翟羽晨，王萬能*，項鋼燎，張瀟駿，劉 欽，唐曉蓮，戴 亞，馬擴彥，譚蘭蘭

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054; 2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶 400060; 3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610000)

BCA-TCA法快速測定煙草蛋白質(zhì)的研究

翟羽晨1，王萬能1*，項鋼燎1，張瀟駿1，劉 欽1，唐曉蓮1，戴 亞2，馬擴彥2，譚蘭蘭3

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054; 2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶 400060; 3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610000)

為快速準(zhǔn)確地測定煙草中的蛋白質(zhì)含量，建立并優(yōu)化了BCA-TCA法，即提取煙葉蛋白質(zhì)的最佳體系條件為pH值7.0的0.05 mol/L PBS緩沖液、液料比40 mL/g，使用TCA沉淀蛋白質(zhì)，利用差減法去除煙葉中還原性物質(zhì)對BCA方法準(zhǔn)確性的影響，從而準(zhǔn)確測定樣品的蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明：該方法測得的煙葉樣品蛋白質(zhì)含量變異系數(shù)小于5%，重復(fù)性較好；樣品的加標(biāo)回收率為96.39%，加標(biāo)回收變異系數(shù)為0.75%<2%,準(zhǔn)確度高；BCA-TCA法和克達爾法測定值的t檢驗結(jié)果為t=1.554 5

煙草； 蛋白質(zhì)； BCA-TCA法； 測定

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位。蛋白質(zhì)是煙葉的重要化合物，過多的蛋白質(zhì)會增加煙葉燃燒時的苦味和燒焦羽毛味[1]，因此，快速準(zhǔn)確地測定煙草中的蛋白質(zhì)含量對及時評價煙葉品質(zhì)具有重要意義。蛋白質(zhì)含量測定方法有凱氏定氮法、克達爾法、Lowry法、二喹啉甲酸(BCA)法等[2-4]。國際上常采用克達爾法或改良的凱氏定氮法測定煙葉蛋白質(zhì)含量，雖然測定較準(zhǔn)確，但由于操作繁瑣、檢測周期長，限制了其應(yīng)用和推廣[5-6]；連續(xù)流動分析法已在國內(nèi)煙草行業(yè)普遍使用[7]，但其耗時達10 h以上[8]，而且這些方法測得的為總氮量，受樣品中非蛋白質(zhì)氮的影響，無法真正準(zhǔn)確地測得煙葉的蛋白質(zhì)含量。BCA法的原理是在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+作用生成的Cu+，然后與BCA結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，該復(fù)合物在562 nm處有最大吸光值，通過測定復(fù)合物的濃度而計算得到蛋白質(zhì)的含量[9]，該方法具有快速、操作簡便、成本低、靈敏度及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點[10-13]，但BCA法測定蛋白質(zhì)會受到還原性物質(zhì)的干擾影響[14]。而三氯乙酸(TCA)可以使蛋白質(zhì)沉淀，可用于分離蛋白質(zhì)[15-16]。鑒于此，根據(jù)煙草蛋白質(zhì)的特點，使用TCA沉淀蛋白質(zhì)，利用差減法消除煙葉中還原性物質(zhì)對BCA方法測定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，旨在為更加精確地測定煙葉中的蛋白質(zhì)含量提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

煙葉經(jīng)過烘干處理后剪碎，粉碎成粉末裝于封口袋中。所用煙葉樣品的具體情況見表1。

表1 煙葉樣品產(chǎn)地和品名

主要試劑： BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(SIGMA-ALDRICH)、磷酸氫二鈉(AR)、磷酸二氫鈉(AR)、牛血清蛋白質(zhì)(AR)、TCA(15%三氯乙酸水溶液)、PBS(磷酸緩沖液，pH值6～8)。

主要儀器：ELX808酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、TGL-16M高速臺式冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)、ALC-110.4型精密電子天平(德國賽多利斯集團公司,精度0.000 1 g)、KD-98-1型電熱恒溫水浴鍋(南北儀器生產(chǎn)廠)、85-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(金壇市精密儀器制造有限公司)、SHZ-D9型循環(huán)水式真空泵(上海坦?jié)蓛x器設(shè)備有限公司)、DW-86L386超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)、FE20梅特勒-托利多實驗室pH計(梅特勒-托利多上海有限公司)、MP2002型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、QL-901快速混勻器(其林貝爾儀器制造公司)。

