常曉翠，范威鋒，沈歡歡，黃向月，王升，王媛，冉偉，孫可新，姜楠，孔凡志

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市人民醫(yī)院檢驗科）

Chang Xiaocui1，F(xiàn)an Weifeng1，Shen Huanhuan1，Huang Xiangyue1，Wang Sheng1，Wang Yuan1，Ran Wei1，Sun Kexin1，Jiang Nan2，Kong Fanzhi1

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Laboratory Department，People’s Hospital of Daqing）

氯化鈷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞低氧應(yīng)激模型的建立

常曉翠1，范威鋒1，沈歡歡1，黃向月1，王升1，王媛1，冉偉1，孫可新1，姜楠2，孔凡志1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市人民醫(yī)院檢驗科）

探索氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系HepG2建立低氧應(yīng)激模型的條件，并評價該模型。不同濃度氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后，PCR法檢測低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、腺苷酸激酶4（AK4）基因的表達(dá)；細(xì)胞計數(shù)法繪制對照組細(xì)胞和氯化鈷處理組細(xì)胞的增殖曲線。隨著CoCl2濃度升高和處理時間的延長，HIF-1α mRNA和ATF4 mRNA表達(dá)顯著升高、AK4 mRNA表達(dá)顯著下降、HepG2細(xì)胞增殖速度顯著下降（P＜0.05）、細(xì)胞膜不完整邊界不清。氯化鈷化學(xué)模擬低氧過程中影響了缺氧主要調(diào)節(jié)因子HIF-1α的水平，因此以氯化鈷用于構(gòu)建模擬HepG2細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)模型是可行的，ATF4和AK4可能在參與HepG2細(xì)胞抗低氧應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。此模型的建立為進(jìn)一步研究AK4基因的生理學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

氯化鈷；低氧應(yīng)激；腺苷酸激酶；低氧誘導(dǎo)因子

應(yīng)激最早是由匈牙利科學(xué)家Hans Selye在1946年提出。應(yīng)激因素多種多樣，可概括為環(huán)境因素和心理因素：前者又包括物理、化學(xué)以及生物等諸因素，后者主要指源于社會和生命個體的心理壓力。低氧應(yīng)激屬于環(huán)境因素引起的應(yīng)激，當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時引起人們出現(xiàn)多種反應(yīng)如頭昏、心悸、氣短、食欲下降等癥狀[1]。研究結(jié)果表明，低氧應(yīng)激引發(fā)的應(yīng)答反應(yīng)是全身性的，最終導(dǎo)致細(xì)胞和分子水平的變化。低氧是惡性腫瘤微環(huán)境的特征之一。它是癌細(xì)胞快速增殖與血液供應(yīng)相對滯后的結(jié)果。低氧對細(xì)胞的影響主要通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)而實現(xiàn)，作為低氧環(huán)境調(diào)控的主要核轉(zhuǎn)錄因子-缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）[2-4]，能介導(dǎo)多種促癌基因和抑癌基因的表達(dá)改變，從而對腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等起到重要作用[5]。低氧應(yīng)答基因腺苷酸激酶4（AK4）的表達(dá)很可能與細(xì)胞抵抗低氧應(yīng)激帶來的危害有關(guān)[6-8]。激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）可以結(jié)合在AK4基因啟動子區(qū)的低氧調(diào)節(jié)原件（HRE）調(diào)控其表達(dá)。氯化鈷（CoCl2）是一種化學(xué)性缺氧模擬劑，能在體外誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生缺氧性損傷[9-11]。氯化鈷模擬低氧應(yīng)激模型的建立，尚未見報道。因此，建立體外細(xì)胞培養(yǎng)的低氧應(yīng)激模型為將來揭示低氧應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及最終揭示低氧應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株（HepG2）由哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李鈺教授惠贈，HepG2細(xì)胞株分組孵育A：常氧組；B：300 μmol·L-1氯化鈷處理組；C：400 μmol·L-1氯化鈷處理組。細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)于5%CO2、95%空氣、37℃孵箱中，待其2～3 d貼壁生長至70%～80%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2 主要試劑和儀器

