尚亞細亞 杜菊梅 張磊 申艷方 張文青 梁風(fēng)俊

醒腦靜對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用

尚亞細亞 杜菊梅 張磊 申艷方 張文青 梁風(fēng)俊

目的 觀察醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用。方法 將培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞隨機分為5組，即(1)正常對照組：細胞正常培養(yǎng)27 h；(2)AD細胞模型組：細胞正常培養(yǎng)3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25μmol/L)處理24 h；(3)醒腦靜低濃度組：醒腦靜注射液(5 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(4)醒腦靜中濃度組：醒腦靜注射液(10 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25μmol/L)處理24 h；(5)醒腦靜高濃度組：醒腦靜注射液(20 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；處理后各組細胞利用MTT法檢測細胞存活率，紫外分光光度法檢測細胞內(nèi)ATP含量，流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平。結(jié)果 AD細胞模型組細胞存活率較正常對照組降低(P<0.05)，醒腦靜不同濃度組細胞存活率較AD細胞模型組均明顯升高(P<0.05)；AD細胞模型組細胞內(nèi)ATP含量、線粒體膜電位水平較正常對照組下降(P<0.05)，醒腦靜不同濃度組細胞內(nèi)ATP含量、線粒體膜電位水平較AD細胞模型組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 醒腦靜預(yù)處理可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡，提高細胞存活率，其機制可能與醒腦靜提高細胞內(nèi)ATP含量及線粒體膜電位水平而發(fā)揮線粒體保護作用有關(guān)。

醒腦靜 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 ATP 線粒體膜電位

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，也最常見的癡呆類型，臨床上主要表現(xiàn)為進行性記憶與認知功能減退。目前我國有AD患者600～800萬，其中65歲以上老年人AD患病率為3%～7%，隨著人口老年化社會的不斷加劇，AD防治形勢不容樂觀。目前AD具體發(fā)病機制尚不明確，β淀粉樣蛋白(amyloid beta, Aβ)沉積形成的老年斑及神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成是AD典型病理特征。研究表明Aβ可直接或間接對線粒體結(jié)構(gòu)及功能造成損傷[1-3]，而線粒體損傷后一方面可誘發(fā)氧化應(yīng)激、激活凋亡信號通路等級聯(lián)反應(yīng)；另一方面可促進Aβ生成[4]，進一步加重線粒體損傷，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)元變性凋亡。因此，抑制Aβ誘導(dǎo)的線粒體損傷對減輕AD病理損害具有重要意義。

醒腦靜注射液是由傳統(tǒng)名方“安宮牛黃丸”經(jīng)科學(xué)改制而成的水溶性中藥注射液，主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子。研究顯示醒腦靜注射液可改善臨床AD患者MMSE、ADAS-cog、GDS評分[5]，但其具體機制尚不清楚。膿毒癥大鼠實驗發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可減輕心肌線粒體腫脹、空泡樣改變，降低線粒體電鏡下的半定量評分，具有線粒體保護作用[6]。在AD患者中醒腦靜注射液是否可發(fā)揮線粒體保護作用、抑制神經(jīng)元凋亡、改善認知障礙尚未明確。本研究利用AD細胞模型探討醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導(dǎo)的線粒體損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SH-SY5Y細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；0.25%胰酶(Trypsin公司)；Aβ25-35(Sigma公司)；噻唑藍MTT(Sigma公司)；ATP含量測試盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；醒腦靜注射液。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35老化處理

用1.8 mL重蒸水將1 mg Aβ25-35溶解成濃度為500 μmol/L的母液，于37 ℃下孵育7 d以形成聚集形式的Aβ25-35，-20℃冷凍保存?zhèn)錅y，測量前用培養(yǎng)基稀釋成實驗所需濃度。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞株接種于盛有DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每3～4 d傳代1次，傳代按1∶3進行，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3 AD細胞模型制備

AD細胞模型制備參考Hongquan等方法[7]：用DMEM完全培養(yǎng)基將老化的Aβ25-35稀釋至25 μmol/L，將正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞暴露于 Aβ25-35(25 μmol/L)中24 h，即制成所需AD細胞模型。

1.2.4 實驗分組

將培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞隨機分為5組，即(1)正常對照組：細胞正常培養(yǎng)27 h；(2)AD細胞模型組：細胞正常培養(yǎng)3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(3)醒腦靜低濃度組：醒腦靜注射液(5 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(4)醒腦靜中濃度組：醒腦靜注射液(10 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(5)醒腦靜高濃度組：醒腦靜注射液(20 μl/mL)預(yù)處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率

SH-SY5Y細胞接種于96孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預(yù)處理后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，搖床上低速震蕩10 min使甲臜充分溶解，空白孔調(diào)零，酶標儀上490 nm波長處檢測各孔OD值，記錄并計算細胞存活率。

