高小朋，包本開，楊佳娟，劉 蕊

(延安大學(xué)，陜西 延安 716000)

馬拉硫磷降解菌株MN-13的降解性能測定及其培養(yǎng)基優(yōu)化

高小朋，包本開，楊佳娟，劉 蕊

(延安大學(xué)，陜西 延安 716000)

為了利用微生物降解土壤中殘留的有機磷農(nóng)藥，采用磷鉬藍比色法測定了菌株MN-13降解馬拉硫磷及其他有機磷農(nóng)藥的性能，并通過單因素選擇、正交優(yōu)化試驗對試驗菌株的生長培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，試驗菌株MN-13對25%馬拉硫磷、40%氧化樂果、50%乙基對硫磷的降解率分別達到91.52%、69.24%、49.68%。培養(yǎng)基優(yōu)化中，通過單因素試驗選擇的碳源、氮源、NaCl及pH值的中心點分別為葡萄糖1.5%、牛肉膏1.0%、NaCl 0.5%、pH值8.0；以此為基礎(chǔ)進行正交試驗，優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.5%、牛肉膏1.2%、NaCl 0.6%、pH值8.5，菌體OD600比優(yōu)化前提高了33.1%。綜上，MN-13菌株可有效降解馬拉硫磷等有機磷農(nóng)藥，其在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中生長量有所提高。

馬拉硫磷； 微生物降解； MN-13菌株； 降解率； 培養(yǎng)基； 優(yōu)化

有機磷農(nóng)藥是我國使用最為廣泛的一類農(nóng)藥，其產(chǎn)量占整個農(nóng)藥產(chǎn)量的30%左右[1]，然而此類農(nóng)藥在廣泛應(yīng)用的同時也帶來了嚴重的環(huán)境問題。馬拉硫磷是一種高效、高毒的有機磷殺蟲劑，廣泛用于農(nóng)作物蟲害的防治[2]。但其殘留時間長，易污染環(huán)境，對人類健康具有潛在的威脅，其在環(huán)境中的殘留已廣受關(guān)注。

有研究表明，微生物對土壤、水體中殘留的有機磷農(nóng)藥具有很好的降解作用，且不會造成二次污染[3]。目前已報道的有機磷農(nóng)藥降解菌主要有黃桿菌、芽孢桿菌等[4]，對有機磷農(nóng)藥水解酶及其基因的研究也已有報道[5]。微生物法降解殘留農(nóng)藥是治理農(nóng)藥殘留污染的有效途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，研究馬拉硫磷的微生物降解具有重要的意義。

延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室前期從長期噴施馬拉硫磷的土壤中分離得到1個可降解馬拉硫磷的菌株MN-13[6]，本研究對其降解馬拉硫磷及其他有機磷農(nóng)藥的性能進行了測定和比較，并對其生長培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以期為采用微生物法降解土壤中殘留的有機磷農(nóng)藥提供參考。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 試驗菌株 MN-13菌株由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 試劑 試劑主要包括馬拉硫磷乳油(25%，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司)、氧化樂果乳油(40%，山東淄博張店農(nóng)業(yè)有限公司)、乙基對硫磷(50%，天津市豐達化工有限公司)、氯化亞錫(分析純，如皋市天成化工有限公司)、鉬酸銨(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)等。

1.1.3 儀器 儀器主要包括立式壓力蒸汽滅菌器(LS-850L，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)、紫外分光光度計(UV2550，日本島津公司)等。

1.1.4 培養(yǎng)基 參照文獻[7]進行配制。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、去離子水1 000 mL,pH值7.2；無機鹽培養(yǎng)基：NaNO32.0 g、KCl 0.5 g、MgSO40.02 g、CaCl20.04 g、去離子水1 000 mL，pH值6.5。

1.2方法

1.2.1 MN-13菌株對有機磷農(nóng)藥的降解率測定

1.2.1.1 磷標準曲線的繪制 采用磷鉬藍比色法[8-9]，用分光光度計測定不同濃度的標準磷溶液在697 nm處的吸光度，以有機磷濃度為橫坐標、OD697為縱坐標制作磷標準曲線。

1.2.1.2 有機磷農(nóng)藥降解率的測定 取無機鹽培養(yǎng)基50 mL，分別加入25%馬拉硫磷、40%氧化樂果、50%乙基對硫磷25 μL，以2%接種量接入活化好的MN-13菌液作為試驗組，以不加菌液的處理作為對照組，在32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d時取樣測定OD697，參照磷標準曲線得到磷含量，利用下面公式計算3種有機磷農(nóng)藥的降解率[10-11]。

有機磷降解率=(對照組磷含量-試驗組磷含量)/對照組磷含量×100%。

1.2.2 MN-13菌株生長培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素法確定各因素中心點 (1)以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加2.0%的乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源[12]，以酵母粉作為對照，其他成分不變，按1%接種量接入活化好的菌液，在32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后測定菌體OD600，據(jù)此來進行碳源的選擇。在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上分別選擇1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的添加量進行培養(yǎng)，確定菌株MN-13生長最適的碳源含量。

