蔡 璘，劉忠偉，周為華，陳飛飛，丁 偉*

枯草芽抱桿菌對煙草白粉病抑制及控病效果研究

蔡 璘1，劉忠偉2，周為華3，陳飛飛3，丁 偉1*

(1.西南大學植物保護學院，重慶北碚 400716;2.貴州大學生命科學院，貴州貴陽 550025;3.貴州省遵義市煙草公司桐梓縣分公司，貴州桐梓 563200)

【目的】本文探究了枯草芽抱桿菌對白粉病病的抑制作用及其防治效果?！痉椒ā坎捎脪呙桦娮语@微鏡(SEM)觀察枯草芽抱桿菌對白粉菌菌絲的抑制作用，同時結(jié)合田間及烘烤對比實驗測定煙草生長期和烘烤過程中枯草芽抱桿菌對白粉病的防控效果?！窘Y(jié)果】枯草芽抱桿菌對白粉菌菌絲生長和分生抱子萌發(fā)均有明顯的抑制作用，其能使白粉菌菌絲頂端腫脹變形呈球狀，導致新生分生抱子的個數(shù)顯著減少;田間實驗顯示，枯草芽抱桿菌對煙草白粉病的田間防效可達70%以上，與化學藥劑甲基硫菌靈相當，且對煙草葉片有一定的促生作用;烘烤前在發(fā)病煙葉上噴施枯草芽抱桿菌，可有效降低烘烤過程中白粉病的發(fā)病程度，其防效為36.59%，而甲基硫菌靈則不具備這種作用。【結(jié)論】枯草芽抱桿菌不僅對田間防治白粉病具有重要應(yīng)用價值，而且在烘烤過程中也能降低白粉病原菌的再侵染，其控病作用的機制可能是對病原菌抱子萌發(fā)具有一定的抑制作用。

煙草白粉病;枯草芽抱桿菌;抑制作用;防效

【研究意義】煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位，但病蟲害的發(fā)生給煙草生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，其中煙草白粉病是由二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC.)引起的一種災(zāi)難性真菌病害，對煙草產(chǎn)量和品質(zhì)均有嚴重影響[1]。煙草白粉菌產(chǎn)生的孢子常能借助空氣大范圍傳播，且可多次重復侵染寄主植物，是我國西南煙草栽培區(qū)的重要病害之一。其侵染煙草的過程通常是老葉先發(fā)病，然后自下而上逐漸蔓延[2-3]。在溫度適宜的條件下白粉病孢子快速擴散，并隨著空氣相對濕度增高發(fā)病速度加快。當前，培育抗病品種、加強田間栽培管理、采用藥劑防治是防治煙草白粉病病害的主要措施。培育出的抗病強的煙草品種，因產(chǎn)量和質(zhì)量問題，難以大規(guī)模用于實際生產(chǎn)，而通過加強田間栽培管理的方法防治煙草白粉病，因田間溫濕度等自然氣候因素的不可控制，也逐漸喪失了優(yōu)勢。當前生產(chǎn)上頻繁施用百菌清、腈菌唑等化學殺菌劑對煙草白粉病進行大田防治，效果均不太理想，且化學藥劑的長期使用會增強病原菌抗性，導致農(nóng)藥殘留增加，影響煙草安全，對環(huán)境造成很大污染;而生物防治因其無污染、無殘留、成本低等優(yōu)點，逐漸成為煙草病害防治的有效措施?！厩叭搜芯窟M展】近年來，有益微生物對植物真菌性病害顯示出較好的防治效果，使得生物防治日益成為控制真菌性病害的一條很有發(fā)展前景的途徑?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是目前常用的生防菌之一，諸多研究表明其對多種植物病原菌均具有抑制作用[4-5]?；卦旗o等發(fā)現(xiàn)施用枯草芽孢桿菌生物菌劑對五味子白粉病的防治效果高達78.9%，并能使葉片增厚[6]。宋雙采用云芝菌絲體液體發(fā)酵后，測試出該發(fā)酵產(chǎn)物對煙草白粉病病菌有顯著的體外鈍化和預防作用，對煙草白粉病也有很好的抑制侵染效果[7-8]。防治煙草白粉菌并不能僅僅局限于大田生長階段防治，在烘烤過程中，白粉菌也會繼續(xù)侵染。盧志偉等研究表明，烘烤過程中，由于烤房環(huán)境達到煙草白粉菌生長的溫度和濕度，白粉菌在散葉堆放階段和鮮煙裝炕階段均可侵染煙葉，導致其病斑第二次擴散[9]。但是目前的研究著重于大田防治煙草白粉病，對于防治白粉菌在烘烤過程中對煙葉的侵染尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗研究枯草芽孢桿菌對煙草白粉病的抑制作用及其防治效果，以甲基硫菌靈為對照，觀察到枯草芽孢桿菌能通過影響煙草白粉菌菌絲形態(tài)繼而抑制分生孢子萌發(fā)，進一步研究了枯草芽孢桿菌對煙草白粉病的田間防治效果及對煙草葉片的促生作用，同時結(jié)合枯草芽孢桿菌對白粉菌在煙葉烘烤過程中二次侵染的影響，全方位評估枯草芽孢桿菌對煙草白粉菌的抑制效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】該研究以期為枯草芽孢桿菌制劑今后在煙草白粉病病害的大面積防治奠定基礎(chǔ)，并為烘烤過程中防治煙草白粉病提供安全可行性方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

