劉超英，吳程華，高 洪，嚴(yán)玉霖，富國(guó)文，趙 汝，苗淑淑，劉 嫦

云南撒壩豬EPEC HPI irp2缺失株的攝鐵能力研究

劉超英，吳程華，高 洪*，嚴(yán)玉霖，富國(guó)文，趙 汝，苗淑淑，劉 嫦

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

【目的】本研究探討了云南撒壩豬EPEC HPI毒力島的攝鐵功能與致病性之間的關(guān)系。【方法】本試驗(yàn)通過(guò)攝鐵實(shí)驗(yàn)對(duì)5株腸致病性E.coli(A-E)和CVCC1565鐵載體的合成和在不同2，2’-聯(lián)吡啶含量下的最低生長(zhǎng)抑制濃度及對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)利用已構(gòu)建的E.coli irp2基因缺失株和親本株進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)HMWP2蛋白的表達(dá)，并通過(guò)半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)比較兩者之間的毒力?！窘Y(jié)果】除E.coli(D)外，其余菌株的2，2’-聯(lián)吡啶最低生長(zhǎng)抑制濃度為0.6 mM;親本株能夠表達(dá)HMWP2蛋白，irp2缺失株不表達(dá)該蛋白;CAS固體培養(yǎng)基中菌株能產(chǎn)生橘黃色的透明暈圈;當(dāng)2，2’-聯(lián)吡啶濃度高于0.2 mM時(shí)，親本株的生長(zhǎng)率高于irp2缺失株;親本株的LD50(8.73×107cfu/mL)低于缺失株(9.95×107cfu/mL)?！窘Y(jié)論】云南撒壩豬EPEC HPI鐵攝取功能和致病性之間存在著一定關(guān)系。

EPEC;HPI;irp2基因;攝鐵功能

【研究意義】撒壩豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，具有繁殖能力和抗病力強(qiáng)，耐粗飼，肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[1]，但因飼養(yǎng)水平較低，使腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)感染引起的原發(fā)性或繼發(fā)性豬大腸桿菌病成為嚴(yán)重威脅云南特色養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，鐵元素是微生物生長(zhǎng)的必須元素，鐵載體能夠特異性結(jié)合鐵離子并運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)[2-3]。毒力島(High-pathogeniticity island，HPI)是研究細(xì)菌的毒力因子和致病性之間關(guān)系的基因簇，與細(xì)菌的毒力密切相關(guān)。耶爾森菌強(qiáng)毒力島主要含有與攝鐵有關(guān)的毒力基因簇[4]，研究表明耶爾森桿菌HPI可以在耶爾森菌和E.coli之間水平傳播，與EPEC的毒力進(jìn)化有著密切的關(guān)系[5]。其中irp1、irp2基因在鐵缺乏的條件下分別表達(dá)2個(gè)高分子量蛋白:HMWP1和HMWP2[6]。HMWPs(High molecular weight pro-teins，高分子量鐵調(diào)節(jié)蛋白)參與表達(dá)耶爾森桿菌素的陽(yáng)性表型，被認(rèn)為對(duì)鐵載體耶爾桿菌素的合成有著非常重要的作用?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】HMWP2的表達(dá)及CAS平板上暈圈的大小能夠證明細(xì)菌攝鐵能力的高低，親本株和缺失株LD50的大小與細(xì)菌毒力直接相關(guān)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此通過(guò)試驗(yàn)研究irp2基因與細(xì)菌攝鐵能力之間的關(guān)聯(lián)，探索其對(duì)細(xì)菌致病性的影響，不僅可對(duì)豬源EPEC HPI與攝鐵能力之間的關(guān)系進(jìn)一步深入研究，還可闡明HPI的致病過(guò)程和致病機(jī)理，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5株E.coli分離株(A-E)、CVCC1565菌株和利用RED同源重組方法[7]構(gòu)建的E.coli irp2基因缺失株均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)研究實(shí)驗(yàn)室保存提供。試驗(yàn)小鼠購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 2，2’-聯(lián)吡啶對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的最低抑制濃度的測(cè)定 分別配置含有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mM 2，2'-聯(lián)吡啶的LB濃度梯度培養(yǎng)基，細(xì)菌不能生長(zhǎng)的某一個(gè)濃度即為2，2'-聯(lián)吡啶的最低抑制濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株鐵載體的檢測(cè) 采用通用鉻天青S(Chrom azurol S，CAS)檢測(cè)法對(duì)E.coli內(nèi)存在的鐵載體進(jìn)行初步檢測(cè)[8]。將E.coli(A-E)和CVCC1565菌株的少許單菌落點(diǎn)種在CAS平板上，37℃培養(yǎng)，每12 h觀察1次菌落周圍顏色的變化，測(cè)定菌落直徑直至不再變化。

1.2.3 irp2基因缺失株與親本株蛋白表達(dá)差異的比較 通過(guò)SDS-PAGE電泳分析比較缺失株E.coli (E)/Δirp2與親本株E.coli(E)蛋白表達(dá)圖譜的差異。