(2)以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加1.0%的酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、尿素作為氮源，以胰蛋白胨作為對照，其他成分不變，按1%接種量接入活化好的菌液，在32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后測定菌體OD600，據(jù)此進行氮源的選擇。在確定最佳氮源的基礎(chǔ)上分別選擇0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的添加量進行培養(yǎng)，確定菌株MN-13生長最適的氮源含量。

(3) LB培養(yǎng)基中，其他成分不變，NaCl加入量分別設(shè)置為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，按1%接種量接入活化好的菌液，在32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后測定菌體OD600，確定菌株MN-13生長最適的NaCl含量。

(4)LB培養(yǎng)基中，其他成分不變，分別調(diào)節(jié)初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，按1%接種量接入活化好的菌液，在32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后測定菌體OD600，確定菌株MN-13生長最適的pH值。

1.2.2.2 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)以上單因素試驗所得到的各因素的中心點，上下各取1個值，作為各因素的不同水平，利用L9(34)正交試驗對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、NaCl含量以及pH值進行優(yōu)化。

1.2.2.3 優(yōu)化結(jié)果驗證試驗 培養(yǎng)條件不變，將MN-13菌株分別接入優(yōu)化前、后的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，24 h后測定OD600，進行優(yōu)化結(jié)果驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1MN-13菌株對馬拉硫磷、氧化樂果、乙基對硫磷的降解性能

從圖1可知，菌株MN-13對馬拉硫磷、氧化樂果和乙基對硫磷均有降解能力，且隨時間的推移，降解率逐漸增加，均在6 d時達到最大，分別為91.52%、69.24%、49.68%。培養(yǎng)3～7 d內(nèi)，試驗菌株對馬拉硫磷的降解率明顯高于其他2種農(nóng)藥。以上試驗結(jié)果表明，MN-13是一株有機磷農(nóng)藥高效、廣譜降解菌，除了能降解馬拉硫磷外，還能較好地降解氧化樂果和乙基對硫磷。

圖1 MN-13菌株對有機磷農(nóng)藥的降解性能

2.2MN-13菌株培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同碳源及其含量對MN-13菌株生長的影響

2.2.1.1 不同碳源的影響 由圖2可知，菌株MN-13在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長最好，OD600為0.804，說明相比較其他4種碳源，葡萄糖能夠更好地被MN-13菌株利用并促進其生長，因此確定葡萄糖為最佳碳源。

圖2 不同碳源對MN-13菌株生長的影響

2.2.1.2 葡萄糖含量的影響 由圖3可知，采用以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，當(dāng)其中的葡萄糖含量為1.5%時，MN-13菌株的生長量最大，OD600達到0.972。因此，選擇1.5%葡萄糖設(shè)計后續(xù)正交試驗。

圖3 葡萄糖含量對MN-13菌株生長的影響

2.2.2 不同氮源及其含量對MN-13菌株生長的影響

2.2.2.1 不同氮源的影響 從圖4可以看出，與無機氮源相比，有機氮源更有利于試驗菌株MN-13的生長，其在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中生長情況最好，OD600達到0.901。因此，確定牛肉膏為最佳氮源。

圖4 不同氮源對MN-13菌株生長的影響

2.2.2.2 牛肉膏含量的影響 從圖5可以看出，采用以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)牛肉膏含量為1.0%時，試驗菌株MN-13的生長情況最好，OD600達到0.925。因此，選擇1.0%牛肉膏進行后續(xù)正交試驗設(shè)計。

圖5 牛肉膏含量對MN-13菌株生長的影響

2.2.3 NaCl含量對MN-13菌株生長的影響 由圖6可知，試驗菌株MN-13在NaCl含量為0.5%時生長情況較好，OD600達到0.808。因此，選擇0.5% NaCl進行后續(xù)正交試驗設(shè)計。

圖6 NaCl含量對MN-13菌株生長的影響

2.2.4 初始pH值對MN-13菌株生長的影響 由圖7可知，培養(yǎng)基初始pH值過低，不利于MN-13菌株的生長，在初始pH值為8.0時，菌株生長情況最好，OD600達到0.887。因此，選擇初始pH值8.0進行后續(xù)正交試驗設(shè)計。

圖7 不同初始pH值對MN-13菌株生長的影響

2.3MN-13菌株培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果進行L9(34)正交試驗，試驗方案及結(jié)果見表1。由表1可知，在9個處理的直觀分析中，第3個組合條件下菌株的生長情況最好,OD600為0.925；其次是第6個組合，OD600為0.875。通過分析可知，4個因素的R值大小依次為 D>A>B>C，說明在葡萄糖含量、牛肉膏含量、NaCl含量、pH值等4個因素中，對菌株生長量的影響大小依次是pH值>葡萄糖含量>牛肉膏含量>NaCl含量。從各個因素不同水平對菌株的生長效應(yīng)分析來看,各因素影響菌株生長量的順序分別是A2>A1>A3、B3>B2>B1、C3>C1>C2、D3>D2>D1，因此可以確定培養(yǎng)基最佳組合為A2B3C3D3，即葡萄糖1.5%、牛肉膏1.2%、NaCl 0.6%、pH值8.5。

