韓冬，張洪臣，柯希望，左豫虎

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319；2.黑龍江省寶清縣種子管理站）

紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)條件研究

韓冬1，張洪臣2，柯希望1，左豫虎1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319；2.黑龍江省寶清縣種子管理站）

豇豆單胞銹菌是引起紅小豆銹病的病原菌。為了明確紅小豆銹病菌夏孢子的萌發(fā)條件，以紅小豆銹病菌ZXL01菌株為材料，研究了培養(yǎng)方法、溫度、光照、儲存條件和儲存時間對紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，最適紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)的培養(yǎng)方法為水瓊脂平板法，夏孢子在水瓊脂上2 h即開始萌發(fā)，隨著培養(yǎng)時間的延長，萌發(fā)率逐漸升高，6 h后萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，萌發(fā)率為75.0%。夏孢子在15～25℃均可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為20℃。光照可明顯抑制夏孢子萌發(fā)。夏孢子在4℃條件下儲存360 d后已基本喪失萌發(fā)能力，而夏孢子在-20℃條件下儲存360 d時仍可保持萌發(fā)活力。

紅小豆銹??；豇豆單胞銹菌；夏孢子；萌發(fā)條件

由豇豆單胞銹菌（Uromyces vignae）[1]引起的紅小豆銹病是在紅小豆生產(chǎn)中危害最為嚴重的病害之一，在紅小豆全生育期均可發(fā)生，該病主要侵害葉片、莖、豆莢。病害發(fā)生嚴重時，可導致葉片干枯、脫落，籽粒干癟，甚至引起絕收[2]。紅小豆銹病曾在拉丁美洲、澳大利亞、中國和美國等國家和地區(qū)有過大的流行和危害，給紅小豆生產(chǎn)帶來嚴重損失。Lingdren等[3]研究表明，豆類銹病在田間發(fā)生時，嚴重度每升高1%，則因銹病導致的產(chǎn)量損失就相應提高19 kg·hm-2。銹菌的主要無性孢子形態(tài)為夏孢子，紅小豆銹病菌夏孢子重復侵染是紅小豆銹病大面積發(fā)生的主要原因。夏孢子的萌發(fā)是銹病菌入侵寄主的第一步。目前，對于銹病菌夏孢子萌發(fā)的研究較多，其中包括小麥條銹菌[4]、小麥葉銹菌[5]、向日葵銹病菌[6]、葡萄銹菌[7]等，但是關(guān)于紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)條件的研究至今仍未見報道。明確紅小豆銹病菌夏孢子適宜的萌發(fā)條件，對田間防治紅小豆銹病具有重要意義。傳統(tǒng)銹病菌夏孢子萌發(fā)方法多采用水瓊脂平板法、孢子懸滴法、水培法等[8]，但何種方法培養(yǎng)適宜紅小豆銹病菌夏孢子的萌發(fā)目前尚不明確。

因此，研究綜合比較了三種常用培養(yǎng)方法的優(yōu)劣，為掌握適用于不同試驗目的的夏孢子萌發(fā)方法提供參考。在此基礎(chǔ)上，探索了影響紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)的環(huán)境因素，包括溫度、光照、儲存條件及儲存時間，為進一步明確紅小豆銹病的侵染循環(huán)及病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及品種

供試紅小豆銹病菌菌株由研究小組于2013年在黑龍江省大慶市林甸縣花園鄉(xiāng)采集，并分離保存的單夏孢子純培養(yǎng)物，鑒定并命名為ZXL01[1]。紅小豆品種“寶清紅”由寶清縣種子管理站提供。

將感病紅小豆品種“寶清紅”種植在直徑15 cm的花盆內(nèi)，置于25℃，光照16 h溫室內(nèi)培養(yǎng)，當真葉展開度達70%左右時，采取涂抹法接種夏孢子[1]，并于20℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，之后移與溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，接種后14 d收集新鮮夏孢子備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 夏孢子萌發(fā)最適培養(yǎng)方法的篩選

試驗選取水瓊脂平板法、水培法、孢子懸滴法等三個方法進行夏孢子萌發(fā)試驗。收集到的新鮮夏孢子用無菌水（添加0.05%吐溫20）配置成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×105個·mL-1備用。

水瓊脂平板法：將濃度為1.5%的水瓊脂培養(yǎng)基融化，制成厚度約2 mm的平板，用無菌刀片切下面積約為1.0 cm×1.0 cm的水瓊脂薄膜放于無菌載玻片上，將收集到的新鮮夏孢子均勻抖落在瓊脂薄膜上，為了保持濕度，在培養(yǎng)皿中鋪好已潤濕濾紙，并放入兩根玻璃彎管，將載玻片倒放在玻璃彎管上，蓋上皿蓋。

孢子懸滴法：用移液槍吸取少量已配置好的孢子懸浮液滴于凹玻片上，為了保持濕度，同樣，將凹玻片倒放在玻璃彎管上，置于已鋪好潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋。

