李聰麗,陽亞婕,傅本重,張志林,付應(yīng)林,李國元*

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062； 3.孝感市野生動物和森林植物保護(hù)站，湖北 孝感 432000)

香蔥灰霉病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究

李聰麗1,2,陽亞婕1,傅本重1,張志林1,付應(yīng)林3,李國元1*

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062； 3.孝感市野生動物和森林植物保護(hù)站，湖北 孝感 432000)

為明確香蔥灰霉病病原及其生物學(xué)特性，采用單孢分離法分離香蔥灰霉病病原菌，依據(jù)病原菌形態(tài)特征及rDNA-ITS序列分析結(jié)果，鑒定香蔥灰霉病病原為灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)，同時對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：病原菌在供試的10種培養(yǎng)基上均能生長，最適宜培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；供試的9種碳源和11種氮源中，最利于病原菌菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母粉；在pH值為4.0～12.0條件下，病原菌都能生長，最適pH值為5.0～6.0；病原菌在4～30 ℃均能生長，適合病原菌菌絲生長的溫度為15～25 ℃， 25 ℃時病原菌菌絲不僅生長快且非常濃密，溫度高于30 ℃菌絲停止生長；菌絲致死溫度是52 ℃(10 min)。

香蔥； 灰霉?。?病原菌； 生物學(xué)特性； 灰葡萄孢菌

香蔥(Alliumascalonicum)，屬百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)多年生宿根草本植物[1]。它是世界性香料蔬菜和調(diào)味品，全株均可食用，具有較高的營養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟(jì)價值[2-3]，在我國廣泛種植，具有久遠(yuǎn)栽培歷史?；颐共∈鞘[屬蔬菜常見的病害之一，在全國各地都有不同程度的發(fā)生，春冬低溫多雨的季節(jié)危害更為嚴(yán)重，影響香蔥的外觀、產(chǎn)量和品質(zhì)，危害嚴(yán)重時造成蔥葉枯死、腐爛，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。隨著蔬菜保護(hù)地栽培的興起，低溫、高濕、密集、不透風(fēng)的環(huán)境有利于灰霉病的侵染和危害，使其由香蔥生產(chǎn)上的次要病害上升為主要病害。

蔥屬蔬菜灰霉病自1876年后陸續(xù)被澳大利亞、德國、日本等國報道[4]，國內(nèi)有關(guān)蔥屬蔬菜灰霉病的報道較少[5-7]，且鮮見香蔥灰霉病的報道。2016年3—5月，經(jīng)過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，孝感肖港香蔥產(chǎn)區(qū)和湖北工程學(xué)院試驗基地香蔥灰霉病田間發(fā)生極嚴(yán)重。因此，采集病樣，根據(jù)柯赫氏法則對病原菌進(jìn)行分離純化及致病性檢驗，采用形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法鑒定代表菌株AG-1，明確病原種類后對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期增加對香蔥灰霉病的了解，為科學(xué)有效地防控香蔥灰霉病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1病原菌鑒定

1.1.1 病原菌的分離 病樣為孝感肖港香蔥產(chǎn)區(qū)及湖北工程學(xué)院試驗基地的香蔥病葉，病原菌的分離參考Zhang等[7]的方法，并于25 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后，鏡檢，挑取所有疑似的單菌落分別接入新鮮馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)平板中培養(yǎng)。經(jīng)4次純化后，將所獲菌株置于30%的甘油中-20 ℃保藏。

1.1.2 致病性測定 采用離體接種法測定。將新鮮健康的香蔥植株采回后，用自來水沖洗干凈并擦干水珠，置于鋪有濕潤濾紙的托盤中，取培養(yǎng)2 d的菌餅(直徑d=6 mm)接種于經(jīng)刺傷的離體葉片上，以接種瓊脂塊為對照。重復(fù)處理20株香蔥，蓋上保鮮膜，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)4 d后，觀察記錄發(fā)病情況及病斑直徑。對發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，鏡檢觀察菌落及分生孢子形態(tài)。試驗重復(fù)3次。用新鮮健康的青椒、生菜、紅椒、草莓、黃瓜、甘藍(lán)、油菜、番茄、葡萄和小白菜對香蔥灰霉病病原菌的寄主范圍進(jìn)行測定。

