魏姍，谷城，李春秋，邊秀東，孫筱鏇，郜洪泉，邢宇昕，張鵬宇，張立春，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛冠狀病毒HE基因的克隆及進(jìn)化樹分析

魏姍，谷城，李春秋，邊秀東，孫筱鏇，郜洪泉，邢宇昕，張鵬宇，張立春，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

為研究牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus，BCV）HE基因進(jìn)化關(guān)系，試驗(yàn)利用提取牛冠狀病毒核酸，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板擴(kuò)增出全長為1 300 bp HE基因片段，將其與pMD-18T載體連接，產(chǎn)物克隆入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測序，結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的14株BCV的HE基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。擴(kuò)增出的牛冠狀病毒HE基因序列（HLJ-14），符合HE基因型參照序列特點(diǎn)，與GenBank中已發(fā)表的另外14株BCV HE基因型全序列同源性為97.3%～98.8%。

牛冠狀病毒；HE基因；克隆；進(jìn)化樹

牛冠狀病毒屬于尼多病毒目（Nidovirales），冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）[1-2]，又稱日冕病毒[3]。該病毒為多形性球形粒子，直徑70～120 nm（平均100 nm），不分節(jié)段的單股正鏈RNA[4]，有囊膜，外周鑲嵌著12～24 nm的突起，突起末端呈球狀或花瓣?duì)睿?guī)則地排列成皇冠狀[5]。自1973年美國Mebus等人首次報(bào)道該病原以來，隨后證明BCV在世界范圍內(nèi)廣泛分布[6]，在許多國家和地區(qū)牛群中流行[3]。1987年，國內(nèi)有學(xué)者報(bào)道在我國牛群中也流行該病[5]。該病在犢牛和成年牛中均可流行，且無季節(jié)性。對于我國而言，隨著近年來養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展，牛病毒性腹瀉的發(fā)病率呈上升趨勢，死亡率較高，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。實(shí)驗(yàn)室于2014年6月從黑龍江省某集約化奶牛場采集因腹瀉、脫水死亡的犢牛小腸樣本，分離出牛冠狀病毒，并對其進(jìn)行了HE基因的克隆和序列分析，以便了解黑龍江省牛冠狀病毒的變異和進(jìn)化情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2014年6月，樣品采集自黑龍江省某集約化奶牛場生前有腹瀉癥狀的病死犢牛的小腸部分，在-20℃條件下保存送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上發(fā)表的BCV毒株HE基因核苷酸序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：bCoHE-F（上游引物）：5' AAGAAGACTAAACTCA GTGAAAATG 3'，bCoHE-R（下游引物）：5' CATGTTTAGATTATGGTCTAAGCAT 3'。退火溫度50℃，擴(kuò)增長度1 300 bp。

1.1.3 生化試劑及試劑盒

2×Premix PCR Taq、6×DNA Loading Buffer、RTPCR試劑盒、DNA Marker（2 000）、pMD-18T載體購自TaKaRa公司，蛋白酶K購自德國Merck公司，瓊脂糖購自O(shè)XOID公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Solarbio公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

電泳緩沖液，氨芐青霉素，IPTG，氨芐青霉素LB平板，SOB培養(yǎng)基，含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，質(zhì)粒提取溶液（SolutionⅠ，SolutionⅡ，SolutionⅢ），瓊脂糖，DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臨床病料樣品處理與RNA提取

將臨床采集到的犢牛小腸病料剪下一小塊充分研磨，與PBS（PH值為7.2）進(jìn)行1∶500稀釋，4 200×g 10 min離心，取上清液，進(jìn)行0.22 μm微孔濾器過濾，收集濾液保存在-20℃冰箱備用。參照病毒基因組RNA快速提取試劑盒說明書提取臨床樣品的基因組RNA。

1.2.2 RT-PCR及鑒定

以提取的臨床樣品基因組RNA為模板，參照RT-PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行鑒定。RT-PCR反應(yīng)體系如下：MgCl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，RNase Free dH2O 2.75 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，R-Primer 1 μL，Positive Control RNA 1.5 μL，5×Buffer10 μL，H2O 28.75 μL，Ex Tap HS 0.25 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。30℃10 min，50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。

1.2.3 目的基因膠回收

參照膠回收試劑盒將剩余RT-PCR產(chǎn)物回收。

1.2.4 目的基因的克隆

將目的基因連接到PMD-18T載體。在16℃條件下，16 h后獲得連接產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α， 37℃培養(yǎng)16 h。

1.2.5 菌落PCR與測序

以單菌落為模板進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，測序。菌落PCR反應(yīng)體系如下：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板1 μL，2×Pre mix Taq酶12.5 μL，加去離子水補(bǔ)至25 μL。

1.2.6 比對分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

將HE基因的序列命名并與GenBank上已發(fā)表參考株的HE序列用DNAMAN及Clustal X軟件進(jìn)行分析比對，以比較核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），已發(fā)表的15個(gè)參考株的HE序列序列獲取號如下：

2 結(jié)果

2.1 HE基因的擴(kuò)增

病料用特異性下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳，可以獲得預(yù)期大小的片段（見圖1）。

圖1 HE基因的擴(kuò)增Fig.1Amplification of HE gene

2.2 測序結(jié)果

經(jīng)博仕生物公司測定，牛冠狀病毒HE基因的核苷酸序列長度為1 300 bp，現(xiàn)已將序列提交到Gen－Bank，登錄號：KM985632。

2.3 同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、分析

用MEGA 4軟件將其與加拿大（登錄號：AF230528，AF239308S1），美國（登錄號：AF391542，AF391541，AF058944，EF424617），韓國（登錄號：EU401976，DQ016118S1，HM573325，HM573321），意大利（登錄號：EU019216，EF445634），香港（登錄號：KF906250），日本（登錄號：AB354579）共14種已發(fā)表的參考株的HE基因進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2、3。