室內(nèi)盆栽供試菌株:將在貴州采到的煙草白粉病新鮮病樣，單分生孢子梗接種后分離純化、擴繁，采用活體煙株保存在西南大學天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室。

實驗地及栽培情況:本次實驗在貴州省遵義市桐梓縣九壩鎮(zhèn)湖南中煙集團芙蓉王品牌九壩煙葉基地單元進行內(nèi)，實驗地海拔1205 m，28.23778。N，106.73861。E，常年植煙土，實驗地肥力中等，為白粉病高發(fā)地區(qū)。煙苗采用集約化漂浮育苗，苗齡一致，健壯無病，由貴州省遵義市煙草公司桐梓縣分公司統(tǒng)一提供。株行距1.1 m×0.7 m，供試品種于4月25日統(tǒng)一移栽，7月20日統(tǒng)一打頂。其它大田管理措施均按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)規(guī)范進行。用于烘烤階段白粉病防治實驗的煙葉以中部煙葉為實驗材料，依據(jù)成熟采收標準，在煙葉成熟時單葉采收。

煙草品種:南江三號;藥劑:1000億孢子·g-1枯草芽胞桿菌(江西順泉生物科技有限公司);50%甲基硫菌靈(江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司);掃描電子顯微鏡:日立S-3400N型掃描電子顯微鏡;烤房:采用氣流上升式密集烤房進行烘烤，裝煙密度為72 kg·m-3，參照“三段式烘烤工藝”正常烘烤。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯草芽抱桿菌對煙草白粉菌菌絲形態(tài)的影響 用毛筆將新鮮煙葉上的白粉菌刷到燒杯中，用蒸餾水稀釋成到10×顯微鏡下每個視野含有10～15個孢子的懸浮液。使用噴霧器將分生孢子懸浮液均勻噴灑到每株幼苗葉片上接種白粉菌。7 d后對葉片噴施枯草芽孢桿菌(1∶600)、藥劑對照甲基硫菌靈(1∶600)、清水，各處理藥劑以廠家推薦濃度進行稀釋，施用方式為葉面兩面噴施。采集用藥后7 d的葉片，PBS(磷酸緩沖液，pH7.4，0.01 M)清洗2次，2.5%戊二醛固定4 h，PBS清洗1～2次，1%鋨酸固定1 h，PBS清洗1～2次，30%、50%、70 %、90%、100%酒精梯度脫水，10 min/次，臨界點干燥，日立E1010離子濺射儀鍍膜，日立S-3400N型掃描電子顯微鏡觀察白粉菌菌絲、分生孢子梗和分生孢子形態(tài)變化。

1.2.2 枯草芽抱桿菌對田間煙草白粉病防治效果

共設(shè)3個處理組，枯草芽孢桿菌處理組、甲基硫菌靈處理組、清水對照組。各處理田間隨機區(qū)組排列，3次重復，共計9個小區(qū)，每個小區(qū)面積約40 m2，四周設(shè)保護行。噴施枯草芽孢桿菌、甲基硫菌靈、清水，施用方式參照1.2.1。調(diào)查每棵煙株上的所有展開的葉片，記載各處理藥害情況。記總?cè)~數(shù)及各級病葉數(shù)，嚴重度分級應(yīng)符合GB/T23222的規(guī)定。首次施藥前田間基本無病斑，調(diào)查時間定為第2次施藥前、第3次用藥前和第3次用藥后7、15 d調(diào)查病情。并計算病情指數(shù)、防效。

1.2.3 枯草芽抱桿菌對煙草葉片生長的影響 調(diào)查對象與“1.2.2”相同，每個小區(qū)選擇中間2行去2頭煙株后，每小區(qū)定點調(diào)查8株，按YC/T 142-1998《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》標準，定點定株在煙草現(xiàn)蕾期和打頂后7 d測定煙株的最大葉長、最大葉寬、并利用公式(3)計算葉面積。