1.1.3 病原菌形態(tài)觀測 將純化后的菌種接種到PDA平板上，于25 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d。觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形態(tài)及大小等特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[8]和陸家云[9]的方法進(jìn)行病原菌鑒定。

1.1.4 病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析 根據(jù)何月秋[10]的方法提取病原菌的DNA，置于-20 ℃保存。采用通用引物ITS4和ITS5[11]擴(kuò)增rDNA的ITS區(qū)。ITS4為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系50 μL：DNA模板1 μL、ddH2O 23.6 μL、引物各0.2 μL、2×PCR Master 25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共設(shè)34個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠在100 V、90 mA的條件下進(jìn)行電泳檢測，并委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序結(jié)果拼接后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，通過與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比對，找出相似性高的序列，再利用MEGA 7軟件中的Maximum Likelihood(最大似然法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2病原菌生物學(xué)特性分析

1.2.1 不同培養(yǎng)基對香蔥灰霉病病原菌生長的影響試驗 設(shè)置10個處理，分別為PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)、清水瓊脂培養(yǎng)基(WA)、沙氏培養(yǎng)基(SDA)、燕麥培養(yǎng)基(OA)、玉米粉培養(yǎng)基(CMM)、查氏培養(yǎng)基(CA)、高氏1號培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPGA)[12]。將培養(yǎng)2 d的菌餅(d=6 mm)分別接種至不同的培養(yǎng)基平板中央，每個處理重復(fù)4次，于恒溫25 ℃暗培養(yǎng)3 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并進(jìn)行統(tǒng)計分析[13]。

1.2.2 不同碳源對香蔥灰霉病病原菌生長的影響試驗 設(shè)置10個處理，分別以甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、木糖、乳糖、D-山梨醇、可溶性淀粉、肌醇、D-半乳糖9種碳源代替CA培養(yǎng)基中的蔗糖，以無碳的處理作為對照(CK)[14]。將培養(yǎng)2 d的菌餅(d=6 mm)分別接種至不同的培養(yǎng)基平板中央，每個碳源處理重復(fù)4次，于恒溫25 ℃暗培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 不同氮源對香蔥灰霉病病原菌生長的影響試驗 設(shè)置12個處理，分別以硝酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、L-丙氨酸、草氨酸、L-賴氨酸、氯化銨、甘氨酸、酵母粉、硫酸銨11種氮源代替CA培養(yǎng)基中的硝酸鈉，以無氮的處理作為對照(CK)[14]。將培養(yǎng)2 d的菌餅(d=6 mm)分別接種至不同的培養(yǎng)基平板中央，每個氮源處理重復(fù)4次，于恒溫25 ℃暗培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 不同溫度對香蔥灰霉病病原菌生長的影響試驗 設(shè)置10個溫度處理，分別為4、5、10、15、20、25、28、30、35、37 ℃。將培養(yǎng)2 d的菌餅(d=6 mm)接種到PDA平板的中央，每個處理重復(fù)4次，于不同的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.5 不同pH值對香蔥灰霉病病原菌生長的影響試驗 設(shè)置9個pH值處理，分別調(diào)整培養(yǎng)基的pH值達(dá)到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。將培養(yǎng)2 d的菌餅(d=6 mm)接種至不同pH值的PDA平板中央，每個處理重復(fù)4次，于恒溫25 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6 香蔥灰霉病病原菌的致死溫度測定 將菌餅(d=6 mm)置于裝有5 mL無菌水的離心管中，將離心管分別置于40～65 ℃(溫度梯度為1 ℃)的恒溫水浴鍋中處理10 min，迅速冷卻后，接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，以未經(jīng)處理的菌絲塊為對照。每個處理重復(fù)4次，試驗重復(fù)3次，于恒溫25 ℃條件下暗培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察。有菌絲生長的記作“+”，沒有菌絲生長的記作“-”。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單的統(tǒng)計處理，采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)做進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1香蔥灰霉病病原菌的致病性及寄主范圍