水培法：將5 mL配置好的孢子懸浮液加入在9 cm培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋。

以上三種處理均用parafilm封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，分別在2、4、6、9、12、24 h時，觀察夏孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.2.2 溫度對夏孢子萌發(fā)的影響

采用水瓊脂平板法將夏孢子分別置于5、10、15、20、25、30、35℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，6 h后觀察夏孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.2.3 光照對夏孢子萌發(fā)的影響

采用水瓊脂平板法將夏孢子分別置于全黑暗、全光照、光暗交替（3 h L∶3 h D）的20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后觀察夏孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.2.4 儲存條件及儲存時間對夏孢子萌發(fā)的影響

收集到的新鮮夏孢子用真空干燥器（干燥劑為變色硅膠）進行干燥，之后將干燥后的夏孢子放入10 mm×75 mm試管中，用parafilm封口膜將管口密封，并將密封好的試管分別儲存在4℃、-20℃條件下。采用水瓊脂平板法將4℃、-20℃條件下的分別儲存5、10、20、40、60、90、120、180、360 d的夏孢子置于20℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，6 h后觀察夏孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計與分析

當芽管長度達到夏孢子直徑的一半時計為萌發(fā)[8]，采用Olympus BX60光學顯微鏡觀察并記錄夏孢子萌發(fā)情況，每個處理重復觀察三次，每個重復觀察不同視野下的200個夏孢子，計算萌發(fā)率（萌發(fā)率=已萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子數(shù)×100%）。采用SPSS v16.0軟件對各個處理所得數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏孢子萌發(fā)最適培養(yǎng)方法的篩選

三種方法處理的紅小豆銹病菌夏孢子在20℃培養(yǎng)條件下的萌發(fā)結(jié)果如圖1所示。夏孢子在水瓊脂上2 h后即可開始萌發(fā)，萌發(fā)率為20.3%，并且隨著培養(yǎng)時間的增加，萌發(fā)率逐漸增大，在6 h時萌發(fā)率達75.0%，24 h時萌發(fā)率達77.3%，并且6、9、12和24 h萌發(fā)率差異不顯著，說明夏孢子在水瓊脂上6 h后即可大量萌發(fā)（圖2A），并且在水瓊脂上觀察到的夏孢子萌發(fā)產(chǎn)生雙芽管（圖2B）。以懸滴法和水培法培養(yǎng)的夏孢子在2 h后雖然也可萌發(fā)，但是萌發(fā)率顯著低于瓊脂平板法，萌發(fā)率分別為12.0%和1.3%，同樣，2種處理下的夏孢子在6 h時基本上也已全部萌發(fā)，萌發(fā)率分別為32.0%和52.7%，顯著低于瓊脂平板法，懸滴法培養(yǎng)的夏孢子萌發(fā)率最低（圖2C），水培法培養(yǎng)的夏孢子萌發(fā)時，隨著芽管的伸長，孢子內(nèi)部逐漸變透明，孢子顏色逐漸變淺（圖2D）。鑒于紅小豆銹病菌夏孢子在水瓊脂上萌發(fā)率最高，6 h后萌發(fā)率趨于穩(wěn)定。因此，后續(xù)試驗均采用水瓊脂平板、培養(yǎng)6 h的方法評價不同因素對夏孢子萌發(fā)的影響。

圖1 不同培養(yǎng)方法的紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)率Fig.1Germination rate of different culture methods on the germination of urediniospores of Uromyces vignae

圖2 不同方法培養(yǎng)6 h時紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)形態(tài)Fig.2Forms of germinated urediniospores of Uromyces vignae on different methods at culture 6 hours

2.2 溫度對夏孢子萌發(fā)的影響

如圖3所示，在不同溫度條件下，紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)率存在顯著差異。夏孢子在5℃和35℃時未見萌發(fā)，其余處理下均可萌發(fā)，其中適宜萌發(fā)溫度為15～25℃，最適萌發(fā)溫度為20℃，培養(yǎng)6 h時萌發(fā)率達73.7%。隨著培養(yǎng)溫度的升高，夏孢子萌發(fā)率逐漸降低，溫度達到30℃時，夏孢子的萌發(fā)率僅為3.3%。

2.3 光照條件對夏孢子萌發(fā)的影響

光照條件對紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)影響較大（圖4），夏孢子在全黑暗條件下培養(yǎng)6 h后萌發(fā)率高達71.7%，而在全光照條件下的萌發(fā)率為5.0%，3 h光照和3 h黑暗交替條件下的萌發(fā)率為13.3%。表明光照可以抑制夏孢子萌發(fā)，黑暗條件下有利于夏孢子萌發(fā)。

圖3 不同溫度培養(yǎng)6 h時紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)率Fig.3Germination rate of urediniospores of Uromyces vignae on different temperature at culture 6 hours

