李紅偉，鐘淡龍，陳 圓，吳曉燕，鄒志冠

(1.惠州學院 生命科學系，廣東 惠州 516007； 2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021)

惠陽胡須雞IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性研究

李紅偉1，鐘淡龍1，陳 圓1，吳曉燕1，鄒志冠2

(1.惠州學院 生命科學系，廣東 惠州 516007； 2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021)

以IGF-Ⅰ和GHRL基因為惠陽胡須雞生長性狀的候選基因，通過測序、酶切等方法對93日齡惠陽胡須雞IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性進行分析，并用GLM模型分析基因型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明： IGF-Ⅰ基因在第181位發(fā)生堿基突變，A突變?yōu)镚，屬于同義突變，BsmⅠ酶切分析發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因只有1種基因型，表明該位點在胡須雞保種群中已經(jīng)純合；GHRL基因在第124位發(fā)生堿基突變，T突變?yōu)镚，改變了酶切位點，通過pflMⅠ酶切分析發(fā)現(xiàn)，GHRL基因有3種基因型，即AA型、AB型和BB型。統(tǒng)計結(jié)果表明，93日齡惠陽胡須雞3種基因型個體間體質(zhì)量無顯著差異。

惠陽胡須雞； IGF-Ⅰ基因； GHRL基因； 基因多態(tài)性

惠陽胡須雞以特有的優(yōu)良肉質(zhì)和三黃胡須雞的外貌特征而馳名，在育種、生產(chǎn)和外貿(mào)活雞市場上都具有較高的經(jīng)濟價值，但存在生長速度慢等缺點。尋找與惠陽胡須雞生長性狀相關(guān)的候選基因，實施分子標記輔助選擇育種十分必要。

IGF-Ⅰ全稱胰島素樣生長因子，對動物生長發(fā)育有重要的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)動物生命活動的重要多肽生長因子之一[1]。Florini等[2]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因通過影響肌纖維的分化、增殖和蛋白質(zhì)沉積，間接影響肌肉的生長速度。趙秀華等[3]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因部分單核苷酸多態(tài)性與京海黃雞生長性狀相關(guān)，認為可應(yīng)用于標記輔助選擇，加快育種進程。而劉大林等[4]研究認為，IGF-Ⅰ基因可能控制著雞的生長性狀和屠體性狀或與控制生長性狀、屠體性狀的主效基因連鎖，可以把IGF-Ⅰ基因作為雞生長、屠體性狀的輔助標記基因。生長素(ghrelin，GHRL)是促進生長激素(growthhormone，GH)分泌的關(guān)鍵因子，可以調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育、增加食欲、調(diào)節(jié)代謝及能量平衡、促進胃酸分泌等[5-10]。動物饑餓時，血液中的GHRL量增加，在促進攝食的同時減少了體內(nèi)脂肪的消耗，引起動物體質(zhì)量增加[11]。巢湖鴨GHRL基因多態(tài)性與胴體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量和全凈膛質(zhì)量等屠體性狀有顯著相關(guān)性[12]。何丹林等[13]研究表明，雞GHRL基因C2100T位點多態(tài)性與雞的部分生長性狀存在顯著相關(guān)性。Fang等[14]研究表明，GHRL基因外顯子1處的8bp插入缺失多態(tài)性與雞生長性狀和屠體性狀顯著相關(guān)，而GHRL基因部分單核苷酸多態(tài)性與雞腹脂質(zhì)量、腿肌粗蛋白含量顯著相關(guān)[15]。

綜上可知，IGF-Ⅰ和GHRL基因與雞生長性狀緊密相關(guān)。因此，以IGF-Ⅰ和GHRL基因為惠陽胡須雞生長性狀的候選基因，分析IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性及其與體質(zhì)量的關(guān)系，以期為今后惠陽胡須雞育種中生長性狀的分子標記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

100份93日齡的惠陽胡須雞血樣采自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司的惠陽胡須雞保種場。將血樣放入含肝素鈉的采血管，-20 ℃保存。

1.2引物設(shè)計與PCR擴增

IGF-Ⅰ基因引物設(shè)計參照文獻[3]，GHRL基因引物設(shè)計參照文獻[15]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 IGF-Ⅰ基因和GHRL基因的引物序列