2.1.1 致病性 采用刺傷接種法將分離所得菌株(編號AG-1)接至新鮮健康的香蔥葉上，4 d后可觀察到灰色霉層，接種發(fā)病癥狀(圖1A)與自然條件下(圖1B)一致，對照處理未發(fā)病(圖1C)。從接種發(fā)病的香蔥葉片上再分離得到的菌株與接種菌形態(tài)相同，依據(jù)柯赫氏法則確定接種菌為香蔥灰霉病的病原菌。

A：接種香蔥發(fā)??； B：香蔥灰霉病癥狀； C：接種對照； D：病原菌在PDA平板上的菌落形態(tài)； E：分生孢子； F：分生孢子梗

圖1香蔥灰霉病癥狀及病原菌形態(tài)

2.1.2 寄主范圍 香蔥灰霉病病原菌對供試的蔬菜和水果均有不同程度的侵染(表1)。依據(jù)病斑直徑可知，最易被侵染的寄主植物為青椒，其后依次為生菜、紅椒、草莓、黃瓜、甘藍(lán)、油菜、番茄、葡萄、小白菜；在接種總?cè)~(果)數(shù)中，除甘藍(lán)發(fā)病率為86%外，其余幾種蔬菜和水果發(fā)病率均為100%。以上結(jié)果表明，香蔥灰霉病病原菌具有非寄主?；浴?/p>

2.2香蔥灰霉病病原菌的鑒定

將從香蔥病葉上分離得到的病原菌菌株AG-1接種到PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長迅速；菌落初為白色，后為灰白色，菌絲濃密，邊緣整齊(圖1D)；分生孢子橢圓形或卵圓形，單孢，無色至淡褐色，表面光滑，大小為(9.2～12.3)μm×(6.8～10.0)μm(圖1E)；分生孢子著生在小梗上聚集成葡萄穗狀，分生孢子梗單生或叢生，褐色至淺褐色，大小為(212～298)μm×(10～14)μm(圖1F)；菌核黑色且形狀不規(guī)則。

表1 香蔥灰霉病病原菌致病性測定結(jié)果

注：發(fā)病率=病葉(果)數(shù)/接種總?cè)~(果)數(shù)×100%。

將測序所得病原菌ITS區(qū)序列(567 bp)與GenBank中已知序列進(jìn)行比對，選取湖北省已報道的蔥屬蔬菜葡萄孢屬真菌進(jìn)行多序列比對分析，以褐腐病菌(Moniliniafructigena)為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。所測序列與GenBank中灰葡萄孢菌(B.cinerea)的序列(登錄號KR055050.1)相似性為100%。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征和ITS序列比對結(jié)果，確定香蔥灰霉病的病原為灰葡萄孢菌(B.cinereaPers.)。

圖2 香蔥灰霉病菌株AG-1基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3香蔥灰霉病病原菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響 供試的10種不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響差異顯著(表2)，PDA培養(yǎng)基和SDA培養(yǎng)基上病菌生長最快，菌落直徑均為84.00 mm，生長速率為28.00 mm/d，但PDA培養(yǎng)基上菌絲密集程度高于SDA培養(yǎng)基；其次是PSA培養(yǎng)基，菌落直徑可達(dá)78.79 mm，生長速率為26.26 mm/d；WA培養(yǎng)基最不利于菌絲的生長，菌落直徑只有26.04 mm，且菌絲稀疏。