氯化鈷（CoCl2）（31277）購自美國Sigma公司；PCR相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（639505）購自大連TAKALA公司；Trizol（15596-026）購自美國Invetrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清（FBS）、雙抗均購自美國Hyclone公司；細(xì)胞增殖檢測試劑盒（C0036）購自中國碧云天公司。主要儀器：美國Thermo Forma公司CO2培養(yǎng)箱；德國Eppendorf公司5417R臺式離心機(jī)、5415R冷凍離心機(jī)；日本OLYMPUS CK40倒置顯微鏡。

1.3 引物

表1 PCR反應(yīng)引物Table 1Primers in PCR reaction

1.4 PCR基本過程

首先使用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量后，使用1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA后進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系（25 μL）入下：

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2PCR reaction system

PCR反應(yīng)條件：

1.5 細(xì)胞增殖曲線的繪制

接種HepG2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（2 000個·孔-1），將細(xì)胞分為A，B，C三組，分別培養(yǎng)12，24，36，48，60，72 h后加入20 μL WST-1溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，待培養(yǎng)液顏色變化后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后HIF-1α、ATF4和AK4的表達(dá)

2.1.1 300 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后HIF-1α、ATF4和AK4的表達(dá)

圖1A為300 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后，提取細(xì)胞總RNA的凝膠電泳圖，N為對照組細(xì)胞（沒有經(jīng)過氯化鈷處理），所有樣品的5，18，28 s RNA條帶清晰，沒有降解，可以用于反轉(zhuǎn)錄。圖1B為使用圖1A中RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR后的結(jié)果，隨著氯化鈷刺激時間的增加，HIF-1α表達(dá)量明顯上升，ATF4和AK4表達(dá)量出現(xiàn)了明顯下降，Nu為陰性對照組（PCR反應(yīng)體系中不含模板）。

圖1 A：300 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后總RNA凝膠電泳結(jié)果圖；B：300 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后HIF-1α、ATF4和AK4表達(dá)變化圖。Fig.1A：Total RNA from 300 μmol·L-1CoCl2treated HepG2 cells；B：Expression of HIF-1α，ATF4 and AK4 in HepG2 cells after cobalt dichloride treatment at different time point.

2.1.2 400 μmol·L-1氯化鈷處理處理HepG2細(xì)胞后HIF-1 α、ATF4和AK4的表達(dá)

圖2A為400 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后，提取細(xì)胞總RNA的凝膠電泳圖，N為對照組細(xì)胞（沒有經(jīng)過氯化鈷處理），所有樣品的5，18， 28 s RNA條帶清晰，沒有降解，可以用于反轉(zhuǎn)錄。圖2B為使用圖2A中RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR后的結(jié)果，隨著氯化鈷刺激時間的增加，HIF-1α表達(dá)量明顯上升，ATF4和AK4表達(dá)量出現(xiàn)了明顯下降，Nu為陰性對照組（PCR反應(yīng)體系中不含模板）。

圖2 A：400 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后總RNA凝膠電泳結(jié)果圖；B：400 μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞不同時間后HIF-1α、ATF4和AK4表達(dá)變化圖。Fig.2A：Total RNA from 400 μmol·L-1CoCl2treated HepG2 cells；B：Expression of HIF-1α，ATF4 and AK4 in HepG2 cells after 400 μmol·L-1CoCl2treatment at different time point.

2.2 不同濃度氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后對細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 300 μmol·L-1氯化鈷處理處理HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞增殖情況

圖3為使用WST-1試劑盒檢測得到的300μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞增殖結(jié)果，從氯化鈷處理12小時開始，細(xì)胞增殖速度就開始降低，處理48小時后，細(xì)胞增殖速度顯著降低（P＜0.05），96小時后細(xì)胞增殖速度極顯著降低（P＜0.01）。

2.2.2 400 μmol·L-1氯化鈷處理處理HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞增殖情況

圖4為使用WST-1試劑盒檢測得到的400μmol·L-1氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞增殖結(jié)果，從氯化鈷處理12小時開始，細(xì)胞增殖速度就開始降低，處理36小時后，細(xì)胞增殖速度顯著降低（P＜0.05），48、60小時后細(xì)胞增殖速度極顯著降低（P＜0.01），處理72小時后，細(xì)胞停止增殖并出現(xiàn)死亡。