1.2.4 枯草芽抱桿菌對煙葉烘烤階段白粉菌再侵染的抑制效果 實驗面積約400 m2，煙株種植期間未噴施任何殺菌藥劑，只施用清水保持田間濕度使煙株發(fā)病，采摘后煙葉按白粉病發(fā)病“0、1、3、5、7、9級”分類，噴施不同藥劑，于自然通風處晾干后烘烤。共設(shè)3個處理，各3次重復，各處理藥及劑稀釋倍數(shù)為依次為:枯草芽孢桿菌(1∶600)、甲基硫菌靈(1∶600)和清水，每個重復分別選取“0、1、3、5、7、9級”煙葉各20片煙葉掛牌(標記烤前病級、處理和編號)掛桿烘烤。處理間隨機排列，重復之間用健康煙葉隔開。對烤后煙葉白粉病病級進行分級。記錄采烤前和烘烤后總?cè)~數(shù)及各級病葉數(shù)，嚴重度分級應(yīng)符合GB/T23222的規(guī)定，計算病情指數(shù)和防治效果，參照公式(1)和公式(2)。并測定不同處理煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值相關(guān)指標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Origin8.0、Excel和SPSS18.0進行相關(guān)實驗數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，差異顯著性應(yīng)用LDS及T檢驗進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽抱桿菌對煙草白粉菌菌絲形態(tài)的影響

采集用藥后7 d的葉片進行掃描電鏡觀察，如圖1所示?？莶菅挎邨U菌均對白粉菌分生孢子萌發(fā)及菌絲生長有抑制作用，其作用與甲基硫菌靈相當，都表現(xiàn)為孢子不萌發(fā)，菌絲頂端腫脹變形膨大呈球狀，新生分生孢子的個數(shù)顯著減少(圖1c、1d、1e、1f)，而對照清水處理組無抑制作用。清水處理組菌絲完整、粗壯、表面光滑，有明顯的分生孢子梗，每個分生孢子梗上串生孢子個數(shù)多為5～6個(圖1a、1b)，而2個藥物處理組白粉菌絲有變形、凹陷，甚至扭曲現(xiàn)象，菌絲沒有分生孢子梗或分生孢子梗上的串生孢子大多表現(xiàn)為不萌發(fā)，少部分個數(shù)為1個。噴施枯草芽孢桿菌和甲基硫菌靈的病菌發(fā)育受到阻滯，表明其對白粉菌菌絲有顯著破壞作用而阻止孢子萌發(fā)。

2.2 枯草芽抱桿菌對田間煙草白粉病防治效果

數(shù)據(jù)顯示枯草芽孢桿菌對煙草白粉病的防治效果與甲基硫菌靈相當，表現(xiàn)枯草芽孢桿菌對煙草白粉病較好的抑制作用(表1)。第1次施藥前，田間基本無病斑，3次施藥分別間隔7 d。相比清水處理，枯草芽孢桿菌對病原菌的防治效果在調(diào)查時期內(nèi)依次為44.93%、64.87%、69.54%和71.58%，隨時間呈現(xiàn)上升趨勢，而甲基硫菌靈則無此現(xiàn)象，且第3次用藥后兩種藥劑處理后的防治效果皆無顯著性差異。

2.3 枯草芽抱桿菌對煙草葉片生長的影響

生育期(現(xiàn)蕾期和打頂后7 d)調(diào)查結(jié)果表明，噴施甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌對煙草葉片的的生長都顯示一定的促進作用，其中枯草芽孢桿菌效果較好(圖2)。噴施枯草芽孢桿菌后，現(xiàn)蕾期和打頂后7 d葉長依次為75.63和78.93 cm，而對應(yīng)甲基硫菌靈組僅為73.25和77 cm;打頂后7 d，枯草芽孢桿菌處理葉面積值高于甲基硫菌靈處理和空白對照。由此可見，噴施生防菌劑枯草芽孢桿菌對葉片長、寬和葉面積都具有一定程度的增大作用，其對枯草芽孢桿菌煙草葉片生長發(fā)育的促進能力高于甲基硫菌靈。

表1 不同藥劑對煙草白粉病的田間防治效果Table 1 Control efficacy of different pesticides against tobacco powderymildew

圖1 不同藥劑對菌絲形態(tài)的影響Fig.1 Effects of different pesticides on powderymildew characteristic

