鄭紅云 申復進 童永清 李艷

·論 著·

基因水平下調PP2A水平可顯著抑制海馬神經(jīng)元軸突生長

鄭紅云 申復進 童永清 李艷

目的 探討基因水平下調PP2A對胎鼠海馬神經(jīng)元軸突生成的影響。方法 選取體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元為研究模型，首先構建PP2A催化亞基特異性干擾RNA及其對照(si-PP2A/ssi-PP2A)質粒，選擇在種植前下調PP2A水平，觀察其對海馬神經(jīng)元軸突生成是否有作用；原代細胞采用Amaxa大鼠神經(jīng)元核電轉試劑盒分別轉染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac，神經(jīng)元種植培養(yǎng)48 h后固定做免疫熒光雙標，分別標記軸突特異性標記物Tau-1和樹突特異性標記物MAP-2，觀察基因下調PP2A水平對神經(jīng)元軸突生成的影響。結果 原代海馬神經(jīng)元轉染48 h后對照轉染組海馬神經(jīng)元神經(jīng)元軸突和樹突均已形成，而干擾RNA轉染組神經(jīng)元軸突生長受到顯著抑制，而樹突生長未受到明顯影響；si-PP2A轉染組(干擾轉染組)神經(jīng)元軸突長度僅為對照轉染組的38%，單個神經(jīng)元的平均軸突數(shù)目也從正常1.0/neuron下降到0.5/neuron。結論基因下調PP2A水平顯著抑制了原代海馬神經(jīng)元軸突生成，結合前期藥物下調研究結果提示維持細胞內正常PP2A水平在海馬神經(jīng)元軸突生成中起重要作用。

蛋白磷酸酯酶2A 海馬神經(jīng)元 軸突 干擾RNA 轉染

軸突生成是指神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中軸突的生長和產(chǎn)生，神經(jīng)元軸突生成對維持神經(jīng)元極性結構起重要作用。神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展到最后成熟需要經(jīng)歷6個階段：神經(jīng)元自圓形細胞球開始，胞體周圍開始伸出偽足(種植后很短時間內，4 h，stage 1)；之后偽足逐漸形成小的突起(12～24 h，stage 2)，此時神經(jīng)元突起上出現(xiàn)動力生長錐，在這個期的神經(jīng)元突起呈現(xiàn)生長與回縮的特征；神經(jīng)元突起繼續(xù)生長，眾多突起中有一個突起迅速生長成為軸突時，我們稱該神經(jīng)元極性已經(jīng)形成(24～48 h，stage 3)。因此，神經(jīng)元極性形成的標志就是其軸突的生成。

雖然軸突的運輸模式及其正常的生理功能已經(jīng)被研究得較為清楚，但有關神經(jīng)元軸突生成的相關機制還知之甚少。胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)是研究神經(jīng)元極性的良好模型。在許多神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)損傷以及運動神經(jīng)元功能障礙疾病中共同的病理變化之一是神經(jīng)元軸突營養(yǎng)障礙，最后導致神經(jīng)元死亡。因此，尋找可以促進神經(jīng)元軸突生成的有效作用分子不僅有助于了解生理狀態(tài)下軸突生長的相關機制，而且也對促進疾病狀態(tài)下受損軸突的再生意義重大。目前的研究表明多種蛋白磷酸激酶參與了神經(jīng)元軸突生成和極性建立，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)[1]、PI3K[2]、微管親和性調節(jié)激酶(MARK2)[3]、Rho蛋白激酶[4]、SAD激酶[5]和JNK[6]均參與了神經(jīng)元軸突生成和極性形成的調節(jié)，但有關蛋白磷酸酯酶參與神經(jīng)元軸突生成及極性建立的研究較少。前期研究表明藥物抑制PP2A活性可抑制神經(jīng)元軸突生成，但其特異性尚未明確，本研究擬從基因水平特異性下調PP2A水平，進而觀察其對神經(jīng)元軸突生成的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 孕18 d的SD大白鼠(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供)。

1.2 試劑及抗體 干擾PP2Ac(siPP2A)及其對照質粒(ssi-PP2A)均由華中科技大學同濟醫(yī)學院神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病重點實驗室提供。單克隆Tau-1抗體和多克隆MAP2抗體均購自Millipore (Temecula, CA)；Cy5標記的羊抗鼠和Rhodamine Red-X-標記的羊抗兔二抗購自Molecular Probes (Eugene,OR,USA)。

1.3 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[7]無菌條件下取出孕18 d胎鼠的完整腦組織， 剔除腦膜和血管，鈍性分離出雙側海馬；將海馬剪成1 mm3的組織塊(以上均在冰上進行)，置入解剖液(含3%～6%葡萄糖D-Hanks)中，0.125%胰蛋白酶(GIBCO, USA)，37 ℃消化15 min，加入種植培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)終止反應，滴管吹打后經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，1500轉/min離心5min，加入適當?shù)姆N植培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)，調至1×107/L，接種于預鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4小時后換成維持培養(yǎng)基(1% Glutamate/2% B27/97% Neurobasal Media)。