圖2 牛冠狀病毒HE基因的同源性比較Fig.2Homology comparison of bovine coronavirus HE gene

圖3 牛冠狀病毒HE基因的進(jìn)化樹Fig.3The evolutionary tree of bovine coronavirus HE gene

3 討論

牛冠狀病毒主要感染牛和水牛，人也可以發(fā)病，乳用犢牛感染多見于1～90日齡，腹瀉常發(fā)生于7～10日齡內(nèi)，腸炎的嚴(yán)重程度與犢牛的日齡、免疫狀況、病毒毒株和感染劑量有關(guān)[9]。飼養(yǎng)管理差、寒冷、潮濕等可促進(jìn)本病的發(fā)生[9]。病毒侵入宿主體內(nèi)，首先感染小腸近側(cè)端，然后向下擴(kuò)散至整個(gè)小腸和大腸，腸黏膜上皮發(fā)生死亡、脫落[5]。組織學(xué)檢查可見小腸絨毛縮短，結(jié)腸的上皮細(xì)胞由正方形變成短柱形[9]。進(jìn)行免疫熒光檢測，可在腸黏膜上腸腺的上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有冠狀病毒熒光[9]。消化道和呼吸道是本病的主要傳播途徑。根據(jù)感染部位和臨床癥狀的不同，BCV可分為牛腸道冠狀病毒（BECV）和牛呼吸道冠狀病毒（BRCV）[10]。病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原微生物感染或飼料管理、營養(yǎng)、環(huán)境變化等多種因素均能引起牛腹瀉性疾病，在諸多因素中病毒性病原微生物感染是引起牛腹瀉的重要因素，造成的危害也最為嚴(yán)重[11]，常見疾病如新生犢牛腹瀉（CD）和成年牛冬季血?。╓D）等[5]。

實(shí)驗(yàn)室采自的牧場，牛群狀況如下：0～2月齡犢牛發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，糞便呈膠凍樣，糞便中有脫落的消化道黏膜，犢牛精神沉郁，躺臥不起，有嚴(yán)重的脫水現(xiàn)象；剖檢見小腸腸道出血，腸壁變薄。0～2月齡犢牛共有50頭，發(fā)病43頭（發(fā)病率86%），死亡39頭（病死率90.7%）（26 heifers，13bulls），存活4頭。樣品采自發(fā)病剖檢牛小腸部分，檢測結(jié)果顯示是牛冠狀病毒單一感染，排除牛輪狀病毒、牛腸道病毒和牛病毒性腹瀉的感染。通過對牛冠狀病毒黑龍江毒株HLJ-14的HE基因的克隆與測序，表明基因組全長為1 300 bp，且其全序列符合HE基因型參照序列特點(diǎn)，與GenBank中已發(fā)表的另外14株BCV HE基因型全序列同源性為97.3%～98.8%。進(jìn)一步序列測序與比較，制成進(jìn)化樹（圖3）。進(jìn)化樹中將15株牛冠狀病毒HE基因分為三大組，來自香港1株（KF906250）及日本1株（AB354579）為第一組（Ⅰ），來自意大利的兩株（EU019216和EF445634）為第二組（Ⅱ），其他的11株為第三組（Ⅲ）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第一組中，來自香港的KF906250與來自日本的AB354579分屬進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。在第二組中，來自意大利的兩組毒株EF445634和EU019216分屬進(jìn)化距離最近。在第三組中，來自中國的KM985632與來自韓國的HM573325，HM573321，EU401976和DQ016118S1分屬進(jìn)化距離較近；來自加拿大的AF230528和AF239308S1分屬進(jìn)化距離近，其次是來自美國的AF391542，之后是來自美國的AF391541和EF424617，但與AF058944（美國）稍遠(yuǎn)。這說明各個(gè)國家牛的來源不同，其病毒的傳入與遷移也不同，病毒在具有不同遺傳和免疫特質(zhì)的宿主中的長期選擇是形成BCV同一基因型病毒進(jìn)化基因不同的原因之一。隨著新型冠狀病毒的不斷出現(xiàn)，弄清病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)在研究病毒進(jìn)化過程中有巨大作用，而蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由對應(yīng)基因所編碼的，所以對血凝素酯酶蛋白（HE基因）的研究在冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查中有重要意義。

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Cloning and Analysis of the Evolutionary Tree’s of Bovine Coronavirus HE Gene

Wei Shan，Gu Cheng，Li Chunqiu，Bian Xiudong，Sun Xiaoxuan，Gao Hongquan，Xing Yuxin，Zhang Pengyu，Zhang Lichun，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The bovine coronavirus nucleic acid was extracted to study the bovine coronavirus HE gene evolution.The RNA was transcribed reversely into cDNA which was amplified as a template to a length of 1 300 bp HE gene fragment，connected with pMD-18T vector，cloned into DH5α.It was sequenced and analysed the evolution tree with 14 strains BCV HE gene of the sequences published in GenBank.Amplification of bovine coronavirus HE gene sequence（HLJ-14），according with the characteristics of the HE genotype reference sequence，and GenBank had been published in the other 14 strains of BCV HE gene sequence homology of 97.3%-98.8%.

bovine coronavirus;HE gene;clone;the evolutionary tree

S435.21

A

1002-2090（2017）04-0020-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.005

2016-12-15

黑龍江省高校新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（1252-NCET-016）。

魏姍（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2015級碩士研究生。

孫東波，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：dongbosun@126.com。