賈定洪，王 波，李小林，譚 偉，彭衛(wèi)紅*

基于毛木耳CDS的福壽螺多功能纖維素酶基因密碼子優(yōu)化分析

賈定洪1，2，王 波1，李小林1，譚 偉1，彭衛(wèi)紅1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川成都 610066;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610064)

【目的】克隆福壽螺多功能纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，M fc)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造，便于后續(xù)毛木耳Mfc基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究?！痉椒ā坎捎肅odonW軟件分析福壽螺多功能纖維素酶基因Mfc及毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度差異，以毛木耳CDS密碼子特征對(duì)福壽螺M fc基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化?！窘Y(jié)果】改造后的Mfcsg序列GC含量從原始Mfc序列的54.04%增加到58.16%，與毛木耳遺傳背景一致。【結(jié)論】實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后獲得的Mfcsg基因序列GC含量與毛木耳遺傳背景一致，沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及反向重復(fù)序列，能夠作為毛木耳外源基因轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

福壽螺;毛木耳;密碼子優(yōu)化

【研究意義】能源資源是國(guó)家的重要財(cái)富，也是一種對(duì)國(guó)家而言必備的生產(chǎn)要素，在社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中起到極為重要的作用，具有極為深遠(yuǎn)的戰(zhàn)略地位[1]。目前能源供應(yīng)中化石能源在世界能源消費(fèi)結(jié)構(gòu)中所占比例長(zhǎng)期保持在85%以上[2]，是世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展重要驅(qū)動(dòng)力量。但由于化石能源存在不可再生性及污染環(huán)境的缺點(diǎn)，因而替代能源的發(fā)掘就變得十分迫切[3]。相對(duì)于化石能源，生物能源是一種可再生及環(huán)境友好型替代資源[4]。纖維素降解酶類能夠?qū)㈦y以利用的纖維基質(zhì)分解為可再生的生物燃料，是一種價(jià)值巨大的生物資源[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】纖維素酶(cellulase)是將纖維素降解成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一類酶的總稱。纖維素降解生成葡萄糖需要至少3種纖維素酶協(xié)同作用才能完成，分別是內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)[5]。而據(jù)報(bào)道從福壽螺(Ampullaria crossean)胃組織分離的多功能纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，MFC)能夠編碼內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)這3種纖維素酶[5]，應(yīng)用前景看好。目前已在灰蓋鬼傘[6]和草菇等食用菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。但多功能纖維素酶基因(MFC)來(lái)源于福壽螺組織，在其它物種細(xì)胞中不一定能夠穩(wěn)定高效表達(dá)。因?yàn)槊總€(gè)氨基酸在同義密碼子使用上都存在明顯的物種偏好性[7]，并且密碼子優(yōu)化與否直接決定著mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響核糖體易位和蛋白翻譯[8]。因此，異源基因的密碼子優(yōu)化改造對(duì)于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)十分必要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為了使福壽螺組織克隆得到的多功能纖維素酶基因(MFC)能夠在毛木耳中進(jìn)行有效穩(wěn)定表達(dá)，課題擬開(kāi)展福壽螺MFC基因與毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子偏好性比較分析，并依據(jù)毛木耳密碼子偏好性特征優(yōu)化MFC序列。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為福壽螺多功能纖維素酶基因(MFC)在毛木耳細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)提供支撐，并為毛木耳等相關(guān)食用菌種類的功能基因發(fā)掘及改造等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料:福壽螺，購(gòu)自成都市青石橋市場(chǎng)。毛木耳菌株“黃耳10號(hào)”保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所。感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自上海邁其生物科技有限公司。

試劑:本試驗(yàn)RNA提取、1stcDNA合成試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，RT-PCR試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司合成，高保真Taq酶購(gòu)自MBIFermentas，pEASY-T1載體購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MFC基因克隆 將福壽螺胃組織獲得后提取RNA，按照1stcDNA合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，使用引物對(duì)(mfcF1:5′-TCGACGACGCTTCAGTCAAGC-3′，mfcR1:5′-GTTGCCCTCTGAGTGTCGCTC-3′)通過(guò)高保真Taq酶PCR擴(kuò)增MFC基因序列，純化擴(kuò)增片段并兩端加“A”后將擴(kuò)增片段連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到DH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑單克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.2 MFC基因序列分析 將測(cè)試獲得的MFC基因序列與GenBank登錄的近源序列EGXA (FJ183727.1，Ampullaria crossean)、MFC(EU5 99577.1，Ampullaria crossean)、EGX1(DQ848667.1，Pomacea canaliculata)、xylanase(AY941794.1，Ampullaria crossean、EGX3(DQ848668.1，Pomacea canaliculata cellulase)、EGX1(DQ848670.1，Pomacea

