宋和勇 馬春蘭 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民醫(yī)院，青海 西寧 810001)

雷帕霉素抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的活性及其機(jī)制

宋和勇 馬春蘭 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民醫(yī)院，青海 西寧 810001)

目的探討雷帕霉素抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤活性及其相關(guān)作用機(jī)制。方法MTT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雷帕霉素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的生長(zhǎng)抑制活性，Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)survivin mRNA的表達(dá)變化，提取細(xì)胞總蛋白Western印跡檢測(cè)survivin蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果雷帕霉素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6顯示了高效的抗腫瘤活性，IC50值為(8.34±0.62)μmol/L。流式細(xì)胞儀凋亡分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素作用C6細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率分別為(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。細(xì)胞周期分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細(xì)胞48h后，細(xì)胞增殖指數(shù)分別為(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)。RT-PCR和Western印跡檢測(cè)顯示雷帕霉素可以下調(diào)survivin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論雷帕霉素具有高效的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性，其作用機(jī)制可能與其抑制了mTOR信號(hào)通路下調(diào)survivin靶蛋白的表達(dá)有關(guān)。

雷帕霉素；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；mTOR信號(hào)通路；survivin

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在腦腫瘤中占40%～60%，首選治療方法是手術(shù)切除，但手術(shù)很難完全切除病灶，因此術(shù)后的化療是延緩病變進(jìn)展的重要措施，同時(shí)也是神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方案的一個(gè)重要組成部分〔1〕。膠質(zhì)瘤的預(yù)后很差，約有一半的患者在確診后1年內(nèi)死亡，約25%的患者會(huì)在確診后的兩年內(nèi)死亡，神經(jīng)膠質(zhì)瘤高的死亡率及復(fù)發(fā)率使其成為預(yù)后最差的腫瘤〔2〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路對(duì)人體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有著重要的作用，相關(guān)研究表明其通路的激活與眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。雷帕霉素是mTOR蛋白的抑制劑，其在多種腫瘤中已顯示出抑瘤活性〔4〕，近期的研究顯示mTOR蛋白參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并且與患者的預(yù)后也有一定的相關(guān)性〔5〕，本研究旨在探討雷帕霉素致神經(jīng)膠質(zhì)瘤的凋亡活性及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 ①青霉素、鏈霉素、雷帕霉素及碘化丙啶(PI)由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；②胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)；③ RPMI1640培養(yǎng)基由英韋創(chuàng)津公司生產(chǎn)；④ Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒由南京凱基生物科技有限公司生產(chǎn)；⑤ Trizol、RT-PCR試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)；⑥ survivin、GAPDH抗體及HRP標(biāo)記的二抗由美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)。

1.2膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及培養(yǎng)方法 在溫度為37℃及5% CO2條件下，將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml鏈霉素高糖的DMEM培養(yǎng)液中。

1.3膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到96孔板(3 000/孔)，待細(xì)胞貼壁后即可加入雷帕霉素(對(duì)倍稀釋濃度)，在68 h后，加入MTT(0.5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，然后棄其培養(yǎng)液，再加入DMSO溶解結(jié)晶，采用Model 550型酶標(biāo)儀(Bio-Rad USA)570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，并計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50值)及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.4Annexin V/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細(xì)胞貼壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細(xì)胞，48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞且磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次(1 200 r/min離心5 min)，并按照試劑盒的要求加入PI及Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫并避光反應(yīng)30 min，置冰上等待檢測(cè)。采用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(Beckman Coulter，USA)，其中每個(gè)樣品檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，如Annexin V陽(yáng)性和Annexin V與PI雙陽(yáng)性則為凋亡細(xì)胞，由此來(lái)計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

1.5PI單染細(xì)胞周期分析 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細(xì)胞貼壁即可后加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細(xì)胞，48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 200 r/min離心5 min，75%的乙醇固定細(xì)胞4～6 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100 μg/ml碘化丙啶，室溫染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè) (激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，吸收波長(zhǎng)610 nm)收集10 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞周期分析使用流式細(xì)胞儀自帶ModFit LT 3.2 軟件，增殖指數(shù)=〔(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) 〕×100%。

1.6RT-PCR檢測(cè) 將本次研究處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細(xì)胞貼壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細(xì)胞，48 h后，去上清，PBS洗滌2次，加入Trizol(1 ml)，并依據(jù)Trizol說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總的mRNA，同時(shí)依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)出cDNA的第一鏈，PCR檢測(cè)survinin基因的mRNA表達(dá)。Survivin上游引物:5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′，下游引物：5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；內(nèi)參照GAPDH基因上游引物：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3′，下游引物：5′-AATGCCAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠(100 V電壓)電泳45 min后，凝膠成像儀觀察并拍照分析。