1.2.6 細胞ATP含量檢測

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預(yù)處理后嚴格按ATP含量測試盒說明書進行操作，利用紫外分光光度計檢測各孔吸光度值，記錄并計算ATP含量，ATP含量(μmol/L)=[(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準品含量×樣本測定前稀釋倍數(shù)÷待測樣本蛋白含量。

1.2.7 細胞線粒體膜電位檢測

利用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位，將SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預(yù)處理后嚴格按線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作，各組單細胞懸液用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm；Em=530 nm)，綠色熒光通過FITC通道FL1檢測，紅色熒光通過PI通道FL2檢測，計算各組紅綠熒光強度比值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞存活率

AD細胞模型組細胞存活率較正常對照組降低(P<0.05)；與AD細胞模型組比較，醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組細胞存活率明顯升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組細胞存活率高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(表1)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

2.2 ATP含量檢測

與正常對照組比較，AD細胞模型組ATP含量顯著降低(P<0.05)；醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組ATP含量較AD細胞模型組升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組ATP含量高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(表2)。

2.3 線粒體膜電位檢測

與正常對照組比較，AD細胞模型組線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)；醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組線粒體膜電位較AD細胞模型組升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組線粒體膜電位高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(圖1，表3)。

表2 各組細胞ATP含量檢測(μmol/L)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位

表3 各組細胞線粒體膜電位檢測

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

3 討 論

AD是老年人最常見的癡呆類型，雖然隨著國內(nèi)外學(xué)者對AD研究的不斷深入，相繼提出了Aβ級聯(lián)假說、Tau蛋白過度磷酸化假說、氧化應(yīng)激假說、膽堿能假說、興奮性氨基酸毒性假說等發(fā)病機制假說，但目前AD發(fā)病機制仍未完全闡明，亦無確切有效的治療方法。腦組織中Aβ異常沉積形成老年斑是AD典型病理特征之一，研究表明Aβ對神經(jīng)元內(nèi)線粒體具有顯著毒性作用，AD模型大鼠腦組織中靠近Aβ斑塊的神經(jīng)元內(nèi)線粒體數(shù)量減少、膜電位下降，并可見營養(yǎng)不良和破碎的線粒體[8]。利用電子顯微鏡觀察AD患者海馬、額葉皮層、小腦皮層、丘腦等部位的神經(jīng)元，亦可見廣泛的線粒體腫脹、數(shù)量減少、嗜鋨物質(zhì)聚集，嚴重者出現(xiàn)空泡變性和線粒體嵴斷裂[9]。線粒體損傷后可刺激APP經(jīng)淀粉樣代謝途徑水解生成具有毒性作用的Aβ[4]，從而形成Aβ聚集→線粒體損害→Aβ生成的惡性循環(huán)，加重AD病理損害。因此，積極尋求線粒體保護劑來抑制Aβ誘導(dǎo)的線粒體損傷對緩解AD病理損害具有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認為，神明失用是阿爾茨海默病發(fā)病的基本病理，心腎虛衰、痰瘀阻滯是導(dǎo)致神明失用的內(nèi)在機制，治療當(dāng)以開竅醒神、強記益智為施治總則。醒腦靜注射液是由《溫病條辨》傳統(tǒng)名方“安宮牛黃丸”經(jīng)科學(xué)改制而成的水溶性中藥注射液，主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子，四藥相配具有醒腦開竅、行痰通瘀、清解毒邪之功效。有研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可明顯縮短AD模型大鼠在水迷宮試驗中的逃避潛伏期，增加跨越原平臺次數(shù)，減輕AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[7]，改善臨床AD患者MMSE、ADAS-cog、GDS評分[5]，但其具體分子機制尚不清楚。在膿毒癥大鼠心肌損傷實驗中王金華等研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可減輕膿毒癥大鼠心肌線粒體腫脹、空泡樣改變，降低線粒體電鏡下的半定量評分，對膿毒癥大鼠心肌線粒體發(fā)揮保護作用[6]。醒腦靜是否可通過線粒體保護作用來減輕Aβ細胞毒性、改善AD患者癡呆癥狀尚不清楚，本研究利用AD細胞模型探討醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用。