1.4 PC12細胞培養(yǎng) 未分化PC12是微貼壁細胞，一般用膠原或0.1%PLL包被；培養(yǎng)基選用85%DMEM (pH7.4，高糖), 加入10%滅活馬血清及5% FBS，再加1%雙抗；因為該細胞貼壁不牢，故無需用胰酶消化，只需用滴管輕輕吹下細胞，然后收集細胞于10 mL離心管(無菌)中，低速離心(1000 r/min離心5 min)；移除上清培養(yǎng)基，接著用新鮮完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，最后接種于培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱即可；siPP2A質粒轉染在12孔板中進行，細胞豐度為80%，轉染質粒濃度均為1 ug/uL，每孔質粒用量0.2 uL，轉染脂質體用量2 uL。

1.5 原代海馬神經(jīng)元Amax核電轉法 原代海馬神經(jīng)元是原代細胞中比較難轉染的細胞，為了得到比較高的轉染效率，我們選用了Amaxa Biosysterms公司NucleofectorⅡ電轉儀以及Rat Neuron Nucleofector Kit對剛分離的海馬神經(jīng)元進行核轉染[8]；原代海馬神經(jīng)元進行核電轉siPP2A質粒前必須進行細胞計數(shù)，每個反應要保證4～5×106個細胞；轉染質粒濃度均為2 ug/uL，要求1～3 μg DNA(溶于1 ～5 μl H2O或TE)，實際電轉質粒用量為1.5 uL，選擇程序為O-03/O-003或G-13/G-013，細胞成功電轉后種植于12孔板。

1.6 Cy5/羅丹明(Rhodamine)免疫熒光雙重標記[9]海馬神經(jīng)元電轉染后種植于培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，然后固定做免疫熒光；PBS漂洗后加入4%多聚甲醛常溫固定15～20 min或4 ℃固定30 min；PBS-0.1%Triton漂洗，然后PBS-0.5%Triton破膜5～10 min, PBS-0.1%Triton漂洗, 5%BSA封閉1 h，分別滴加兔抗MAP2(1∶200)、鼠抗Tau-1(1∶200)，于4 ℃孵育過夜，漂洗后加入Cy5或Rhodamine熒光標記Ⅱ抗于室溫孵育1 h，漂洗后于共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 轉染特異性干擾RNA質粒(si-PP2A)抑制PP2A水平的有效性驗證

為證實siPP2A干擾PP2Ac有效，我們在大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤未分化細胞株(PC12)細胞上分別轉染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac，轉染48 h后免疫印跡檢測PP2Ac的表達水平；轉染siPP2A可明顯降低PC12細胞內PP2Ac的蛋白表達水平(圖1)，轉染siPP2A細胞內PP2A表達水平僅為對照轉染組(ssiPP2A轉染組)34%(P<0.05)(圖1)。

2.1 轉染特異性si-PP2A質粒抑制PP2A水平后抑制原代海馬神經(jīng)元軸突生成 在原代培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)元種植于細胞培養(yǎng)皿之前，先采用Amaxa大鼠神經(jīng)元核電轉試劑盒分別轉染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac，神經(jīng)元種植培養(yǎng)48 h后固定做免疫熒光雙標，分別標記軸突特異性標記物Tau-1[10]和樹突特異性標記物MAP-2[11]。如圖2所示，對照組神經(jīng)元培養(yǎng)48 h，同時表達特異性軸突分子Tau-1(圖2，blue，1放大圖)和樹突分子MAP2(圖2，red)，而轉染siPP2A的神經(jīng)元則無軸突標志物Tau-1表達(圖2，blue，2放大圖)；平均軸突長度(簡稱為軸突長度)和單個神經(jīng)元平均軸突數(shù)目(簡稱為軸突數(shù)目)，siPP2A下調PP2A水平后神經(jīng)元軸突長度和數(shù)目均明顯下降(表1)。

圖1 PC12細胞中驗證PP2A干擾RNA(siPP2A)的有效性 PC12細胞分別轉染ssiPP2Ac和siPP2Ac，48h后免疫印跡檢測PP2Ac和內參DM1A的表達水平(1A)；免疫印跡灰度值統(tǒng)計學分析轉染了干擾RNA的siPP2A細胞內PP2A的表達僅為對照組的34%(1B)，與ssiPP2A轉染組比較?P<0．05

每組分別統(tǒng)計50個神經(jīng)元軸突長度和數(shù)目，再分別計算每組神經(jīng)元平均軸突長度和平均軸突數(shù)目，和對照組比較，si-PP2A轉染組(干擾轉染組)無論是平均軸突長度還是軸突數(shù)目均低于ssiPP2A轉染組(P<0.05)(表1)。

圖2 siPP2A下調PP2A水平后顯著抑制神經(jīng)元軸突的生成 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)種植前采用細胞電轉技術分別轉染siPP2A和ssiPP2A質粒，種植培養(yǎng)48h后固定做免疫熒光，采用Tau?1抗體特異性識別軸突(可識別胞體和軸突遠端)，圖中為藍色熒光標記；MAP2抗體特異性識別樹突(可識別樹突、胞體和軸突近端)，為紅色熒光標記。與對照組相比，siPP2A轉染組神經(jīng)元軸突生長和數(shù)目均受到了明顯的抑制，軸突生成障礙(比例尺：20μm)