2.4 枯草芽抱桿菌對煙葉烘烤階段白粉菌再侵染的抑制效果

由表2可知，烘烤前對有病斑的葉面噴施枯草芽孢桿菌，對離體葉片的煙草白粉病的防治效果可高達36.59%，顯著優(yōu)于甲基硫菌靈處理組。除此之外，枯草芽孢桿菌還具有生防菌劑安全的優(yōu)點。

圖2 不同藥劑對葉片的影響Fig.2 Effects of different pesticides on leaf traits

表2 不同藥劑對烘烤過程中煙草白粉病的防治效果Table 2 Control efficacy of different pesticides against powderymildew of flue-cured tobacco during curing

清水處理的煙葉烘烤后病情指數(shù)較烤前呈現(xiàn)明顯上升趨勢(圖3)，但是枯草芽孢桿菌處理后顯著降低。就烤前不同病級而言，噴施枯草芽孢桿菌烘烤后其病級都顯示下降的現(xiàn)象，甲基硫菌靈則無此現(xiàn)象。相比清水處理，2種藥劑都有顯著效果，其中以枯草芽孢桿菌最明顯。當烤前病級為1、3、5級時，噴施枯草芽孢桿菌對白粉病都有較好抑制效果。烘烤前病級為1、3、5級時，使用枯草芽孢桿菌處理后病情指數(shù)能降低40%左右，7級時變化率僅為22 %。然而使用相同方法噴施甲基硫菌靈后，3、5、7級的病葉病情指數(shù)會升高3%～5%，1級時升高28%。清水對照的病情指數(shù)變化率隨病級升高而降低，其中1級時該升高率達128%。因此，本實驗通過對不同病級的白粉病煙葉使用枯草芽孢桿菌(生防菌劑)和甲基硫菌靈(化學藥劑)處理后烘烤，表明煙葉烘烤前只有噴施生防菌劑能有效抑制煙葉烘烤后白粉菌的二次侵染。

3 討論與結(jié)論

白粉菌屬植物專性寄生菌，溫度和濕度等條件對其分生孢子萌發(fā)都有顯著性影響，因此在人工培養(yǎng)基上很難得到準確的萌發(fā)率[10]。本實驗利用枯草芽孢桿菌處理白粉菌感染煙草葉片，采用掃描電鏡觀查枯草芽孢桿菌對白粉病分生孢子形成及菌絲生長的影響，結(jié)果表明:枯草芽孢桿菌能抑制白粉菌孢子梗的產(chǎn)生，進而抑制分生孢子的萌發(fā)，初步推測其抑菌機理可能是枯草芽孢桿菌在葉面快速大量定殖，分泌抑菌物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)能破壞菌絲形態(tài)，導致白粉菌菌絲畸形，同時抑制分生孢子產(chǎn)生。有研究表明枯草芽孢桿菌生長代謝過程中能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，包括低分子量抑菌肽[11]、抑菌蛋白[12]和揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[13]等，但具體作用機制尚待研究?？莶菅挎邨U菌作為植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細菌，在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，主要通過營養(yǎng)和空間位點競爭、分泌抗菌等機制發(fā)揮生防功能[6，13-14]，對豌豆的根腐病、水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病、黃瓜白粉病[14-17]等都有較好防效，且芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，在植物微生態(tài)區(qū)繁殖能力較高。有文獻報道多種生防藥劑根施能綜合提高植株的抗病能力[19-22]，根據(jù)生防菌各自不同的作用方式合理復配，可達到增效的目的。本實驗證明枯草芽孢桿菌對白粉病菌防治具有積極效果，以后的實踐中可結(jié)合不同生防藥劑及不同施藥方式科學復配，增加防治效果。

圖3 不同藥劑對烘烤后白粉病病情指數(shù)的影響Fig.3 Effects of different pesticides on disease index growth rate of powderymildew after flue-curing

通過大田階段進一步調(diào)查，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌對煙草白粉病的防治效果與甲基硫菌靈無顯著性差異，且第3次施用枯草芽孢桿菌后防效最高可達到70%以上，再次驗證了其對白粉病顯著的防治作用。實驗調(diào)查同時發(fā)現(xiàn)煙葉噴施枯草芽孢桿菌后葉面積增大，表明枯草芽孢桿菌在一定程度上促進了烤煙葉片生長發(fā)育的能力，這與相關(guān)研究報道一致[23-25]。目前大多數(shù)研究認為生防菌是通過提高植物對氮、鉀吸收和光合速率促進生長，因為光合速率與葉綠素含量密切相關(guān)，葉綠素含量增加促進植物光合速率增加，進而提高植物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進植物生長[24]，由此可以推斷，生防菌對植物的促生作用主要在生長期，對葉片有增大的效果。