線粒體是細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的主要結(jié)構(gòu)，被稱為“細胞動力工廠”。線粒體通過三羧酸循環(huán)、電子傳遞過程使H+經(jīng)ATP酶復(fù)合體回流產(chǎn)生自由能，進而驅(qū)動ATP合酶將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP。前期研究表明Aβ可引起線粒體ATP合成減少，其機制可能是Aβ結(jié)合ATP合酶的α亞單位后引起ATP合酶構(gòu)象改變，從而阻礙了底物水平磷酸化產(chǎn)生的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移至ADP生成ATP[10]；也可能與Aβ誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激，降低細胞色素C氧化酶活性，抑制了線粒體電子傳遞和氧化磷酸化過程有關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35可導(dǎo)致SH-SY5Y細胞ATP含量下降，而醒腦靜預(yù)處理可相對提高細胞內(nèi)ATP含量，提示醒腦靜預(yù)處理可減輕Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞ATP合成障礙。ATP是細胞內(nèi)能量儲存的主要形式，ATP高能磷酸鍵水解生成ADP所釋放的能量，可為細胞分裂增殖、離子轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)、神經(jīng)元軸突運輸?shù)壬砘顒犹峁﹦恿χС郑涯X靜預(yù)處理提高AD模型細胞內(nèi)ATP含量，有利于維持細胞正常新陳代謝、減少細胞凋亡。

線粒體是由流動的雙層單位膜套疊形成的封閉性膜囊結(jié)構(gòu)，雙側(cè)單位膜分別稱為外膜和內(nèi)膜，外膜可允許分子量10000以下的小分子物質(zhì)自由通過，而內(nèi)膜對物質(zhì)的通透具有高度選擇性，是線粒體膜電位形成的基礎(chǔ)。線粒體膜電位下降是線粒體損傷和細胞凋亡的早期標志，研究發(fā)現(xiàn)Aβ干預(yù)海馬神經(jīng)元8 h后神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位下降、細胞凋亡增加，其機制可能與Aβ激活多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)有關(guān)[12]。Rao等研究發(fā)現(xiàn)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放在Aβ誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降中也發(fā)揮作用，Aβ可與mPTP上的親環(huán)素-D相互作用，促進mPTP開放，引起線粒體膜電位下降[13]。本研究Aβ25-35干預(yù)SH-SY5Y細胞24 h后細胞線粒體膜電位顯著下降，與前期研究結(jié)果一致，而醒腦靜各組細胞線粒體膜電位較AD模型細胞明顯升高，提示醒腦靜預(yù)處理可減輕Aβ引起的線粒體膜電位下降，從而有利于維持線粒體膜正常通透性及線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電荷梯度，穩(wěn)定細胞氧化呼吸及能量代謝。

線粒體膜電位下降是細胞凋亡的早期標志，醒腦靜可相對升高Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位，可能具有抗Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡作用。本研究利用MTT法檢測細胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醒腦靜各組細胞存活率較AD模型組細胞明顯升高，提示醒腦靜預(yù)處理可抑制Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜可通過下調(diào)Caspase-3水平來抑制腦外傷、腦出血后神經(jīng)元凋亡[14-16]，醒腦靜的抗神經(jīng)元凋亡作用可能與其調(diào)節(jié)Caspase-3活性有關(guān)，Caspase-3是Caspase依賴凋亡途徑的主要下游分子，線粒體損傷后線粒體膜電位下降、ATP含量減少，線粒體通透性增加，可導(dǎo)致線粒體內(nèi)細胞色素C、內(nèi)核酸酶G、凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡相關(guān)蛋白釋放，活化Caspase-3，啟動Caspase依賴細胞凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜可提高Aβ25-35干預(yù)后SH-SY5Y細胞存活率，同時可提高線粒體膜電位、ATP含量，推測醒腦靜抗神經(jīng)元凋亡作用可能與其減輕Aβ誘導(dǎo)的線粒體損傷，減少線粒體凋亡蛋白釋放有關(guān)，但其對線粒體的保護作用機制尚有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜預(yù)處理可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡，提高細胞存活率，其機制可能與醒腦靜提高細胞內(nèi)ATP含量及線粒體膜電位水平，發(fā)揮線粒體保護作用有關(guān)，但其對線粒體的保護作用機制尚有待進一步研究。醒腦靜是臨床上廣泛用于腦血管病、腦外傷的治療，其安全性、有效性已獲得臨床認可，深入發(fā)掘醒腦靜在AD治療方面的潛在作用機制將有望為AD治療提供新的治療選擇。

[1] Crouch PJ,Harding S-,White AR,et al.Mechanisms of a beta mediated neurodegeneration in alzheimer's disease[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2008,40(2):181-198.

[2] Manczak M,Mao PZ,Calkins MJ,et al.Mitochondria-Targeted antioxidants protect against amyloid-beta toxicity in alzheimer's disease neurons[J].Journal of Alzheimers Disease,2010,20(2, SI):S609-S631.

[3] Butterfield DA,Galvan V,Lange MB,et al.In vivo oxidative stress in brain of Alzheimer disease transgenic mice: Requirement for methionine 35 in amyloid beta-peptide of APP[J].Free Radical Biology and Medicine,2010,48(1):136-144.