表1 MN-13菌株培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4MN-13菌株培養(yǎng)基優(yōu)化驗證試驗結(jié)果

保持溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變，分別采用優(yōu)化前、后的培養(yǎng)基培養(yǎng)進行對比試驗，結(jié)果顯示，在優(yōu)化前、后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，試驗菌株MN-13的OD600分別為0.831和1.106，優(yōu)化后提高了33.1%。

3 結(jié)論與討論

有機磷農(nóng)藥在我國使用量大、使用面廣，易于在土壤中短時間積累，并在生物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積作用[13]，對人類健康具有潛在的威脅，而微生物對土壤、水體中殘留的有機磷農(nóng)藥均有很好的降解作用，且不會造成二次污染[3]。本研究使用的菌株MN-13對馬拉硫磷的降解率達到91.52%，另外，其對40%氧化樂果的降解率為69.24%，對50%乙基對硫磷的降解率為49.68%，表明MN-13是一株有機磷農(nóng)藥的高效、廣譜降解菌。

試驗菌株投放到大田中降解殘留農(nóng)藥會受到自然條件、菌體濃度、土壤中其他殘留農(nóng)藥的影響，甚至受到拮抗而不能在該環(huán)境中長期生存[14]，因此，本試驗在研究菌株對馬拉硫磷降解作用的同時，還研究了其對氧化樂果、乙基對硫磷等有機磷農(nóng)藥的降解情況，并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，目的是為了能大量生產(chǎn)，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到有效推廣。單因素試驗和正交試驗是培養(yǎng)基優(yōu)化的常用方法。單因素法每次只能討論1種因素的影響[15]，而正交試驗設(shè)計考慮了因素之間的相互作用。因此，本試驗首先進行單因素分析以選出各因素的中心點，然后進一步進行正交試驗優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果表明，分別在葡萄糖1.5%、牛肉膏1.0%、NaCl 0.5%、pH值8.0的條件下，MN-13菌體生長較好。在此基礎(chǔ)上進行了正交優(yōu)化，確定菌株MN-13生長所需的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.5%、牛肉膏1.2%、NaCl 0.6%、pH值 8.5，為該菌株的有效培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。

據(jù)分析，MN-13菌株降解有機磷農(nóng)藥過程中，是以馬拉硫磷等有機磷為唯一的碳源和能源，通過礦化作用，將農(nóng)藥中的有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷[15-16]，從而使農(nóng)藥失去毒性，同時把馬拉硫磷降解產(chǎn)生的無機磷提供給植物，促進植物的生長。據(jù)報道，某些有機磷農(nóng)藥降解菌的降解基因在質(zhì)粒上[17]，降解酶可通過破壞有機磷農(nóng)藥的磷酯鍵而使其脫毒[18]，關(guān)于菌株MN-13降解馬拉硫磷的降解酶基因以及降解酶的作用機制和特性等問題，有待于進一步研究。

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Degradation Property Characterization and Culture Medium Optimization of Malathion-Degrading Strain MN-13

GAO Xiaopeng,BAO Benkai,YANG Jiajuan,LIU Rui

(Yan’an University,Yan’an 716000,China)

In order to solve the serious non-point source soil pollution problem caused by pesticides and use microbial strains to degrade organophosphorus residues in soil,molybdenum blue spectrophotometry was used to test the performance of strain MN-13 to degrade malathion and other organophosphorus pesticides.At the same time,the methods of single factor selection and orthogonal optimization were applied to optimize the medium.The experimental results showed that the degradation rates of strain MN-13 on 25% malathion,40% omethoate and 50% ethyl parathion were 91.52%,69.24% and 49.68% respectively.By single factor experiments,carbon source,nitrogen source,NaCl and pH of medium were preliminarily determined as glucose 1.5%,beef extract 1.0%,NaCl 0.5% and pH 8.0.After the orthogonal experiment,the medium composition was optimized as follows:glucose 1.5%,beef extract 1.2%,NaCl 0.6% and pH 8.5.The OD600value of this strain was increased by 33.1% after optimization.From the above results,it was concluded that the strain MN-13 could effectively degrade malathion and other organophosphorus pesticides,and it grew better after medium optimization.

malathion; microbial degradation; MN-13; degradation rate; medium; optimization

2017-03-27

國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510719287)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(1447)

高小朋(1976-)，男，陜西洛川人，副教授，碩士,主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究。 E-mail：gaoxiaopengyd@163.com

X592

： A

： 1004-3268(2017)09-0088-05