肖 喻，劉 洋，王 千，張 浩，萬(wàn) 喆，李若瑜，劉 偉，曹先偉

(1 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006； 2 北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

·論著·

江西南昌市52株假絲酵母菌血癥病原真菌的鑒定及其藥敏特征

肖 喻1，劉 洋1，王 千2，張 浩2，萬(wàn) 喆2，李若瑜2，劉 偉2，曹先偉1

(1 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006； 2 北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

目的了解江西南昌市假絲酵母菌血癥病原真菌構(gòu)成及其藥物敏感性。方法收集 2015年3—10月南昌某醫(yī)院住院患者送檢血標(biāo)本分離的假絲酵母菌屬真菌，擴(kuò)增真菌的轉(zhuǎn)錄間隔間區(qū)(ITS區(qū))和核糖體大亞基(26rRNA、D1/D2區(qū))對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)檢測(cè)菌株對(duì)抗真菌藥物的敏感性。結(jié)果共收集血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本1 332份，真菌陽(yáng)性標(biāo)本74份，占5.56%，其中檢出假絲酵母菌屬52株，以熱帶假絲酵母菌為最常見(17株，占32.69%)，其次是白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌復(fù)合體(均為16株，各占30.77%)。ITS區(qū)和D1/D2區(qū)的鑒定結(jié)果相同。52株假絲酵母菌對(duì)米卡芬凈、卡泊芬凈均敏感，兩性霉素B的流行病學(xué)折點(diǎn)(ECV)結(jié)果顯示，均為野生型。熱帶假絲酵母菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為29.41%、17.64%，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，野生型分別占82.35%、94.12%；白假絲酵母菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感率分別為93.75%、81.25%，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV顯示，野生型分別占75.00%、81.25%；近平滑假絲酵母菌復(fù)合體對(duì)氟康唑和伏立康唑均敏感，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，均為野生型；光滑假絲酵母菌對(duì)氟康唑均為中介，伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，野生型分別占66.67%、100.00%、100.00%。結(jié)論熱帶假絲酵母菌為江西南昌市假絲酵母菌血癥最常見的病原真菌，其次是白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌復(fù)合體，唑類和棘白菌素類抗真菌藥物和兩性霉素B仍是一線抗真菌藥物。

假絲酵母菌血癥； 分子鑒定； 抗真菌藥物； 假絲酵母菌屬

[Chin J Infect Control，2017，16(9)：793-797]

近年來(lái)，隨著抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑以及醫(yī)療器械的大量使用，假絲酵母菌屬已成為醫(yī)院真菌感染最主要的致病菌。假絲酵母菌屬在美國(guó)和歐洲醫(yī)院感染病原菌中居第四位和第六位。全球的假絲酵母菌血癥約占假絲酵母菌感染的80%，其病死率高達(dá)40%[1-8]。假絲酵母菌血癥的早期診斷和治療對(duì)降低本病的高發(fā)病率、高病死率尤為重要，而假絲酵母菌血癥病原真菌的鑒定和藥物敏感性特征在診斷和治療中必不可少。因此，本研究對(duì)江西南昌市某三級(jí)醫(yī)院2015年3—10月住院患者血培養(yǎng)標(biāo)本分離的52株假絲酵母菌血癥病原真菌進(jìn)行鑒定和藥敏檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 對(duì)2015年3—10月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院所有臨床科室住院患者送檢血培養(yǎng)標(biāo)本分離的酵母樣菌落真菌，轉(zhuǎn)種至顯色培養(yǎng)基，收集在顯色培養(yǎng)基上菌落呈白色、綠色，藍(lán)色、紫色的菌株。質(zhì)控菌株：克柔假絲酵母菌ATCC 6258、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019，由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心贈(zèng)送。

1.2 主要儀器和試劑 顯色培養(yǎng)基為河南鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，比濁儀為法國(guó)生物梅里埃公司(Biomerieux Densimat)產(chǎn)品，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為青島阿爾發(fā)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，RPMI-1640粉(Gibco，USA)，MOPS緩沖液為沃德賽斯生物公司產(chǎn)品，真菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。氟康唑、兩性霉素B購(gòu)自美國(guó)sigma公司，伏立康唑、伊曲康唑購(gòu)自壽光富康制藥公司，泊沙康唑、米卡芬凈、卡泊芬凈購(gòu)自華中海威基因科技公司。引物設(shè)計(jì)和DNA測(cè)序均由生工生物工程有限公司完成。