IGF-Ⅰ、GHRL基因的PCR擴增體系均為25μL：GreenMix12.5μL，無菌水10.5μL，上、下游引物各0.5μL，基因組DNA1μL。

IGF-Ⅰ基因擴增條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30s，53.5 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min；10 ℃保存。GHRL基因擴增條件：94 ℃預(yù)變性2min30s；94 ℃變性30s，52.0 ℃退火45s，72 ℃延伸45s，共32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min；10 ℃保存。

將上述PCR擴增產(chǎn)物純化后送到廣州華大基因公司，利用ABI-3T30儀器進行測序。

1.3基因型檢測

IGF-Ⅰ基因酶切反應(yīng)體系為20μL：BsmⅠ酶0.5μL，10×NEBuffer2μL，PCR產(chǎn)物17.5μL。65 ℃條件下反應(yīng)15min。GHRL基因酶切反應(yīng)體系為20μL：pflMⅠ酶0.5μL，10×NEBuffer2μL，PCR產(chǎn)物17.5μL。37 ℃條件下反應(yīng)15min。酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析儀拍照并進行基因分型。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計不同基因型個體的數(shù)量，計算基因型頻率，并對多態(tài)性片段的基因型分布進行卡方適合性檢驗。利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件中的GLM模型對基因多態(tài)性與體質(zhì)量間的相關(guān)性進行最小二乘分析，統(tǒng)計結(jié)果均以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1IGF-Ⅰ、GHRL基因的PCR擴增結(jié)果

從圖1和圖2可以看出，IGF-Ⅰ、GHRL基因特異性擴增良好，沒有出現(xiàn)非特異性條帶和引物二聚體，擴增片段長度與預(yù)期大小相符，可以進一步用來測序和酶切鑒定。

M.DNA Marker； 1—6.PCR擴增產(chǎn)物圖1 IGF-Ⅰ基因的PCR擴增結(jié)果

M.DNA Marker； 1—5.PCR擴增產(chǎn)物圖2 GHRL基因的PCR擴增結(jié)果

2.2IGF-Ⅰ、GHRL基因測序結(jié)果

對IGF-Ⅰ基因的測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)1個突變位點，突變位點在第181位，由A突變?yōu)镚，導致密碼子GAA突變?yōu)镚AG，但沒有改變編碼氨基酸，屬于同義突變。同時，對突變位點限制性酶切位點分析發(fā)現(xiàn)，未突變的IGF-Ⅰ基因能被BsmⅠ酶切，突變后的IGF-Ⅰ基因則不能被切開?？梢?，突變改變了酶切位點。

對GHRL基因的測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)10個突變位點，分別在第124位(T→G)、125位(T→G)、234位(T→C)、262位(G→A)、410位(G→A)、421位(G→A)、450位(G→A)、480位(G→A)、510位(G→A)、519位(G→A)。這些突變位點都不在GHRL基因編碼區(qū)上，因此不改變氨基酸序列。但對突變位點的限制性酶切位點分析發(fā)現(xiàn)，第124位的堿基突變影響了pflMⅠ酶切位點，未突變的GHRL基因能被pflMⅠ切開，而突變后的GHRL基因則

不能被切開。

2.3IGF-Ⅰ、GHRL基因的基因型分析結(jié)果

IGF-Ⅰ基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)，只存在1種基因型(圖3)。因此，不需要進行該基因型分布的卡方適合性檢驗以及基因型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析。

GHRL基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)pflMⅠ酶切(圖4)，發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別為BB、AB、AA基因型。其中，BB型樣本41個,AB型18個,AA型41個。

M.DNA Marker; 1—7.酶切產(chǎn)物圖3 IGF-Ⅰ基因PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果

圖4 GHRL基因PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果

2.4GHRL基因多態(tài)性分析

惠陽胡須雞GHRL基因AA、AB、BB型3種基因型及等位基因的頻率見表2，A和B等位基因的頻率均為0.5；χ2適合性檢驗表明，該位點沒有處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，表明該基因沒有處于遺傳平衡狀態(tài)。

表2 惠陽胡須雞GHRL基因的基因型和等位基因頻率

2.5GHRL基因型與惠陽胡須雞體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，GHRL基因多態(tài)性與93日齡惠陽胡須雞體質(zhì)量不存在顯著相關(guān)性，3種基因型個體體質(zhì)量間的差異均不顯著。

表3 GHRL基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1IGF-Ⅰ基因與GHRL基因多態(tài)性

