韋金英，史永紅，任韞卓，杜云霞，杜春陽，段惠軍，吳海江

葡萄籽原花青素對糖尿病db/db小鼠腎組織細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

韋金英，史永紅，任韞卓，杜云霞，杜春陽，段惠軍，吳海江

目的 觀察葡萄籽原花青素對Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠腎臟細(xì)胞中表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白α-SMA、E-cadherin表達(dá)的影響，旨在揭示葡萄籽原花青素對db/db小鼠糖尿病腎損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 采用Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠為研究對象，16只雄性db/db小鼠隨機(jī)分為2組：糖尿病組、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃組，每組各8只；8只相同周齡雄性db/m小鼠作為正常對照組及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治療對照組。以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，持續(xù)12周后檢測E-cadherinh、α-SMA、p38MAPK和ERK1/2的蛋白表達(dá)。結(jié)果 糖尿病組小鼠腎組織中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加，E-cadherin表達(dá)減少，尿中8-OHdG水平增加。葡萄籽原花青素能減少糖尿病組小鼠腎組織中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表達(dá)，尿中8-OHdG水平也明顯降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論 葡萄籽原花青素抑制腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)生成，可能是通過抑制活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成，抑制p38MAPK和ERK1/2信號通路激活而實(shí)現(xiàn)的。葡萄籽原花青素對糖尿病腎病具有防治作用。

糖尿病腎?。簧掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化；葡萄籽原花青素；α-SMA；E-cadherin

研究表明，db/db小鼠腎組織中系膜基質(zhì)的蓄積、小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)與活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成過多關(guān)系密切，主要表現(xiàn)在ROS對組織和細(xì)胞的毒性損傷[1-2]。另外，ROS還可作為細(xì)胞內(nèi)信使，活化許多信號傳導(dǎo)通路，間接導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷[3-4]。因此，抗氧化治療可有效減緩多種并發(fā)癥的發(fā)生[5]。本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，高糖能夠使人腎小管上皮細(xì)胞及小鼠系膜細(xì)胞中ROS增多，同時(shí)減少E-cadherin的表達(dá)；抗氧化劑NAC能夠減少高糖誘導(dǎo)的HK-2中ROS及α-SMA的過表達(dá)[6]。天然藥物葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗凋亡、降血糖、降血脂抗氧化等作用[7-8]。然而，其作用的分子機(jī)制尚未完全清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 6～8周齡健康雄性C57BL/ks db/db小鼠，體重(40.0±2.5)g。16只及雄性體重(27±1.6)g的C57BL/ks db/m對照小鼠，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。飼養(yǎng)環(huán)境為每籠8只，溫度為(22±2)℃，相對濕度為(55±2)%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)開始后，16只雄性db/db小鼠隨機(jī)分為2組：糖尿病組(db/db組)、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃組(db/db+GSPE組)，每組各8只；相同周齡雄性8只db/m小鼠作為正常對照組(db/m組)及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治療對照組(db/m+GSPE組)。db/db+GSPE組和db/m+GSPE組以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，每天灌胃1次，對照組和糖尿病組以等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)12周。1.1.2 試劑 兔抗α-SMA、E-cadherin、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK1/2和ERK1/2多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)。兔抗α-SMA和E-cadherin多克隆抗體(美國Abcam公司)。SYBR Premix Ex TaqTMII(日本Takara公司)。兔抗α-actin多克隆抗體(上海藍(lán)基生物公司)。小鼠尿8-OHdG檢測試劑盒(中國南京建成試劑公司)。引物序列由上海生工設(shè)計(jì)合成。18S引物序列：F 5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′，R 5′-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3；α-SMA引物序列：F 5′-CGCCCTCGCCACCAGATCTG-3′，R 5′-TAGCCTTCATAGATGGGGAC-3′；E-cadherin引物序列：F 5′-GCCGGAGCCCTGCCACCCTG-3′，R 5′-CTTTCTGTAGGTGGAGTCCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測小鼠尿中8-OHdG的水平 先后加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、待測樣品40 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入抗8-OHdG抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育60 min。甩去孔內(nèi)液體，震蕩洗滌5次，每次30 s。每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育10 min，避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，立即測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。結(jié)果判斷：以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度OD值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，做出相應(yīng)曲線，樣品含量根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)濃度。

1.2.2 免疫組化法檢測腎組織表型相關(guān)蛋白表達(dá) 采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測。制備腎組織石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗2次，每次5 min，切片加入抗原修復(fù)液(0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0)，采用高溫高壓抗原修復(fù)法，修復(fù)10 min，室溫下冷卻45 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清，37 ℃ 30 min封閉內(nèi)源性生物素，甩掉血清滴加兔抗E-cadherin、α-SMA多克隆抗體(1 ∶150)，4 ℃孵育過夜，次日取出切片，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，光鏡下觀察并控制顯色程度，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，陽性部位呈棕黃色，脫水透明，中性樹膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：α-SMA、E-cadherin陽性染色呈棕黃色或棕褐色，位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比制定如下判定標(biāo)準(zhǔn)：<10%陽性細(xì)胞為陰性，>10%陽性細(xì)胞為陽性。