表1 2組神經(jīng)元平均軸突長度和軸突數(shù)目±s)

注：與ssiPP2A轉染組比較，*P<0.05

3 討 論

蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)是腦內最重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶之一，PP2A主要調節(jié)細胞周期和細胞分化。PP2A 是由支架亞單位A(65kD)、調節(jié)亞單位B (50-130kD)和催化亞單位C(36 kD)構成的異三聚體[12]。抑制PP2A酶活性可導致神經(jīng)元間接死亡，因此PP2A是胚胎發(fā)育必不可少的蛋白分子，但PP2A與神經(jīng)元軸突發(fā)育關系仍然尚不清楚。

神經(jīng)元極性形成對其功能的正常發(fā)揮至關重要，探索神經(jīng)元極性形成的分子基礎尤為迫切。對于一個神經(jīng)元來說，樹突往往是接受信息的部位，軸突往往是輸出信息的部位。軸突生成是指神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中軸突的生長和產(chǎn)生，神經(jīng)元軸突生成對維持神經(jīng)元極性結構起重要作用。目前的研究表明越來越多的蛋白磷酸激酶參與了神經(jīng)元軸突生成和極性建立，大量蛋白磷酸激酶參與了神經(jīng)元軸突生成，如PI3K[13]，Akt[14]，GSK-3[15]， SAD激酶[16]，Rho GTP酶[17]及JNK[18]等是調節(jié)神經(jīng)細胞極性的主要胞內信號分子，它們大多數(shù)是調節(jié)蛋白質特異位點磷酸化的蛋白激酶。PP2A是腦內最重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶之一，前期研究表明藥物下調PP2A活性可抑制海馬神經(jīng)元軸突生長[19]，但其特異性尚不明確。海馬神經(jīng)元種植前分別轉染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac，種植培養(yǎng)48h后分別標記軸突特異性標記物Tau-1和樹突特異性標記物MAP-2，結果顯示對照轉染組神經(jīng)元培養(yǎng)48 h，同時表達特異性軸突分子Tau-1和樹突分子MAP2，而轉染siPP2A的神經(jīng)元則無軸突標志物Tau-1表達；siPP2A下調PP2A水平后神經(jīng)元軸突長度和數(shù)目均明顯下降，提示種植前下調PP2A抑制了海馬神經(jīng)元軸突的生成。

在常見神經(jīng)退行性疾病如Alzheimer病(AD)患者腦中PP2A活性明顯降低，tau蛋白以高度磷酸化的形式存在，進而出現(xiàn)神經(jīng)元極性的喪失并最終導致神經(jīng)元的大量丟失，本研究結果提示維持正常細胞內PP2A水平對保持神經(jīng)元正常軸突發(fā)育至關重要，因此上調PP2A活性對促進AD患者腦中神經(jīng)元正常生存意義較大。

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(2016-04-19收稿)

Downregulation of PP2A level by gene knockout could inhibit hippocampal neuronal axon outgrowth significantly

ZhengHongyun*,ShenFujing,TongYongqing*,etal.

*DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

Objective To explore the effect of downregulation of PP2A level by gene konckout on fetal rat hippocampal neuronal axon outgrowth.Methods The primary hippocampal neuron systems was chose as the model for study. First the PP2A catalytic subunit specific RNA interference plasmid and its control (si-PP2A/ssi-PP2A) were built, and then the effect of siPP2A on the neuron axon formation was observed when the plasmids were transfected before cell plating. Primary hippocampal neurons were transfected with si-PP2A or ssi-PP2A by Amax rat neuron nuclear transfer kit, and the neurons were fixed by immunofluorescence after 48 h. Then the cells were labeled with axon specific marker Tau-1 and dendritic specific marker MAP-2. The effect of PP2A level on the axon formation was observed.Results Hippocampal neurons were transfected with si-PP2A or ssi-PP2A for 48h, then cells were measured the alterations of axons by using double immunofluorescence. Data showed that Axons were formed after culturing for 48h in ssi-PP2A transfected group under the present conditions. However, the formation of axons were inhibited significantly when transfected with siPP2A, and there was no effect on the dendrites formation. Further statistical analysis data showed that siPP2A-transfected axon average length were only 38% of control group (ssiPP2A), and the average number of axons of single neuron also dropped from the normal 1.0/neuron to 0.5/neuron.Conclusion Gene downregulation of PP2A significantly inhibited axon formation in primary cultured hippocampal neurons, combined of preliminary study results, thus results indicated that maintaining the normal level of PP2A in the cells played an important role in the axon formation of hippocampal neurons.

PP2A Hippocampal neuron Axon siRNA Transfection

國家自然科學基金資助項目(81100959)；國家臨床重點專科建設項目(財社[2010]305號)；湖北省自然科學基金面上項目(2015CFB185)

430060 武漢大學人民醫(yī)院檢驗科[鄭紅云 童永清 李艷(通信作者)]，婦科(申復進)

R742

A

1007-0478(2017)04-0282-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.002