SNPs指基因組中某個單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括DNA中的堿基替換、顛換(嘧啶和嘌呤之間的替換)、單個堿基的插入或缺失等的變化。趙秀華等[3]在京海黃雞中發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因外顯子3序列的60bp處有A→G突變，屬于同義突變，χ2獨立性檢驗顯示，京海黃雞在該位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。丁馥香等[16]在邊雞中發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因第3外顯子區(qū)域存在2個堿基的突變，一個是同義突變，另一個突變導致了編碼氨基酸的改變。Amills等[17]對雞IGF-Ⅰ基因 5′側(cè)翼區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)了A→C突變。這些結(jié)果說明，雞IGF-Ⅰ基因第3外顯子為易發(fā)生突變的區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，在惠陽胡須雞的IGF-Ⅰ基因第3外顯子區(qū)域中檢測到1個突變位點(A→G)，屬于同義突變，改變了BsmⅠ酶切位點。通過酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)只有1種基因型，推測該基因位點在該胡須雞保種群中已經(jīng)純合。

Nie等[15]在5個中外雞品種和1個F2代群體中，通過對GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)擴增，發(fā)現(xiàn)了6個SNPs。方梅霞等[18]在杏花雞×隱性白洛克雞F2代資源群體中，用同樣的引物對GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)相同的6個SNPs。本研究中，用同樣的引物進行擴增測序，在GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了10個SNPs，其中5個為未曾報道的新SNPs。以上結(jié)果提示，GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)為堿基突變的熱點區(qū)域。有研究表明，非編碼區(qū)存在著影響基因表達調(diào)控的元件，如啟動子、增強子等，也是基因反式作用因子的特異結(jié)合區(qū)域[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)的這些突變位點的變異是否影響GHRL的基因轉(zhuǎn)錄效率需要進一步研究。

3.2GHRL基因多態(tài)性對惠陽胡須雞生長性狀的影響

近年來，關(guān)于GHRL基因的多態(tài)性與動物機體生長、脂肪沉積等的相關(guān)性研究已經(jīng)成為家禽育種領(lǐng)域的熱點。羅開鵬等[20]研究表明，GHRL基因突變位點(C345T)影響貴州黑山羊生長性狀，該位點有望作為山羊生長性狀的一個標記輔助選擇位點。雞GHRL基因C2100T位點多態(tài)性與雞的部分生長性狀存在顯著相關(guān)性[13]。

本研究分析了GHRL基因與93日齡惠陽胡須雞體質(zhì)量的關(guān)系，BB基因型個體的平均體質(zhì)量較AA基因型高，但3種基因型個體間體質(zhì)量無顯著差異。由于本研究樣本量偏少，且只有1個日齡的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，可能會影響分析結(jié)果，所以需進一步擴大樣本數(shù)量，收集多個日齡的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，進一步分析惠陽胡須雞3種基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，以確定優(yōu)勢基因型，為今后惠陽胡須雞育種中生長性狀的分子標記輔助選擇提供理論依據(jù)。

[1]OksbjergN,GondretF,VestergaardM.Basicprinciplesofmuscledevelopmentandgrowthinmeat-producingmammalsasaffectedbytheinsulin-likegrowthfactor(IGF)system[J].DomesticAnimalEndocrinology,2004,27(27):219-240.

[2]FloriniJR,EwtonDZ,CoolicanSA.Growthhormoneandtheinsulin-likegrowthfactorsysteminmyogenesis[J].EndocrineReviews,1996,17:481-517.

[3] 趙秀華,王金玉,張跟喜,等.IGF-Ⅰ與IGFBP-1基因?qū)┖｜S雞生長性狀的遺傳效應(yīng)分析[J].畜牧獸醫(yī)學報,2012,43(1):152-158.

[4] 劉大林,王金玉,魏岳,等.京海黃雞IGF-Ⅰ基因與生長和屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].中國畜牧雜志,2009 (11):9-12.

[5]KojimaM,HosodaH,DateY,et al.Ghrelinisagrowth-hormone-releasingacylatedpeptidefromstomach[J].Nature,1999,402:656-660.

[6]HayashidaT,MurakamiK,MogiK,et al.Ghrelinindomesticanimals:Distributioninstomachanditspossiblerole[J].DomesticAnimalEndocrinology,2001,21(1):17-24.

[7]KojimaM,KangawaK.Ghrelin,anorexigenicsignalingmoleculefromthegastrointestinaltract[J].CurrentOpinioninPharmacology,2002,2(6):665-668.

[8]TschopM,SmileyDL,HeimanML.Ghrelininducesadiposityinrodents[J].Nature,2000,407:908-913.