1.7Western印跡分析 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到6孔板(0.5×106/孔)，待細(xì)胞貼壁后加入即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)處理C6細(xì)胞，48 h后，去上清并PBS洗滌2次，1×SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞，95℃ 10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，在SDS-PAGE 膠(8%積層膠，12%分離膠)電壓80 V電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，再將PVDF膜浸潤(rùn)于TBST(含5%脫脂奶粉)中1 h，并加入survivin蛋白特異性一抗(1∶1 000)在溫度4℃過(guò)夜，再次加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，再加入發(fā)光底物X-ray進(jìn)行曝光顯示目的蛋白條帶，其中GAPDH蛋白作為內(nèi)參照以顯示相同的上樣量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

圖1 雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞survivin表達(dá)的影響

2.1雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 MTT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)顯示在50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78 μmol/L對(duì)倍稀釋的雷帕霉素作用下，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(90.87%±7.85%)、(74.28%±5.02%)、(59.78%±4.75%)、(38.94%±5.64%)、(25.80%±4.21%)、(15.06%±2.84%)、(7.53%±3.62%)，由此計(jì)算的IC50值為(8.34±0.62)μmol/L。

2.2雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的致凋亡作用 流式細(xì)胞儀凋亡分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率分別為(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，雷帕霉素可以劑量依賴性的增加C6細(xì)胞的凋亡(P<0.01)。

2.3雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 PI單染流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素處理C6細(xì)胞48 h后，增殖指數(shù)分別為(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)，可見(jiàn)雷帕霉素劑量依賴性的抑制了C6細(xì)胞的增殖。

2.4雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞survivin表達(dá)的影響 雷帕霉素可以劑量依賴性地下調(diào)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞survivin mRNA和蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

3 討 論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)原癌基因和抑癌基因參與的多基因、多因素、多步驟共同作用的結(jié)果〔6〕，其中多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)調(diào)控異常，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是其中一條重要的致細(xì)胞增殖通路，而且最近的研究也發(fā)現(xiàn)，該通路可以調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的增殖活性〔9,10〕。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤內(nèi)部的一小群起始細(xì)胞，是腫瘤產(chǎn)生耐藥和經(jīng)常復(fù)發(fā)的根源，可見(jiàn)靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的治療將會(huì)有廣闊的臨床應(yīng)用前景〔9〕。雷帕霉素是臨床廣泛使用的一個(gè)免疫抑制劑，其可以抑制T和B淋巴細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-2的反應(yīng)也可以抑制mTOR的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

P13K是一個(gè)由P85調(diào)節(jié)亞基和P110催化亞基組成的細(xì)胞內(nèi)第二信使，上游的信號(hào)通路激活后磷酸化P85蛋白進(jìn)而募集P110，催化膜內(nèi)的PI2K生成PI3K，繼而激活下游的mTOR蛋白，作為重要的一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR可以磷酸化其底物pS6K與4E-BP10YL，并促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯，其中包括一些抗凋亡蛋白〔10〕。本文的凋亡檢測(cè)結(jié)果表明mTOR蛋白的抑制劑雷帕霉素能夠劑量依賴性地增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的凋亡比例。mTOR蛋白還可以調(diào)控細(xì)胞周期，阻止其G1期向S期的過(guò)度，本研究也顯示了在雷帕霉素作用下C6細(xì)胞阻滯在G1期，細(xì)胞增殖指數(shù)呈劑量依賴性的減低。

survivin是凋亡蛋白抑制家族(IAP)的新成員，是IAP中迄今發(fā)現(xiàn)抗凋亡作用最強(qiáng)的因子，主要通過(guò)調(diào)節(jié)p21抑制caspase-3活化而發(fā)揮抗凋亡作用，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，可見(jiàn)抑制survivin蛋白的表達(dá)將會(huì)有顯著的致細(xì)胞凋亡作用〔11〕。最近的研究顯示survivin的表達(dá)受到PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控，mTOR可以穩(wěn)定survivin mRNA，結(jié)合其轉(zhuǎn)錄的起始區(qū)域上調(diào)蛋白的翻譯〔12〕。本研究結(jié)果提示雷帕霉素可以劑量依賴性地下調(diào)survivin mRNA和蛋白的表達(dá)。

雷帕霉素具有高效的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性，抑制mTOR信號(hào)通路下調(diào)survivin靶蛋白的表達(dá)可能是其主要的作用機(jī)制。

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〔2016-10-20修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

宋和勇(1973-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4202-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.014