1.3 菌株培養(yǎng)與鑒定 將菌株轉(zhuǎn)種至土豆瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于35℃孵箱培養(yǎng)48 h,按照真菌DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取菌株DNA,利用標(biāo)準(zhǔn)化的分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，依據(jù)文獻(xiàn)[1-2]使用真菌ITS區(qū)和D1/D2區(qū)的常用引物和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，測(cè)序結(jié)果差異≤1%則鑒定為同一菌種。

1.4 藥敏試驗(yàn)

1.4.1 菌液制備 將受試菌在土豆瓊脂平板上，35 ℃孵育24 h，轉(zhuǎn)種2次，挑取>l mm菌落3～5個(gè)至5 mL無(wú)菌的0.85%NaCl溶液中，制成菌懸液，調(diào)整濁度，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌濃度為1×106～5×106CFU/mL。

1.4.2 藥物溶液的配制 氟康唑用無(wú)菌蒸餾水配制成濃度為1 600 μg/mL貯存液，卡泊芬凈、米卡芬凈用無(wú)菌蒸餾水配制成濃度為800 μg/mL貯存液，伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、兩性霉素B用二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為800 μg/mL的貯存液。

1.4.3 體外抗真菌藥敏板制備 用RPMI-1640溶液培養(yǎng)基將氟康唑貯存液稀釋成(64～0.125)μg/mL濃度梯度，將伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、泊沙康唑、卡泊芬凈、米卡芬凈貯存液稀釋成(16～0.03) μg/mL濃度梯度，將上述藥物溶液按濃度梯度以微量加樣器從低到高依次將藥液加入無(wú)菌的96孔板內(nèi)，每孔100 μL，第11孔為菌液陽(yáng)性對(duì)照，第12孔為空白對(duì)照，密封，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(huì)(CLSI)M27-A3方案[3]的微量稀釋法進(jìn)行，將濃度為(1×106～5×106)CFU/mL的菌懸液用RPMI-1640稀釋1 000倍，加入制備的抗真菌藥敏板中，每孔加100 μL，菌液終濃度為(0.5×103～2.5×103)CFU/mL，35 ℃孵箱培養(yǎng)24 h。

1.4.5 結(jié)果判讀 參照CLSI M27-S4方案[3-4]進(jìn)行, 7種抗真菌藥物對(duì)酵母菌的最小抑菌濃度(MIC)的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：唑類和棘白菌素類抗真菌藥物以抑制50%以上判讀，兩性霉素B以抑制100%判讀。流行病學(xué)折點(diǎn)(epidemiological cutoff value，ECV) 是指用于區(qū)分非野生型菌株和野生型菌株的MIC閾值,其結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)與MIC的判讀標(biāo)準(zhǔn)一致[5,9-10]，伊曲康唑、泊沙康唑和兩性霉素B無(wú)推薦的折點(diǎn)，對(duì)上述三種抗真菌藥物使用ECV判讀。7種抗真菌藥物的MIC或ECV的判斷分界值參照CLSI M27-S4和相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 假絲酵母菌血癥病原真菌構(gòu)成情況 2015年3—10月共收集血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本1 332份，真菌陽(yáng)性標(biāo)本74份，占5.56%，其中檢出假絲酵母菌屬52株。52株假絲酵母菌屬中以熱帶假絲酵母菌為最常見，為17株(占32.69%)，其次是白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌復(fù)合體，均為16株(各占30.77%)，近平滑假絲酵母菌復(fù)合體包括2株擬平滑假絲酵母菌和14株近平滑假絲酵母菌，光滑假絲酵母菌為3株(占5.77%)。見表1。

表1假絲酵母菌血癥病原真菌構(gòu)成情況

Table1Constitute of pathogenic fungi causing candidemia

真菌菌株數(shù)構(gòu)成比(%)熱帶假絲酵母菌1732．69白假絲酵母菌1630．77近平滑假絲酵母菌復(fù)合體1630．77光滑假絲酵母菌35．77合計(jì)52100．00