2.3 不同濃度氯化鈷處理HepG2細(xì)胞后對細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5為300 μmol·L-1氯化鈷和400 μmol·L-1氯化鈷分別處理HepG2細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)變化，300 μmol·L-1氯化鈷處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞密度較對照組細(xì)胞減小，并且出現(xiàn)部分死亡細(xì)胞，細(xì)胞膜邊界模糊、不完整。400 μmol·L-1氯化鈷處理細(xì)胞48小時后，死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞皺縮體積變小，細(xì)胞膜邊界模糊、不完整。

圖3 300μmol·L-1氯化鈷處理HepG2后的細(xì)胞增殖結(jié)果，在48 h，60 h兩個時間點上氯化鈷處理組細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖出現(xiàn)顯著差異，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.3Cell proliferation rate was significantly decreased at 48 h and 60 h of 300 μmol·L-1CoCl2treated，*P＜0.05，**P＜0.01

圖4 400μmol·L-1氯化鈷處理HepG2后的細(xì)胞增殖結(jié)果，在36 h，48 h，60 h三個時間點上氯化鈷處理組細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖出現(xiàn)顯著差異，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.4Cell proliferation rate was significantly decreased at36 h，48 h and 60 h of 400 μmol·L-1CoCl2treated，*P＜0.05，**P＜0.01

圖5 不同濃度氯化鈷處理HepG2細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化（100×）Fig.5Changes of cell morphology after different concentration of CoCl2treatment over 48 hours（100×）

3 討論

氯化鈷作為化學(xué)性缺氧模擬劑，其機(jī)制是鈷通過細(xì)胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活，從而抑制細(xì)胞對氧的利用，最終達(dá)到常氧下誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧的效果。以往研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈷可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)性缺氧損傷，但不同細(xì)胞對氯化鈷誘導(dǎo)缺氧的敏感性有所不同。氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生缺氧損傷的機(jī)制可能涉及多個方面。以往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是氯化鈷誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生缺氧損傷的主要機(jī)制之一。通過熒光染色發(fā)現(xiàn)，氯化鈷處理后，PC12細(xì)胞、肺癌A549等細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮深染或碎片樣深染凋亡小體，呈現(xiàn)典型凋亡特征[12-13]。因此，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生缺氧損傷的另一機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞本身就處于缺氧的微環(huán)境中，有研究者已經(jīng)檢測到HIF-1α蛋白在多種腫瘤及癌前病變組織中高表達(dá)，表明HIF-1α可參與腫瘤低氧適應(yīng)性反應(yīng)，從而引起腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性的改變[14]。目前，已發(fā)現(xiàn)HIF-1α約有100多種目的基因，其中與腫瘤有關(guān)的包括腫瘤干細(xì)胞維持[15]、細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)因子、內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換[16]、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移及放療抵抗等相關(guān)基因。吳之浩[17]研究表明，低氧應(yīng)激上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子、甲胎蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá)，下調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑基因表達(dá)。這些基因表達(dá)的改變使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對放化療不敏感等。

在低氧時，細(xì)胞本身有一套系統(tǒng)會開啟并高效地表達(dá)和/或激活一組相關(guān)的基因去應(yīng)對這種低氧引起的應(yīng)激反應(yīng)。各種應(yīng)激原對細(xì)胞作用后的最終靶分子是細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA。細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后的最終效應(yīng)主要分為兩個方面：（1）細(xì)胞能夠抵抗應(yīng)激原的刺激而繼續(xù)存活；（2）細(xì)胞無法修復(fù)由應(yīng)激原造成的損傷而最終發(fā)生凋亡。

4 結(jié)論

研究觀察氯化鈷對HepG2細(xì)胞HIF-1α、AK4、ATF4的表達(dá)變化，結(jié)果顯示與對照組比較，經(jīng)氯化鈷處理的細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，而AK4和ATF4表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞增殖速度顯著下降，且細(xì)胞增殖速度均隨氯化鈷濃度增加和時間延長而逐漸降低。氯化鈷化學(xué)模擬低氧過程中伴隨著對細(xì)胞增殖和凋亡的復(fù)雜影響，也影響缺氧主要調(diào)節(jié)因子HIF-1 α水平，因此以氯化鈷用于構(gòu)建模擬HepG2細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)模型是可行的。

［1］呂永達(dá).高原醫(yī)學(xué)與生理學(xué)［M］.天津.天津科技翻譯出版公司，1995.

［2］Gregg L.Hypoxia-Inducible Factor 1（HIF-1）Pathway［J］. Sci STKE，2007，407：8.