圖4 不同光照條件培養(yǎng)6 h時紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)率Fig.4Germination rate of urediniospores of Uromyces vignae on different light conditions at culture 6 hours

2.4 儲存條件及時間對夏孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，夏孢子在4℃和-20℃條件下，隨著儲存時間的延長，夏孢子萌發(fā)率逐漸降低（表1）。夏孢子在4℃條件下儲存360 d時，培養(yǎng)6 h時的萌發(fā)率為1.3%，基本已喪失萌發(fā)活力，而-20℃條件下儲存360 d的夏孢子在培養(yǎng)6 h時萌發(fā)率為12.3%，明顯高于4℃條件（表1），表明夏孢子可在-20℃條件下可保存360 d而不喪失萌發(fā)活力。

表1 儲存條件和時間對豇豆單胞銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Table 1Effects of storage conditions and time on the germination of urediniospores of Uromyces vignae

3 結(jié)論與討論

通過對三種夏孢子萌發(fā)方法作了綜合比較，可知紅小豆銹病菌夏孢子在水瓊脂上培養(yǎng)時萌發(fā)效果最好，培養(yǎng)2 h后即可萌發(fā)，6 h后夏孢子大量萌發(fā)，萌發(fā)率達到75.0%。而且研究還發(fā)現(xiàn)夏孢子在水瓊脂上萌發(fā)可產(chǎn)生雙芽管，該結(jié)果與向日葵銹病菌夏孢子萌發(fā)現(xiàn)象一致[6]。但是采用水瓊脂平板法培養(yǎng)夏孢子時，夏孢子產(chǎn)生的芽管易深入瓊脂內(nèi)，導致萌發(fā)的孢子及芽管不利于收集，如果需要以芽管為材料進行分子生物學研究，可采用水培法進行夏孢子萌發(fā)實驗，水培法培養(yǎng)夏孢子時可收集大量純凈的芽管。

溫度是影響真菌孢子萌發(fā)最重要的因素[8]，紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)適宜溫度為15～25℃，最適溫度為20℃，與小麥葉銹菌[5]和落葉松-楊柵銹菌[9]夏孢子最適萌發(fā)溫度的研究結(jié)果一致。有研究表明，連續(xù)光照對小麥桿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響不大[10]，但研究結(jié)果表明紅小豆銹病菌夏孢子在全光照條件下培養(yǎng)6 h后萌發(fā)率僅為5.0%，而在全黑暗條件下萌發(fā)率可達71.7%。紅小豆銹病菌夏孢子在4℃和-20℃條件下隨著儲存時間的增長，孢子萌發(fā)率逐漸降低，這與胡文婕等[6]關(guān)于向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件的研究結(jié)論一致。使用新鮮的孢子進行生物測定可以確保較高的萌發(fā)率[11]，而研究發(fā)現(xiàn)夏孢子在-20℃條件下儲存360 d后，萌發(fā)率還可達到12.3%。因此，紅小豆銹病菌夏孢子應選擇在較低溫度條件下儲存，低溫條件可使紅小豆銹病菌夏孢子在儲存360 d時還可保持萌發(fā)活力。

研究對傳統(tǒng)的夏孢子萌發(fā)方法作了綜合比較，掌握了適用于不同研究目的的夏孢子萌發(fā)方法，并明確了紅小豆銹病菌夏孢子萌發(fā)的基本條件，為進一步研究紅小豆銹病菌的侵染循環(huán)及病害可持續(xù)控制奠定基礎(chǔ)。

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Study on Germination Conditions of the Urediospores of Uromyces vignae

Han Dong1，Zhang Hongchen2，Ke Xiwang1，Zuo Yuhu1
（1.College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319;2.Seed Management Station of Baoqing County）

Uromyces vignaewas the pathogen which caused adzuki bean rust.In order to clarify the urediospores germination conditions ofUromyces vignae，urediospores of theUromyces vignaefungus ZXL01 were used to determine the effects on the germination of culture methods，temperature，light，storage conditions and storage time.Results showed that the optimum method was cultured on agar plate，and the urediospores germinate initially within 2 hours.The germination rate was gradually increased and stabilized around of 75.0%until 6 hours after inoculation.The suitable temperature for urediospores germination ranged from 15℃to 25℃，and the optimal temperature was around 20℃.Light had inhibitive effect on urediospores germination.It was ascertained that the urediniospores had lost their germination abilities after stored for 360 days at 4℃，but could still germinate at-20℃.

adzuki bean rust;Uromyces vignae;urediospores;germination conditions

S435.21

A

1002-2090（2017）04-0011-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.003

2016-12-17

國家科技支撐計劃項目子項目（2104BAD07B05-06）；黑龍江省科技廳項（2014BAD07B05-H08）；學成、引進人才科研啟動計劃（XYB2014-14、XYB2014-09）。

韓冬（1991-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院2014級碩士研究生。

左豫虎，男，教授，博士研究生導師，E-mail：zuoyuhu@byau.edu.cn。