2.2 菌株鑒定結(jié)果 利用ITS區(qū)和D1/D2區(qū)對(duì)52株假絲酵母菌進(jìn)行鑒定，ITS區(qū)和D1/D2區(qū)的鑒定結(jié)果相同。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 52株假絲酵母菌對(duì)米卡芬凈、卡泊芬凈均敏感，兩性霉素B的ECV結(jié)果顯示，均為野生型。熱帶假絲酵母菌：對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為29.41%、17.64%，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，野生型分別占82.35%、94.12%；白假絲酵母菌：對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感率分別為93.75%、81.25%，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV顯示，野生型分別占75.00%、81.25%；近平滑假絲酵母菌復(fù)合體：對(duì)氟康唑和伏立康唑均敏感，伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，均為野生型；光滑假絲酵母菌：對(duì)氟康唑均為中介，伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的ECV結(jié)果顯示，野生型分別占66.67%、100.00%、100.00%。見表2。

3 討論

在正常情況下，假絲酵母菌為人體的正常定植菌株之一，當(dāng)人體的免疫力低下或處于抑制狀態(tài)時(shí)，正常菌群可轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，引起人體的皮膚黏膜、口腔等部位的真菌感染，甚至引起血液、肝、腎等部位的侵襲性感染。文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，假絲酵母菌屬在醫(yī)院的真菌感染中居首位。

ITS區(qū)和D1/D2區(qū)為酵母樣真菌常用的鑒定和分類區(qū)域，ITS區(qū)和D1/D2區(qū)還有相似的種內(nèi)變異，一般選擇任意一區(qū)對(duì)酵母樣真菌進(jìn)行鑒定[1-2]。如果待測(cè)菌株兩個(gè)區(qū)的鑒定結(jié)果不同，且 D1/D2區(qū)>1%的突變時(shí)，通常認(rèn)為此株待測(cè)菌株是一個(gè)新種[1]。本研究為保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，運(yùn)用了ITS區(qū)和D1/D2區(qū)對(duì)52株假絲酵母菌進(jìn)行鑒定，ITS區(qū)和D1/D2區(qū)的鑒定結(jié)果相同，未發(fā)現(xiàn)新的酵母樣菌種。

本組研究結(jié)果顯示，真菌血癥的發(fā)病率為5.56%，高于江蘇某醫(yī)院的2.16%[13],但與本院之前報(bào)道的真菌發(fā)病率一致[14]。收集的52株假絲酵母菌，熱帶假絲酵母菌所占比率最高(32.69%)，其次為白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌復(fù)合體，各占30.77%，與之前報(bào)道文獻(xiàn)的菌株分布相似[6]。研究[13,15]報(bào)道，白假絲酵母菌為假絲酵母菌血癥中最主要的致病真菌，其次是近平滑假絲酵母菌復(fù)合體和熱帶假絲酵母菌，與本研究的結(jié)果不同，主要原因可能是假絲酵母菌屬的菌種構(gòu)成情況呈地域性分布，以及抗真菌藥物對(duì)假絲酵母菌屬的選擇性作用。

表2 假絲酵母菌血癥患者分離真菌的藥敏結(jié)果以及流行病學(xué)折點(diǎn)(%)

本研究中白假絲酵母菌對(duì)伊曲康唑的耐藥率最高，其次是泊沙康唑、氟康唑和伏立康唑。熱帶假絲酵母菌對(duì)氟康唑和伊曲康唑的抗真菌藥物的耐藥率比其他菌株高。白假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌對(duì)氟康唑的耐藥率，以及伊曲康唑非野生型所占比例均高于文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道，可能是因?yàn)檫蝾愃幬锏母弊饔孟鄬?duì)較小。本院臨床科室對(duì)氟康唑和伊曲康唑的使用時(shí)間較長(zhǎng)，使用量較多，使用的適應(yīng)證范圍較廣(包括淺部和深部的感染)，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)性耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)2株對(duì)多種唑類藥物耐藥菌株(白假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌各1株)，但這兩株菌對(duì)泊沙康唑的敏感性較好。分析患者臨床資料，發(fā)現(xiàn)其住院期間較長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)伊曲康唑，而未使用泊沙康唑，耐藥菌株的產(chǎn)生可能與使用抗真菌藥物的誘導(dǎo)有關(guān)。但假絲酵母菌對(duì)棘白菌素類藥物的敏感性均為100.00%，表明棘白菌素類和多烯類抗真菌藥物仍為較好的一線抗真菌藥物。本院臨床醫(yī)生在用唑類藥物預(yù)防和治療假絲酵母菌血癥應(yīng)更規(guī)范，尤其對(duì)熱帶假絲酵母菌和白假絲酵母菌引起的菌血癥。