表2 不同培養(yǎng)基對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響

注：(1)表中同列數(shù)據(jù)后面不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；(2)++++表示菌絲非常濃密，+++表示菌絲濃密，++表示菌絲比較濃密，+表示菌絲稀疏。下同。

2.3.2 不同碳源對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響 香蔥灰霉病病原菌對不同碳源的利用能力存在差異(表3)。病菌在含有不同碳源的9種培養(yǎng)基中生長狀況均好于對照，說明病菌對碳源的要求不高。其在可溶性淀粉作為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑為70.53 mm，生長速率為17.63 mm/d；其次是肌醇和葡萄糖，菌落直徑分別為64.28 mm和63.61 mm，生長速率依次為16.07 mm/d和15.90 mm/d；相對不利于病菌生長的碳源是D-山梨醇，菌落直徑為55.44 mm，生長速率為13.86 mm/d。

表3 不同碳源對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.3.3 不同氮源對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響 不同氮源對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響差異顯著(表4)。以酵母粉作為氮源的培養(yǎng)基最利于病菌的生長，菌落直徑為84.00 mm，生長速率為21.00 mm/d；其次是蛋白胨，菌落直徑為70.91 mm，生長速率為17.73 mm/d；尿素和草氨酸不利于病菌生長，菌落直徑分別為31.97 mm和30.17 mm，生長速率依次為7.99 mm/d和7.54 mm/d，與CK相比表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

表4 不同氮源對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.3.4 不同溫度對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響 香蔥灰霉病病原菌在4～30 ℃均能生長(表5)。溫度在15～25 ℃時，病原菌菌絲生長最快，生長速率可達(dá)28.00 mm/d，尤其25 ℃時病原菌菌絲生長非常濃密；溫度大于30 ℃時，病原菌菌絲停止生長。

表5 不同溫度對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響

注：-表示菌絲不能生長。

2.3.5 不同pH值對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響 在pH值為4.0～12.0條件下，病原菌都能生長(表6)。pH值為5.0～6.0時最適宜病原菌生長，菌落直徑可達(dá)84.00 mm，生長速率為28.00 mm/d，且菌絲非常濃密。當(dāng)pH值大于6.0時，病原菌菌落直徑隨pH值的增大而減小，說明偏酸的環(huán)境更有利于香蔥灰霉病病原菌的生長。

表6 不同pH值對香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.3.6 香蔥灰霉病病原菌的致死溫度 病原菌經(jīng)過40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51 ℃處理10 min后，接種到新鮮的PDA培養(yǎng)基上有菌絲生長，而52 ℃及以上溫度處理后，接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基上未見菌絲生長，表明52 ℃(10 min)是香蔥灰霉病病原菌的致死溫度。

3 結(jié)論與討論

本研究所得的病樣經(jīng)分離純化病原菌后，根據(jù)柯赫氏法則、形態(tài)特征及分子鑒定的結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊》等[8-9]，確定引起孝感香蔥灰霉病的病原為葡萄孢屬的灰葡萄孢菌(B.cinereaPers.)。

生物學(xué)特性研究表明：病原菌在供試的10種培養(yǎng)基上均能生長，最適宜培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最不適合的培養(yǎng)基為WA培養(yǎng)基；供試的碳源中最利于病原菌菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，最不適宜的碳源為D-山梨醇；最適合病原菌菌絲生長的氮源為酵母粉，最不適合的氮源為草氨酸和尿素；在pH值為4.0～12.0條件下病原菌都能生長，最適pH值為5.0～6.0；病原菌在4～30 ℃均能生長，適合病原菌菌絲生長的溫度為15～25 ℃，25 ℃時病原菌菌絲不僅生長快且非常濃密，溫度大于30 ℃時，病原菌菌絲停止生長；菌絲致死溫度是52 ℃(10 min)。最利于香蔥灰霉病病原菌菌絲生長的pH值和溫度范圍與張鵬[13]報道的葡萄灰霉病菌及朱建蘭[15]報道的番茄灰霉病菌基本一致，但在病原菌對培養(yǎng)基和碳源的利用方面，與張鵬[13]研究的葡萄灰霉病菌有差異。