對烘烤前的發(fā)病煙葉噴施枯草芽孢桿菌，烘烤后煙葉發(fā)病程度明顯減輕，防效達到36.59%，極大減少了白粉病帶來的損失。本實驗觀察到在煙葉烘烤期間白粉菌仍有繼續(xù)侵染的現(xiàn)象，這與其他學者的研究報道相一致[9]。推測可能由于在堆放和烘烤過程中煙葉溫度的升高和水分的蒸發(fā)，形成適宜白粉菌生長的溫度和濕度，使得在散葉堆放階段和鮮煙裝炕階段白粉菌對煙葉造成大幅度侵染。

在對葉面噴施枯草芽孢桿菌后，我們發(fā)現(xiàn)烘烤過程中白粉病菌的二次侵染得到了有效的抑制，這一特性可以顯著降低煙葉烘烤期間白粉菌繼續(xù)侵染所造成的損失，提高經(jīng)濟效益。有研究表明枯草芽孢桿菌在100℃條件下仍然可以存活29.4%[24]，而煙草烘烤期間最高溫度為68℃左右，就此可推測枯草芽孢桿菌在此過程中仍可大量存活，并分泌抗菌物質(zhì)抑制白粉菌生長，同時在煙葉表面形成生物被膜，進一步抵御白粉菌對植物的侵害[26-27]。

枯草芽孢桿菌還是一種公認的益生菌，安全性較高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品、藥品領(lǐng)域[28-29]，目前市場上已經(jīng)有藥品通過枯草芽孢桿菌以孢子的形式進入消化道抑制有害細菌生長，對腹瀉、下痢等腸胃道疾病都具有很好預防效果[30-32]，且張玉芹等也得出濃度高達5000 mg·kg-1的枯草芽孢桿菌對實驗動物無急性毒性和刺激性等，因此，烘烤后煙葉上枯草芽孢桿菌的殘留不會增加安全隱患[33-34]。

綜上所述，枯草芽孢桿菌不僅對煙草生長期白粉病防治效果顯著，而且能有效抑制烘烤過程中白粉病菌的二次侵染?？莶菅挎邨U菌對白粉病防治效果顯著，其對人畜安全、對環(huán)境無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、對作物生長有促進作用，這些優(yōu)點更符合現(xiàn)代煙草綠色生產(chǎn)及有害生物綜合防治的要求。

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(責任編輯 陳 虹)

Inhibitive and Control Efficacy of Bacillus subtilis against Powdery M ildew on Tobacco

CAILin1，LIU Zhong-wei2，ZHOUWei-hua3，CHEN Fei-fei3，DINGWei1*
(1.College of Protection，Southwest University，Chongqing 400716，China;2.College of Life Science，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;3.Tongzi Tobacco Branch Company，Zunyi Tobacco Company，Guizhou Tongzi563200，China)

【Objective】In this paper，the inhibition and control efficacy of Bacillussubtilis against powderymildew were explored.【Method】The inhibition of Bacillus subtilis to powderymildew hyphae by scanning electron microscope(SEM)was observed，combined with contrast test in the field and curing，the damaging effects of Bacillus subtilis on powderymildew during tobacco growth and curing were determined.【Result】Bacillus subtilis significantly exhibited inhibitory effect on the growth of powderymildew hypha and its conidium germination，causing the top of the powderymildew hyphae deformation and became swelling and spherical and leading to the significant reduce of new born identify spores.Further study displayed that the control effect of Bacillus subtilis on tobacco powdery mildew in the field wasmore than 70 %，similar to Thiophanate-methyl，and the growth of tobacco leaveswas promoted.Itwas effective to reduce the occurrence of powderymildew spraying Bacillus subtilis on tobacco leaf before curing，the control effectwas up to36.59%.However，thiophanate-methyl did not exhibited this effect.【Conclusion】The results indicated that Bacillussubtilis notonly had importantapplication value for prevention and control of powderymildew in the field，butalso could reduce the infection of powderymildew.The inhibitory on spore germinationmay be themain disease controlmechanism.

Tobacco powderymildew;Bacillus subtilis;Inhibitive effect;Efficacy

S467

A

1001-4829(2017)8-1795-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.017

2016-11-13

國家煙草專賣局重點科技項目(110201502019);中央高?；緲I(yè)務(wù)費專項資金(XDJK2016E152)

蔡 璘(1993-)，女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥學研究;*為通訊作者:丁 偉，教授，博士，從事天然產(chǎn)物農(nóng)藥與煙草有害生物系統(tǒng)控制研究，E-mail:dwing818@ 163.com。