1.2.4 親本株E.coli(E)和缺失株E.coli(E)/ Δirp2生長(zhǎng)速率的測(cè)定 分別于第0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20小時(shí)測(cè)定含有0.1、0.2、0.3、0. 4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mM 2，2'-聯(lián)吡啶的LB濃度梯度培養(yǎng)基中親本株和irp2缺失株菌液的OD600值，利用公式計(jì)算(式中t1和t2為所取對(duì)數(shù)期2點(diǎn)的時(shí)間，W1和W2分別為相應(yīng)時(shí)間測(cè)的的OD600值，G為代時(shí))，并繪制生長(zhǎng)率曲線。1.2.5 親本株E.coli(E)和缺失株E.coli(E)/ Δirp2 LD50的測(cè)定 用生理鹽水將E.coli(E)和E. coli(E)/Δirp2肉湯培養(yǎng)液分別稀釋至3×108、3× 107、3×106、3×105、3×104cfu/mL。將75只實(shí)驗(yàn)小鼠平均分為1、2和3號(hào)組。1和2號(hào)組以0.1 mL/只劑量分別腹腔注射親本株和缺失株培養(yǎng)液，3號(hào)組為對(duì)照組。注射后每4 h觀察1次，連續(xù)觀察3 d。記錄其死亡數(shù)量，并按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)致死量。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,2'-聯(lián)吡啶對(duì)6株E.coli的最低抑制濃度的測(cè)定

在不同濃度的2，2′-聯(lián)吡啶限鐵環(huán)境，E.coli(D)在0.4 mM濃度下停止生長(zhǎng)，其余5株均在0.6 mM濃度下停止生長(zhǎng)。

2.2 HPI陽(yáng)性株鐵載體的檢測(cè)

除了E.coli(D)，檢測(cè)的6株E.coli在CAS固體平板上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)1 d后就有明顯的透明暈圈出現(xiàn)在菌落的周圍，8 d后暈圈直徑達(dá)到最大?？梢詳喽óa(chǎn)生橘黃色透明暈圈的E.coli在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的物質(zhì)對(duì)鐵有較高的親和力，使培養(yǎng)基發(fā)生明顯的由藍(lán)到橙的顏色改變。表1為實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)生的暈圈大小情況。

2.3 親本株與irp2缺失株蛋白表達(dá)差異的比較

在2，2'-聯(lián)吡啶濃度為0.2 mM的情況下，親本株能夠表達(dá)HMWP2，但是irp2缺失株不能表達(dá)HMWP2(圖1)。

2.4 親本株與irp2缺失株在不同2,2'-吡啶濃度下生長(zhǎng)速率的測(cè)定

以不同的鐵螯合劑濃度為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)率為縱

表1 鐵載體產(chǎn)生菌產(chǎn)生的暈圈大小情況Table 1 The size of halos of the siderophore producing bacteria

坐標(biāo)，繪制出親本株和irp2基因缺失株的生長(zhǎng)速率曲線(圖2)。親本株和缺失株均隨著鐵螯合劑濃度的升高而降低，親本株在0.6 mM濃度時(shí)停止生長(zhǎng);而缺失株在0.4mM時(shí)即停止生長(zhǎng)，irp2基因缺失株的攝鐵能力顯著降低。

圖1 irp2親本株E.coli(E)與缺失株E.coli(E)/Δirp2蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparsion of proteins of E.coli(E)and E.coli(E)/Δirp2 expressed under iron starvation

2.5 親本株與irp2缺失株LD50的測(cè)定

感染3 d后對(duì)照組小鼠均健康存活;攻毒后6 h小白鼠開(kāi)始陸續(xù)死亡，死亡高峰發(fā)生在接種后7～13 h。缺失株的LD50為9.95×107cfu/mL，親本株為8.73 ×107cfu/mL，因此可判斷親本株的毒力大于缺失株。

3 討 論

隨著養(yǎng)豬業(yè)的集約化發(fā)展，EPEC所導(dǎo)致的仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病成為養(yǎng)豬場(chǎng)常發(fā)的傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的威脅和重大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。E.coli的致病性主要取決于鐵攝取系統(tǒng)、菌毛及毒素等特定的毒力因子，HPI毒力島中的irp1、irp2及fyuA是主要鐵調(diào)節(jié)基因[11-14]，能夠通過(guò)Ybt的鐵載體奪取宿主中的鐵元素進(jìn)而加重機(jī)體的感染，從而增強(qiáng)細(xì)菌的存活率，它們?cè)跀z鐵菌素的生物合成、調(diào)節(jié)及攝取中發(fā)揮著極其重要的作用[15-18]。HPI毒力島在豬源EPEC中有著很高的攜帶率[19]，對(duì)毒力島的攝鐵功能及其與宿主致病機(jī)制之間的關(guān)系進(jìn)行初步探索，對(duì)防治豬源致病性大腸桿菌有著重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