1.2方法

1.2.1 試劑的配制 BCA工作液：將BCA試劑盒中A液(BCA堿性溶液)和B液(硫酸銅溶液)按體積比50∶1混合得BCA工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：BCA試劑盒中提供的2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)母液。

1.2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用PBS將2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)母液配制成0、25、50、125、250、500 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。酶標(biāo)板每孔加入25 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)工作溶液和200 μL BCA工作液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，取出后快速冷卻至室溫，在波長為562 nm處用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，制得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)工作曲線。

1.2.3 煙葉蛋白質(zhì)的提取 準(zhǔn)確稱取0.5 g煙葉樣品粉末于玻璃勻漿器中，加入10 mL PBS研磨。將勻漿液在4 ℃條件下以4 000 r/min離心5 min。上清液用中速濾紙過濾，離心分離得到的殘渣采用上述方法研磨、離心、過濾，重復(fù)上述操作2次。收集總過濾液用PBS定容至250 mL，得到樣品液。

緩沖液濃度、pH值、液料比這3個因素對蛋白質(zhì)得率均具有直接影響。分別對pH值、緩沖液濃度、液料比進行單因素試驗優(yōu)化，確定煙葉中蛋白質(zhì)的最佳提取條件，并進行重復(fù)性和加標(biāo)回收試驗以驗證其準(zhǔn)確性。

1.2.4 提取樣品液中蛋白質(zhì)含量的檢測 取1.2.3所得樣品液2 mL于10 mL離心管，加入3倍體積的PBS，混勻，標(biāo)為1號待測液；另取上述所得的煙葉樣品液2 mL于10 mL 離心管，加3倍體積的15% TCA，混勻，于37 ℃水浴中孵育10 min，再于20～25 ℃條件下以10 000 r/min離心10 min[17]，取上清液標(biāo)為2號待測液。分別取25 μL上述2個待測液于96微孔板中，并在每孔中加入200 μL BCA工作液，充分混勻，37 ℃恒溫水浴30 min，快速冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，每個待測液平行測定3次，取平均值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的回歸曲線方程和待測液樣品的吸光度值計算蛋白質(zhì)含量，公式如下：

式中，X為煙葉樣品蛋白質(zhì)的百分含量(%)；V為樣品液定容后的總體積(mL)；C1為1號待測液中與BCA反應(yīng)的總物質(zhì)的質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為2號待測液中與BCA反應(yīng)的非蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(μg/mL)；m為所稱煙葉樣品質(zhì)量(g)；G為水分校正系數(shù)(物質(zhì)干質(zhì)量占總量的百分比)；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1煙葉樣品中蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取液最優(yōu)pH值的確定 分別配制pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.09mol/LPBS緩沖液，以液料比為40mL/g進行蛋白質(zhì)提取，按1.2方法進行提取和測定，比較蛋白質(zhì)得率。由圖1可見，當(dāng)提取液pH值從6.0上升至8.0時，煙葉蛋白質(zhì)得率呈先升高后下降的趨勢，并且在提取液pH值為7.0時，煙葉蛋白質(zhì)得率最高，為91.4mg/g。故選擇pH值7.0為PBS提取液的最優(yōu)pH值。

圖1 提取液pH值對蛋白質(zhì)提取的影響

2.1.2 提取液最優(yōu)濃度的確定 分別配制0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mol/L的 pH值為7.0的PBS緩沖液，以液料比為40 mL/g按1.2方法進行蛋白質(zhì)提取和測定，比較蛋白質(zhì)提取效率。由圖2可見，當(dāng)緩沖液濃度提高到0.05 mol/L后，蛋白質(zhì)得率為92.1 mg/g，之后，繼續(xù)增加緩沖液濃度，蛋白質(zhì)得率基本保持不變，故選擇提取緩沖液濃度為0.05 mol/L。

2.1.3 最優(yōu)液料比的確定 配制0.05 mol/L pH值為7.0的PBS緩沖液，以液料比20、30、40、50、60 mL/g 按1.2方法進行蛋白質(zhì)提取和測定，比較蛋白質(zhì)得率。由圖3可以看出，提取煙葉蛋白質(zhì)的研磨液料比為40 mL/g時，蛋白質(zhì)得率達到最大值，為93.1 mg/g，隨著液料比繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)得率基本沒有太大的變化。故選擇液料比40 mL/g為提取蛋白質(zhì)的最優(yōu)液料比。