canaliculata)、EGX3(DQ848669.1，Pomacea canaliculata)進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA4軟件對(duì)GenBank中近緣基因序列與實(shí)驗(yàn)測(cè)定MFC序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 密碼子偏好性分析 根據(jù)Paul和Elizabeth (1991)篩選原則[9](一條以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG或TGA為終止密碼子且長(zhǎng)度大于300 bp的完整CDS序列)，選取德陽(yáng)什邡毛木耳栽培基地采集的黃耳10號(hào)子實(shí)體樣品測(cè)序獲得的CDS (comp22688-c0-seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白)為毛木耳測(cè)試樣本，以克隆獲得的MFC基因?yàn)楦勐轀y(cè)試樣本，運(yùn)用CodonW軟件計(jì)算福壽螺及毛木耳密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度。

1.2.4 MFC基因毛木耳適應(yīng)性密碼子優(yōu)化 利用同義密碼子置換的方法，達(dá)到破壞mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及翻譯起始位點(diǎn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，得到具有最佳RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能的序列[10]，并分析MFC基因改造前后的序列差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MFC基因測(cè)序及分析

以CTAB法提取的MFC基因組DNA為模板，擴(kuò)增、克隆測(cè)序得到1088 bp的MFC基因序列。該序列GenBank受理號(hào)為KF636134.1，基因序列見(jiàn)圖1。

2.2 MFC基因與近源基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將福壽螺MFC基因序列與近緣基因EGXA (FJ183727.1，Ampullaria crossean)、MFC(EU599 577.1，Ampullaria crossean)、EGX1(DQ848667.1，Pomacea canaliculata)、xylanase(AY941794.1，Ampullaria crossean、EGX3(DQ848668.1，Pomacea canaliculata)、EGX1(DQ848670.1，Pomacea canaliculata)、EGX3(DQ848669.1，Pomacea canaliculata)進(jìn)行序列比對(duì)。采用MEGA4軟件進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)獲得MFC基因與其他近源基因存在差異，差異最小的是福壽螺來(lái)源的EGXA (FJ183727.1)和MFC(EU599577.1)，遺傳距離分別為0.006和0.007;差異最大的是同樣來(lái)源的EGX1(DQ848670.1)及EGX3(DQ848669.1)，遺傳距離分別為0.799和0.816。

2.3 福壽螺MFC序列與毛木耳轉(zhuǎn)錄本序列密碼子偏好性分析

運(yùn)用CodonW軟件計(jì)算MFC基因序列及毛木耳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得CDS序列的密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度。

圖1 福壽螺多功能纖維素酶基因(MFC)序列Fig.1 Sequences of MFC gene from Ampullaria crossean

圖2 福壽螺MFC基因與其它近源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on MFC and closely related genes of other species

運(yùn)用CodonW軟件分析了MFC基因的密碼子(共計(jì)396個(gè))使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度(表1～2)。其中RSCU＞1的密碼子共計(jì)21個(gè)，為福壽螺MFC基因的偏好性密碼子，其中CUG、GUG、AGC、AGA這4個(gè)密碼子RSCU≥2，偏好性較強(qiáng)。而毛木耳CDS(comp22688-c0-seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白)共4996密碼子，RSCU＞1的密碼子共計(jì)26個(gè)，其中RSCU≥2密碼子有5個(gè)，分別為CUC、AUC、GUC、CGC、GGC，偏好性較強(qiáng)。

總體上，福壽螺與毛木耳偏好密碼子不同的氨基酸有10個(gè)(不包含起始密碼子及終止密碼子)，相同偏好密碼子的氨基酸有11個(gè)，不同偏好性密碼子約占半數(shù)。其中RSCU≥2密碼子中，福壽螺MFC基因有4個(gè)，毛木耳CDS有5個(gè)。其中4個(gè)氨基酸的密碼子偏好性最強(qiáng)，分別是亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)，并且偏好的密碼子都各不相同，毛木耳還多一個(gè)偏好性較強(qiáng)的異亮氨酸(Ile)。

