿可增強(qiáng)促凋亡因子的表達(dá)，同時(shí)抑制促癌基因的表達(dá)。有關(guān)研究指出,苦參堿可通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖分化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其中MAKP/ERK以及MAPK、JAK-STAT信號(hào)通路在作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]。此外，苦參堿可通過(guò)影響人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響[14]。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組A549細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著低于其他組，且濃度越高生長(zhǎng)抑制率和凋亡率越高，提示藥物濃度越高對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用以及促進(jìn)其凋亡作用越明顯。顯微鏡下可觀察到隨著藥物濃度的增加，壞死細(xì)胞脫落逐漸增多，貼壁細(xì)胞逐漸減少，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性[15]。此外，本研究中苦參堿三個(gè)濃度組PI3K、AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，且隨著濃度的升高表達(dá)水平顯著降低，提示藥物濃度越高抑制PI3K、AKT蛋白和mRNA的表達(dá)作用越強(qiáng)。

綜上所述，苦參堿可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡，其可能作用機(jī)制為通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，且隨著藥物濃度的增加，生長(zhǎng)抑制率和凋亡率以及對(duì)相關(guān)基因和蛋白的抑制作用越明顯。

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(本文編輯： 禹佳)

StudyontheapoptosismechanismoflungcancerA549cellsinducedbymatrinethroughPI3K/Aktsignalingpathway

ZHANGXiaowen,CUIChuanbao,ZHANGPingping,etal.

PharmacologyteachingandresearchsectionofQILUMedicalUnivercity,Zibo255213，China

Correspondingauthor:ZHANGXiaowen,E-mail:mted12@163.com

ObjectiveTo explore the apoptosis mechanism of lung cancer A549 cells induced by matrine through PI3K/Akt signaling pathway.MethodsHuman lung cancer A549 cells were cultured, which were divided into control group, low concentration group, middle concentration group and high concentration group. The cells in control group were given normal saline, and the low concentration group, middle concentration group and high concentration group were respectively given matrine with concentrations of 30 mg/L, 60 mg/L, 120 mg/L, and the apoptosis situations of lung cancer A549 cells were detected by flow cytometry and MTT detection, and the growth inhibition rates were calculated, then the PI3K, p-AKT protein and PI3K, AKT mRNA levels were detected by Western Blotting and real time PCR, the differences between the four groups were compared.ResultsThe growth inhibition rates and apoptosis rates of high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), which were significant increased with the increasing of concentrations (P<0.05). The levels of PI3K, AKT mRNA and PI3K, p-AKT protein in the high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), which were significantly decreased with the increasing of concentrations (P<0.05).ConclusionThe matrine can induce the apoptosis of lung cancer A549 cells, and the action mechanism may relate to the PI3K/Akt signaling pathway.

Lung cancer; A549 cells; Matrine; PI3K/Akt signaling pahway

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(J14LM55)

255213 淄博，齊魯醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室

張小文(1980- )，女，碩士，講師。研究方向：藥理學(xué)。E-mail：mted12@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.005

2016-10-27)