圖2 提取液濃度對蛋白質(zhì)提取的影響

圖3 磨漿液料比對蛋白質(zhì)提取的影響

2.2方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 通過試驗測定分析，在波長為562 nm處將測得的吸光度值與對應(yīng)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進行線性回歸，回歸方程為：y=0.001x+0.089[y為吸光度，x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)]，R2=0.997>0.995,該曲線可作為測定煙葉蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。該方程表明，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0～0.5 mg/mL，與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖4 牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 重復(fù)性驗證 采用本法測定了9個煙葉樣品的蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3次，結(jié)果如表2，所有待測煙葉樣品的蛋白質(zhì)含量變異系數(shù)均小于5%，說明本法具有較好的重復(fù)性。

2.2.3 加標(biāo)回收試驗 取2 mL煙葉樣品蛋白提取液于10 mL離心管中，再加入相當(dāng)于樣品中蛋白質(zhì)含量86.96%、108.70%、130.43%的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，按1.2中檢測方法進行檢測，并計算加標(biāo)回收率(至少重復(fù)試驗3次)，加標(biāo)回收數(shù)據(jù)見表3。由表3可見，樣品的加標(biāo)回收率平均值在95.38%～97.25%，變異系數(shù)為0.75%<2%,說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表2 煙葉樣品中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

表3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加標(biāo)回收測定結(jié)果

2.3BCA-TCA法與克達爾法的比較

為了驗證BCA-TCA法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，參照YC/T 166—2003，按現(xiàn)行的克達爾法同時測定9個待測煙葉樣品中的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表4。由表4可以看出，2種方法所測得的蛋白質(zhì)含量的相對偏差皆小于6%。對2種方法所測得的結(jié)果進行t檢驗,t=1.554 5

表4 BCA-TCA法與克達爾法的比較結(jié)果 %

3 結(jié)論與討論

經(jīng)優(yōu)化，煙葉蛋白質(zhì)提取的最佳體系為pH值7.0的0.05 mol/L PBS緩沖液、液料比40 mL/g。與克達爾法相比，采用BCA-TCA法所測得的蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)相差不大，相對偏差皆小于6%。對 2種方法所測得的結(jié)果進行t檢驗，結(jié)果為t=1.554 5

本研究確定的BCA-TCA測定法，因其去除了還原糖和非蛋白質(zhì)氮對BCA法測蛋白質(zhì)含量的影響，能更加準(zhǔn)確測定煙葉的蛋白質(zhì)含量，所測數(shù)值更加真實、準(zhǔn)確，將本方法進行推廣將大大提高實際生產(chǎn)中煙葉蛋白質(zhì)含量測定的準(zhǔn)確度和效率。

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Rapid Determination of Tobacco Protein by BCA-TCA Method

ZHAI Yuchen1,WANG Wanneng1*,XIANG Gangliao1,ZHANG Xiaojun1,LIU Qin1,TANG Xiaolian1,DAI Ya2,MA Kuoyan2,TAN Lanlan3

(1.College of Pharmaceutical and Bioengineering,Chongqing University of Technology,Chongqing 400054,China;2.China Tobacco Chongqing Industrial Co.,Ltd.,Chongqing 400060,China;3.China Tobacco Sichuan Industrial Co.,Ltd.,Chengdu 610000,China)

For the rapid and accurate determination of the protein content in tobacco,an accurate and efficient BCA-TCA method was established and optimized.The optimum conditions for extracting tobacco protein were 0.05 mol/L PBS buffer at pH 7.0,and liquid-solid ratio was 40 mL/g.Differential subtraction was used to accurately determine the sample protein content,through removing the impact of interfering substances by using TCA to precipitate proteins.The results showed that the coefficient of variation of protein content was less than 5% and the reproducibility was good.The standard recovery rate of the samples were 96.39%,the coefficient of variation was 0.75%<2% and the accuracy was high.Thettest results of the BCA-TCA method and the Kedar method weret=1.554 5

tobacco; protein; BCA-TCA; determination

2017-05-31

川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目(2014Q116)

翟羽晨(1994-)，男，山西臨汾人，本科，主要從事分析檢測方面的研究。E-mail:648411151@qq.com

*通訊作者：王萬能(1971-)，男，四川開江人，教授，博士，主要從事生物工程方面的研究。E-mail:wannengw@cqut.edu.cn

TS41+1

： A

： 1004-3268(2017)09-0156-05