致病性測定結(jié)果表明，香蔥灰霉病病原菌對供試的蔬菜和水果均有不同程度的侵染，體現(xiàn)了病原菌的非寄主?；?。李建廠等[5]研究了陜西大蔥灰霉病菌(灰葡萄孢菌)對油菜的致病性，結(jié)果表明，在室內(nèi)離體接種和田間接種情況下該菌均不侵染油菜，而本研究中得出，在離體接種的條件下，香蔥灰葡萄孢菌可以侵染油菜，這可能與不同環(huán)境下不同寄主上病原菌的致病力分化和遺傳差異有關(guān)，具體原因有待深入研究。

目前，關(guān)于香蔥的研究報道主要是栽培模式、配方施肥及一些有益化合物提取方面[16-21]，有關(guān)病蟲害的防治研究較少，但病害對香蔥的產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大的影響，亟需加強(qiáng)研究。掌握香蔥灰霉病病原、生物學(xué)特性及發(fā)病規(guī)律成為現(xiàn)今防治香蔥灰霉病的關(guān)鍵，可為科學(xué)有效地防治香蔥灰霉病提供理論依據(jù)。本試驗鑒定了孝感香蔥灰霉病的病原菌，并對其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，而有關(guān)香蔥灰霉病病原菌孢子的生物學(xué)特性、病害的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)，以及我國其他香蔥產(chǎn)區(qū)的病原情況是否相同，主要病原菌有哪些，還需要做進(jìn)一步研究。另外，尿素、草氨酸等對香蔥灰霉病病原菌有抑制作用的氮源能否在病害防治方面加以利用以及能否通過合理施肥控制該病害的發(fā)生，也有待進(jìn)一步研究。

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Identification and Biological Characterization of the Pathogen ofAlliumascalonicumGray Mould

LI Congli1,2,YANG Yajie1,FU Benzhong1,ZHANG Zhilin1,FU Yinglin3,LI Guoyuan1*

(1.College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University/Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables,Xiaogan 432000,China； 2.College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China； 3.Xiaogan Wildlife and Forest Plant Protection Station,Xiaogan 432000,China)

In order to identify the pathogen and its biological characteristics ofAlliumascalonicumgray mould,the pathogen was isolated from diseased leaves ofA.ascalonicumby single spore isolation method.Based on the morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis,the pathogen ofA.ascalonicumgray mould was identified asBotrytiscinereaPers..The biological characteristics ofB.cinereawere studied,and the results showed that the pathogen was able to grow on the ten media tested,during which the optimum medium for the growth of the pathogen was PDA medium.In the nine carbon sources and eleven nitrogen sources tested,the optimum carbon and nitrogen sources were soluble starch and yeast powder respectively.The pathogen could grow in pH from 4.0 to 12.0,while the optimal pH was 5.0—6.0.The pathogen could grow at 4—30 ℃,and 15—25 ℃ was suitable for the mycelia growth.The mycelia grew quickly and very densely at 25 ℃,when the temperature was above 30 ℃,the mycelia growth stopped.The mycelia lethal temperature was 52 ℃ for 10 min.

Alliumascalonicum; gray mould; pathogen; biological characteristics;Botrytiscinerea

2017-03-16

湖北省教育廳重點項目(D20102704，D20102703)；湖北省重點實驗室開放基金重點項目(2016K03)

李聰麗(1991-)，女，湖北麻城人，在讀碩士研究生，研究方向：植物病理。 E-mail:licongli1124@163.com

*通訊作者：李國元(1964-)，男，湖北孝感人，教授，主要從事植物保護(hù)方面的研究。 E-mail:lgy64662@sohu.com

S436.33

： A

： 1004-3268(2017)09-0073-06