[4] Leuner Kristina,Schütt Tanja,Kurz Christopher,et al.Mitochondrion-derived reactive Oxygen species Lead to enhanced amyloid beta formation[J].Antioxid Redox Signal,2012,16(12):1421-1433.

[5] 李明秋,黃海華,張國勝,等.醒腦靜注射液治療阿爾茨海默病的臨床療效觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2011,18(5):309-311.

[6] 王金華,車頔,陳東,等.醒腦靜注射液對膿毒癥大鼠心肌線粒體氧化應(yīng)激損傷的作用[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(9):1403-1406.

[7] Wang Hongquan,Xu Yuxia,Yan Jie,et al.Acteoside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against beta-amyloid-induced cell injury[J].Brain Res,2009,1283(8):139-147.

[8] Xie Hong,Guan Jisong,Borrelli A,et al.Mitochondrial alterations near amyloid plaques in an Alzheimer's disease mouse model[J].J Neurosci,2013,33(43):17042-17051.

[9] Baloyannis SJ.Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(2):119-126.

[10]Schmidt C,Lepsverdize E,Chi L,et al.Amyloid precursor protein and amyloid beta-peptide bind to ATP synthase and regulate its activity at the surface of neural cells[J].Mol Psychiatry,2008,13(10):953-969.

[11]Hauptmann S,Scherping I,Dr se S,et al.Mitochondrial dysfunction: an early event in Alzheimer pathology accumulates with age in AD transgenic mice[J].Neurobiol Aging,2009,30(10):1574-1586.

[12]Abeti Rosella,Abramov Y,Duchen R.Beta-amyloid activates PARP causing astrocytic metabolic failure and neuronal death[J].Brain,2011,134(Pt 6):1658-1672.

[13]Rao Koteswara,Carlson A,Yan Shidu.Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration[J].Biochim Biophys Acta,2014,1842(8):1267-1272.

[14]郭晉輝,姜勇.醒腦靜注射液對蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,49(7):57-60.

[15]戴永建,戢翰升.醒腦靜注射液對大鼠腦損傷后細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志,2006,11(9):551-553.

[16]劉軼林,洪纓,王晶,等.CORM-2通過激活Caspase依賴性線粒體途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡及 醒腦靜對其干預(yù)作用的機制研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(8):1725-1734.

[17]鄭天勝.線粒體凋亡通路的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(18):3282-3285.述,2013,19(18):3282-3285.

(2016-11-17收稿)

The protective effect of Xingnaojing on mitochondrial damage of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35proteins

ShangYaxiya,DuJumei*,ZhangLei,etal.

DepartmentofNeurology,TheSecondAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712000

Objective To investigate the protective effect of Xingnaojing on mitochondrial damage of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35proteins.Methods SH-SY5Y cells were divided into 5 groups: (1) normal control group(cells were cultured for 27 h), (2) AD cell model group(after 3h in normal culture, cells were treated with 25 μM Aβ25-35for 24h), (3) Xingnaojing low concentration group( before treatment with 25 μM Aβ25-35for 24h, cells were pretreated with 5 μl/mL Xingnaojing for 3 h), (4) Xingnaojing middle concentration group(before treatment with 25μM Aβ25-35for 24 h, cells were pretreated with 10 μl/mL Xingnaojing for 3 h), (5) Xingnaojing high concentration group(before treatment with 25 μM Aβ25-35for 24 h, cells were pretreated with 20 μl/mL Xingnaojing for 3 h). After treatment, cell viability was measured by MTT conversion, levels of mitochondrial membrane potential and ATP contents were evaluated by flow cytometry and UV-Spectrophotometric method respectively.Results cell viability significantly decreased in AD cell model group compared with normal control group(P<0.05), Xingnaojing(5,10,20 μl/mL) pretreatment significantly elevated cell viability compared with AD cell model group(P<0.05). Exposure of SH-SY5Y cells to Aβ25-35for 24 h reduced mitochondrial membrane potential and ATP contents(P<0.05), compared with AD cell model group, Xingnaojing(5,10,20 μl/mL) pretreatment significantly elevated ATP content and mitochondrial membrane potential(P<0.05).Conclusion Xingnaojing pretreatment could inhibit apoptosis of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35and improve cell viability, which might be related with Xingnaojing elevated intracellular ATP contents and the level of mitochondrial membrane potential to protect mitochondria.

Xingnaojing Alzheimer's disease Beta-amyloid proteins ATP Mitochondrial membrane potential

陜西中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新基金(項目編號2016PY20)；陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院專項科研計劃項目(項目編號2016ZD02)

712000 陜西省咸陽市陜西中醫(yī)藥大學(xué)(尚亞細亞)；陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 [杜菊梅(通信作者)張磊 申艷方 張文青 梁風(fēng)俊]

R742

A

1007-0478(2017)04-0297-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.005