圖2 親本株與irp2缺失株在不同濃度2,2'-聯(lián)吡啶下的生長(zhǎng)率Fig.2 The growth curves of parent strain and irp2 deletion strain

鐵元素是微生物生長(zhǎng)的必須元素。當(dāng)細(xì)菌處于缺鐵環(huán)境時(shí)，會(huì)產(chǎn)生鐵載體及其特異性受體[20]。2，2'-聯(lián)吡啶是一種鐵螯合劑，可以結(jié)合培養(yǎng)基中的鐵離子，使細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境處于鐵缺乏狀態(tài)，從而測(cè)定細(xì)菌的最低抑制濃度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，除E.coli(D)在0.4 mM濃度下停止生長(zhǎng)外，其余5株均在0.6 mM濃度下停止生長(zhǎng)。鐵載體是一類能特異性結(jié)合鐵離子的低分子量的物質(zhì)，CAS結(jié)合鐵后形成一種藍(lán)色復(fù)合物，當(dāng)鐵載體與復(fù)合物中的鐵結(jié)合后，其顏色可由藍(lán)色變?yōu)殚冱S色。在CAS培養(yǎng)基中，可以出現(xiàn)鐵載體的分泌圈，從而判斷細(xì)菌是否產(chǎn)生了鐵載體。本試驗(yàn)中，CVCC1565的暈圈最大，E.coli(E)暈圈最小，E.coli(D)無(wú)暈圈。

本試驗(yàn)采用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)irp2缺失株和親本株的HMWP2蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，親本株可以表達(dá)該蛋白，而缺失株則不能表達(dá)。有研究表明，irp2基因在鐵缺乏的條件下可表達(dá)HMWP2蛋白。由生長(zhǎng)曲線可知，當(dāng)2，2'-聯(lián)吡啶濃度大于0.2 mM時(shí)，缺失株E.coli(E)/Δirp2對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率低于親本株E.coli(E)，當(dāng)2，2'-聯(lián)吡啶濃度為0.4 mM時(shí)，缺失株E.coli(E)/Δirp2不再生長(zhǎng)，而親本株E.coli(E)在0.6 mM時(shí)停止生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

irp2基因不是E.coli生長(zhǎng)繁殖的必須功能基因，該基因的缺失對(duì)其生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生影響，但不會(huì)導(dǎo)致死亡。這可能是菌株在缺失irp2基因后不能很好的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相對(duì)于親本株生長(zhǎng)較慢。半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果表明，缺失株E.coli(E)/Δirp2的LD50高于親本株，由此推斷能表達(dá)HMWP2的菌株毒力強(qiáng)于不表達(dá)HMWP2蛋白的菌株，而E.coli(E)/Δirp2雖然缺失了HPI irp2鐵調(diào)節(jié)基因，由于存在著另外的鐵攝取系統(tǒng)，仍然能夠在缺鐵的環(huán)境下生長(zhǎng)，且其攝鐵能力和致病性之間存在著一定的聯(lián)系。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Iron-uptake Function of EPEC HPI irp2 Gene Deletion Strains Isolated from Yunnan Saba Pigs

LIU Chao-ying，WU Cheng-hua，GAO Hong*，YAN Yu-lin，F(xiàn)U Guo-wen，ZHAO Ru，MIAO Shu-shu，LIU Chang
(Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201，China)

【Objective】The present paper aims to explore the relationships between iron-uptake function of EPEC HPI and pathogenicity in Yunnan Saba pigs.【Method】This experiment tested the synthesis of siderophore，theminimum growth inhibition concentration under different2，2′-Dipyridyl contentand growth rate of5 strains E.coli and CVCC1565.The virulence of strain and the expression of HMWP2 were also detected respectively bymedian lethal dose experiment and SDS-PAGE.【Result】Except E.coli(D)，theminimum growth inhibition concentration of other strainswere0.6 mM，the parent strain could expressed HMWP2 protein，but themutation strain could notand strains cultured by CAS solid culture medium produced orange transparent halo.When the content of 2，2′-Dipyridyl was higher than 0.2 mM，the growth rate of parent strain was also higher than mutation strain，parent strain and mutation strain's LD50was 8.73×107and 9.952× 107cfu/m L，respectively.【Conclusion】Above results showed that there was an certain relationship between iron-uptake function of EPEC HPIand pathogenicity in Yunnan Saba pigs.

EPEC;HPI;irp2 gene;Iron-uptake function

S828

A

1001-4829(2017)8-1914-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.038

2016-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260594、31660704);云南生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(云財(cái)農(nóng)[2009]171號(hào));云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動(dòng)基金(2017ZKX030)

劉超英(1992-)，女，河南安陽(yáng)人，在讀博士，從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物健康養(yǎng)殖方向研究，E-mail:1107946950@qq.com，*為通訊作者:E-mail:gaohongping@163.com。