[9]NakazatoM,MurakamiN,DateY,et al.Aroleforghrelininthecentralregulationoffeeding[J].Nature,2001,409:194-198.

[10]WrenAM,SmallCJ,AbbottCR,et al.Ghrelincauseshyperphagiaandobesityinrats[J].Diabetes,2001,50(11):2540-2547.

[11] 張愛玲,張麗,楊明明,等.鳥槍法篩選枯草芽孢桿菌基因強啟動子及對黃牛GHRL基因的表達[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2011,32(3):92-96．

[12] 李俊營,詹凱,許月英,等.巢湖鴨Ghrelin基因外顯子3的單核苷酸多態(tài)性及其對屠體性狀的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(14):7379-7381．

[13] 何丹林,方梅霞,聶慶華,等.雞Ghrelin基因C2100T位點與生長和脂肪性狀的相關(guān)性 [J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2007(4):73-81.

[14]FangM,NieQ,LuoC,et al.An8bpindelinexon1ofGhrelingeneassociatedwithchickengrowth[J].DomesticAnimalEndocrinology,2007,32(3):216-225.

[15]NieQ,FangM,XieL,et al.Molecularcharacterizationoftheghrelinandghrelinreceptorgenesandeffectsonfatdepositioninchickenandduck[J].JournalofBiomedicineandBiotechnology,2009.doi:10.1155/2009/567120.

[16] 丁馥香,張跟喜,王金玉,等.邊雞胰島素樣生長因子Ⅰ基因(IGF-Ⅰ)外顯子 3 的多態(tài)性及其與繁殖性能的關(guān)系[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2010,18 (2): 313-317.

[17]AmillsM,JiménezN,VillalbaD,et al.Identificationofthreesinglenucleotidepolymorphismsinthechickeninsulin-likegrowthfactor1and2genesandtheirassociationswithgrowthandfeedingtraits[J].PoultryScience,2003,82(10):1485-1493.

[18] 方梅霞,徐海平,謝亮,等.GHRL基因 5′側(cè)翼區(qū)多態(tài)性對雞生長和屠體性狀的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(12):2567-2574.

[19]LatchmanDS.Generegulation-Aeukaryoticperspective[M].London:StanleyThornesLtd.,1998.

[20] 羅開鵬,宋桃偉,孫巖巖,等.山羊GHRL基因多態(tài)性及其與體重、體尺性狀的關(guān)系研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2014,41(6):162-165．

StudyonSingleNucleotidePolymorphism(SNP)ofIGF-ⅠandGHRLGeneinHuiyangBeardedChickens

LIHongwei1,ZHONGDanlong1,CHENYuan1,WUXiaoyan1,ZOUZhiguan2

(1.DepartmentofLifeScience,HuizhouUniversity,Huizhou516007,China;2.GuangdongJinzhongAgricultureandAnimalHusbandryCo.,Ltd.,Huizhou516021,China)

In this study,IGF-ⅠandGHRLgeneswerechosenascandidategenesofgrowthtraitsinHuiyangbeardedchicken.Sequencingandenzymedigestionwereappliedtoassessthesinglenucleotidepolymorphismofthetwogenesandthegenerallinearmodelwasusedtoanalyzeassociationbetweendifferentgenotypesandbodyweightonthe93rddayinHuiyangbeardedchicken.Theresultsshowedthatonemutation(A181G)wasfoundinIGF-Ⅰgene,butthemutationwassynonymous.OnlyonegenotypewasdetectedbyBsmⅠenzymedigestioninIGF-Ⅰgene,whichindicatedthatthemutationsitehadbeenhomozygousintheconservationpopulationofHuiyangbeardedchicken.Theresultsalsoshowedthatonemutation(T124G)wasdetectedinGHRLgene.ThemutationchangedthecuttingsiteofpflMⅠenzyme.Threegenotypes(AA,AB,BB)oftheGHRLgeneweredetectedbythepflMⅠenzymedigestion.TheassociationanalysesshowedthattherewasnosignificantdifferenceamongindividualswiththreegenotypesinHuiyangbeardedchickenonthe93rdday.

Huiyangbearedchicken； IGF-Ⅰgene； GHRLgene；geneticpolymorphism

2017-03-16

廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目(2014KTSCX178)；惠州學院博士啟動基金項目(156020021)

李紅偉(1972-),男,云南祿豐人,講師,博士,主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail:lhwcau@163.com

S831

：A

： 1004-3268(2017)09-0152-04