［3］Gregg L.Life with Oxygen［J］.Science，2007，318（5847）：62-64.

［4］Gregg L.Mitochondrial autophagy：life and breath of the cell［J］.Autophagy，2008（4）：534-536.

［5］Kizaka-Kondoh，Tanaka，Harada H，et al.The HIF-1-active microenvironment：an environmental target for cancer therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009（61）：623-632.

［6］Kong F，Binas B，Moon J，et al.Differential expression of adenylate kinase 4 in the context of disparate stress response strategies of HEK293 and HepG2 cells［J］.Arch Biochem Biophys，2013，533：11-17.

［7］Liu R，Stro¨m A，Zhai J，et al.Enzymatically inactive adenylatekinase 4 interacts with mitochondrial ADP/ATP translocase［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（6）：1371-1380.

［8］孔凡志，沈歡歡，姜楠，等.腺苷酸激酶的研究進(jìn)展［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2016，28（2）：37-44.

［9］Xiao L，Lan A，Mo L，et al.Hydrogen sulfide protects PC12 cells against reactive oxygen species and extracellular signal-regulated kinase 1/2-mediated downregulation of glutamate transporter-1 expression induced by chemical hypoxia［J］.Int J Mol Med，2012，30（5）：1126-1132.

［10］廖新學(xué)，楊春濤，楊戰(zhàn)利，等.硫化氫對抗化學(xué)性缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷及其機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（8）：1012-1017.

［11］Ji Q，Yang L，Zhou J，et al.Protective effects of paeoniflorin against cobalt chloride-induced apoptosis of endothelial cells via HIF-1alpha pathway［J］.Toxicol In Vitro，2012，26（3）：455-461.

［12］陳健，仇容，畢艷麗，等.二氯化鈷誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（3）：58-61.

［13］Chen J，Zhao T，Huang D.Protective effects of edaravone a-gainst cobalt chloride-induced apoptosis in PC12 cells［J］.Neurosci Bull，2009，25（2）：67-74.

［14］Ellis L，Hammers H，Pili R.Targeting tumor angiogenesis with histone deacetylase inhibitorsv［J］.Cancer Lett，2009，280（2）：145-153.

［15］Wang Y，Liu Y，Malek S，et al.Targeting HIF-1α eliminatescancer stem cells in hematological malignancies［J］. Cell Stem Cell，2011（4）：399-411.

［16］Mark P，Leav I，Pursell B，et al.ERbeta impedes prost atecancer EMT by destabilizing HIF-1α and inhibiting VEGF mediated snail nuclear localization：implications for Gleason grading［J］.Cancer Cell，2010，17（4）：319-332.

［17］吳之浩.低氧應(yīng)激對人肝癌細(xì)胞AFP，VEGF，TIMP-1，MMP-9表達(dá)的影響［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，42（1）：41-43.

Establishment of Hypoxia Stress Model Using Cobalt Dichloride in HepG2 Cells

To find a proper condition to establish hypoxia stress model using cobalt dichloride in HepG2 cells and evaluate it.After using different concentration of CoCl2to treat HepG2 cells，expression of AK4，ATF4 and HIF-1α was detected by PCR；compare cell proliferation rate by cell counting.With the increase of CoCl2，the expression of HIF-1α mRNA and ATF4 mRNA were both increased，however，AK4 mRNA were decreased significantly；cell proliferation rate was decreased significantly（P＜0.05）and the membrane was broken.The expression of HIF-1α，which was the most important transcription factor in hypoxia stress，were increased in HepG2 cells during CoCl2treatment，so，it was feasible to establish hypoxia stress model by using CoCl2.ATF4 and AK4 may play an important role in protecting HepG2 cells from hypoxia stress.Establishment of this model may lay a foundation for further research on AK4 physiology function.

cobalt dichloride；hypoxia stress；adenylate kinase；hypoxia induced factor

S852.3

A

1002-2090（2017）04-0028-05

Chang Xiaocui1，F(xiàn)an Weifeng1，Shen Huanhuan1，Huang Xiangyue1，Wang Sheng1，Wang Yuan1，Ran Wei1，Sun Kexin1，Jiang Nan2，Kong Fanzhi1

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Laboratory Department，People’s Hospital of Daqing）

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.007

2016-07-01

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目。

范威鋒（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系2013級本科生。

孔凡志，男，講師，E-mail：fanzhikong110@hotmail.com。