2.4 MFC基因密碼子偏好性改造

利用多次同義密碼子置換，排除含有毛木耳CDS中利用率低于10%的密碼子以及存在反向重復(fù)堿基的候選序列，優(yōu)化得到具有最佳RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能的序列(圖3)。

表1 MFC基因密碼子偏好性分析Table 1 Codon usage of MFC gene in Ampullaria crossean

優(yōu)化后的序列GC含量從原始MFC序列的54. 04%增加到58.16%，與毛木耳遺傳背景一致。用DNAstar7.1.0軟件檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的MFC序列最小自由能為-309.35 Kcal/mol，沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及反向重復(fù)序列(圖4)，序列優(yōu)化效果良好。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示福壽螺與毛木耳在氨基酸密碼子偏好性上存在明顯差異，如果不經(jīng)密碼子優(yōu)化直接轉(zhuǎn)入毛木耳，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化后該基因形成mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在[8]。在翻譯上，如果福壽螺的基因密碼子在毛木耳細(xì)胞內(nèi)剛好是稀有密碼子，這類問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致該基因不能得到較好翻譯，從而影響該基因高效表達(dá)[11]。如本試驗(yàn)中分析發(fā)現(xiàn)毛木耳就存在UUA、CUA、AUA、GUA等稀有密碼子，如果不排除存在這些含有毛木耳稀有密碼子的序列，那么轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入的毛木耳細(xì)胞的外源基因表達(dá)就會(huì)受到影響，不能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的。排除了稀有密碼子、重復(fù)序列等不良影響因素設(shè)計(jì)的序列將是外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)的最佳材料。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的MFC基因片段與PPK2連接構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)AGL-1工程菌轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入毛木耳細(xì)胞，并得到了良好表達(dá)(結(jié)果另文發(fā)表)，這也是對(duì)密碼子優(yōu)化型基因高效表達(dá)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 毛木耳CDS密碼子偏好性分析Table 2 Codon usage of CDS in Auricularia polytricha

實(shí)驗(yàn)將福壽螺基因MFC與毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子偏好性進(jìn)行了比較分析，并依據(jù)毛木耳密碼子偏好性特征優(yōu)化獲得了改造型MFC序列，并在毛木耳細(xì)胞中得到了較好表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為毛木耳外源基因改造和表達(dá)提供了參考，表明外源基因的密碼子優(yōu)化改造是實(shí)現(xiàn)異源基因在宿主細(xì)胞高效表達(dá)的重要手段。

圖3 優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(MFC)序列Fig.3 Codon-optimized sequence of MFC gene

圖4 優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(MFC)序列重復(fù)序列檢測(cè)圖Fig.4 Determine of repeats in the codon-optimized sequences of MFC gene

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Codon Optim ization of M ulti-functional Cellulase Gene in Ampullaria crossean Based on Characteristic Codon Usage of CDS in Auricularia polytricha

JIA Ding-hong1，2，WANG Bo1，LIXiao-lin1，TANWei1，PENGWei-hong1*
(1.Soil and Fertilizer Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment，College of Life Sciences，Sichuan University，Sichuan Chengdu 610064，China)

【Objective】For subsequent transgenic study onmulti-functional cellulase gene(Mfc)in Auricularia polytricha，its cloning and codon optimization were performed.【Method】The biosoftware of CodonW was used to analyze the differences of codon usage between M fc gene in Ampullaria crossean and CDS in A.polytricha，and codons of Mfc gene in A.crossean were optimized based on characteristic codon usage of CDS in A.polytricha.【Result】The GC contentof optimized Mfcsg sequence increased from 54.04%to58.16%，which was in accordance with A.polytricha genetically.【Conclusion】The GC content of optimized Mfcsg sequence was in accordance with A.polytricha genetically.No hairpins，direct repeats and inverted repeats were detected in the optimized Mfcsg sequence，which indicated that this sequence was able to be used as heterologous gene for the transgenic study of A.polytricha.

Ampullaria crossean;Auricularia polytricha;Codon optimization

S567.3+9

A

1001-4829(2017)8-1726-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.006

2016-03-22

四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目(2014QNJJ-012);突破性食用菌新品種選育、育種材料與方法創(chuàng)新項(xiàng)目“毛木耳抗病新品種選育研究”;國(guó)家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-24);四川食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

賈定洪(1977-)，男，博士，副研究員，主要從事食用菌分子生物學(xué)和遺傳育種研究，jdhdragon@qq.com，*為通訊作者。