本研究首次調(diào)查江西南昌市假絲酵母菌血癥病原真菌的鑒定和藥物敏感性，有助于了解江西南昌市假絲酵母菌血癥病原真菌的流行病學(xué)情況，為預(yù)防假絲酵母菌血癥的發(fā)生、暴發(fā)，以及治療有著重要的意義。但本研究的調(diào)查時(shí)間短，收集的菌株數(shù)量較少，后續(xù)研究將延長(zhǎng)收集時(shí)間，增加菌株數(shù)量，完善江西省南昌市的假絲酵母菌血癥的流行病學(xué)調(diào)查。

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(本文編輯：豆清婭、左雙燕)

Identificationandantimicrobialsusceptibilityof52pathogenicfungicausingcandidemiainNanchangCityofJiangxiProvince

XIAOYu1,LIUYang1,WANGQian2,ZHANGHao2,WANZhe2,LIRuo-yu2,LIUWei2,CAOXian-wei1

(1TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China; 2ResearchCenterforMedicalMycology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

ObjectiveTo explore the constitute and antimicrobial susceptibility of pathogenic fungi causing candidemia in Nanchang City of Jiangxi Province.MethodsCandidaspp.isolated from blood specimens of patients at a hospital in Nanchang in March-October 2015 were collected, fungal strains were identified by amplifying the internal transcribed spacer (ITS) and large ribosomal subunit (D1/D2 region of 26rRNA), antifungal susceptibility of fungi was detected.ResultsA total of 1 332 positive blood culture specimens were collected, including 74 fungal positive specimens, accounting for 5.56%, 52 strains ofCandidaspp.were obtained, most wereCandidatropicalis(n=17，32.69%)，followed byCandidaalbicans(n=16, 30.77%) andCandidaparapsilosiscomplex(n=16, 30.77%). Identification results of ITS and D1/D2 region were identical. 52 strains ofCandidaspp.were sensitive to both micafungin and caspofungin, epidemiological cutoff value(ECV) of amphotericin B showed that 52 strains were all wild type. Resistance rates ofCandidatropicalisto fluconazole and voriconazole were 29.41% and 17.64% respectively, ECV of itraconazole and posaconazole showed that wild type accounted for 82.35% and 94.12% respectively；resistance rates ofCandidaalbicansto fluconazol and voriconazole were 93.75% and 81.25% respectively, ECV of itraconazole and posaconazole showed that wild type accounted for 75.00% and 81.25% respectively；Candidaparapsilosiscomplexstrains were sensitive to both fluconazole and voriconazole, ECV of itraconazole and posaconazole showed that all were wild type; allCandidaglabratastrains had intermediate resistance rates to fluconazole, ECV of voriconazole, itraconazole, and posaconazole showed that wild type accounted for 66.67%, 100.00%, and 100.00% respectively.ConclusionCandidatropicalisis the most common pathogenic fungus causing candidemia in Nanchang of Jiangxi, followed byCandidaalbicansandCandidaparapsilosiscomplex. Azole, echinocandin, and amphotericin B are still first-line antifungal agents.

candidemia； molecular identification； antifungal agent;Candidaspp.

2016-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81471925)

肖喻(1990-)，男(漢族)，湖北省荊州市人，碩士研究生，主要從事深部真菌的分子流行病學(xué)研究。

曹先偉 E-mail：ndyfyygk@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.09.001

R379.3

A

1671-9638(2017)09-0793-05