1.2.3 Western blot法檢測p-p38、p38、p-ERK1/2和ERK1/2表達(dá) 生理鹽水清洗小鼠腎組織后研磨成勻質(zhì)，加入組織裂解液(25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)0.01 NP-40，150 mmol/L氯化鈉，質(zhì)量濃度1 g/L苯甲基磺酰氟)，冰浴2 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，Lowry法測定上清液蛋白濃度。組織裂解蛋白40 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入抗β-actin抗體(稀釋比例1 ∶1 000)、p-p38(稀釋比例1 ∶1 000)、p38(稀釋比例1 ∶1 000)、p-ERK1/2(稀釋比例1 ∶1 500)和ERK1/2(稀釋比例1 ∶2 000)抗體，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體(1 ∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h；洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影(LI.COR Gene Company,USA)。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腎皮質(zhì)中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá) 液氮研磨小鼠腎組織后Trizol法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR步驟：采用20反應(yīng)體系，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (2×) 10，ROX Reference Dye (50×)0.4，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2，上、下游引物(終濃度為1 ng/mL)各0.8，雙蒸水6。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s →95 ℃ 5 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)比較法計(jì)算基因表達(dá)相對量，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血、尿生化指標(biāo)檢測結(jié)果(表1) 與對照組相比，糖尿病組小鼠尿蛋白(Upro)及尿8-OHdG明顯升高；糖尿病db/db小鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及血中甘油三酯(TG)比對照組db/m小鼠增加(P<0.05)。給予葡萄籽原花青素治療后血中FBG、Scr、BUN、TG及尿液中8-OHdG、尿蛋白與db/db組比較含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 葡萄籽原花青素對糖尿病腎組織中α-SMA、E-cadherin表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果：db/m組中，α-SMA表達(dá)于血管壁，在腎小管細(xì)胞胞質(zhì)中有少量表達(dá)、E-cadherin在腎小管細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中大量表達(dá)；db/db組中，α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中大量表達(dá)、E-cadherin在腎小管細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中表達(dá)明顯減少(圖1)；葡萄籽原花青素灌胃組中α-SMA表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)明顯增多(圖1)。

表1 小鼠各組血、尿液生化指標(biāo)的檢測±s)

與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05，##P<0.01

ABCDα?SMAE?cadherin

圖1 小鼠腎組織中α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)變化

A.db/m組；B.db/m+GSPE組；C.db/db組；D.db/db+GSPE組

2.4 葡萄籽原花青素對腎組織p-p38MAPK和p-ERK1/2信號通路的影響 與db/m對照組比較，db/db組小鼠腎組織中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加；與db/db組小鼠比較，葡萄籽原花青素組腎組織中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)減少(P<0.05或P<0.01，圖2)

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 與db/m組比較，db/db組小鼠腎組織α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，E-cadherin表達(dá)減少；與db/db組小鼠組比較，葡萄籽原花青素組腎組織中α-SMA mRNA表達(dá)減少，E-cadherin mRNA表達(dá)增多(P<0.01或P<0.05，圖3)。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為出現(xiàn)糖尿病時(shí)，大量ROS的蓄積造成的氧化應(yīng)激狀態(tài)，參與其發(fā)生、發(fā)展。而腎小管EMT是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的主要機(jī)制之一。EMT過程中是上皮細(xì)胞失去特征性標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)獲得間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)及伴有細(xì)胞形態(tài)呈纖維細(xì)胞樣的改變[1]。其中主要包括了間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)增加、E-cadherin表達(dá)減少。研究已證實(shí)[9]，慢性高血糖狀態(tài)誘發(fā)的氧化應(yīng)激在糖尿病腎損傷過程中發(fā)揮重要作用，活性氧自由基的產(chǎn)生使腎小管上皮細(xì)胞表型改變，推動(dòng)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。因此，有效阻斷氧化應(yīng)激、尋找開發(fā)有效藥物將是防治糖尿病慢性腎病變的重要途徑。

葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的一種天然多酸類化合物，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，能有效地清除超氧陰離子和自由基，中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[10]。本組結(jié)果顯示，在12周的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，葡萄籽原花青素能夠顯著降低db/db小鼠尿中ROS(8-OHdG)的產(chǎn)生。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，給予葡萄籽原花青素治療后，小鼠α-SMA表達(dá)與糖尿病db/db組小鼠比較顯著降低，而E-cadherin表達(dá)顯著增加。提示，抗氧化劑葡萄籽原花青素可以降低db/db小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT生成，可能與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。本組的前期研究結(jié)果也表明，抗氧化劑NAC能夠減少高糖誘導(dǎo)的EMT生成，通過抑制ROS的產(chǎn)生、抑制p38MAPK和ERK1/2活化來實(shí)現(xiàn)[6]。ECM在腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)的過度沉積與糖尿病腎功能進(jìn)行性下降密切相關(guān)，腎病腎間質(zhì)損傷在糖尿病腎病進(jìn)展過程中比腎小球損傷更為嚴(yán)重，并且普遍認(rèn)為EMT可能是糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的最重要因素之一[11]。Li等[12]研究表明，葡萄籽原花青素B2能夠通過甲基轉(zhuǎn)移酶沉默或LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中ERK、GSK3β磷酸化水平降低。也有研究表明[13]，葡萄籽原花青素B2通過ERK和p38MAPK信號通路和Nrf2的易位機(jī)制，調(diào)控谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性保護(hù)結(jié)腸Caco-2細(xì)胞免受氧化損傷。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，db/db組小鼠p38MAPK與ERK1/2的磷酸化水平明顯升高，而葡萄籽原花青素組p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平降低。提示，在糖尿病db/db小鼠模型中p38MAPK、ERK信號通路參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程，而抗氧化劑葡萄籽原花青素可以抑制p38MAPK、ERK信號通路的激活。

圖2 小鼠腎組織中p-ERK1/2、ERK1/2、p38和p-p38蛋白的表達(dá)

A.電泳圖；B.直方圖；1.db/m組；2.db/m+GSPE組；3.db/db組；4.db/db+GSPE組。與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05

圖3 小鼠腎組織中α-SMA(A)和E-cadherin(B)mRNA的表達(dá)

1.db/m組；2.db/m+GSPE組；3.db/db組；4.db/db+GSPE組。與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05

葡萄籽原花青素的抗氧化活性使其可抑制高血糖、脂肪酸過氧化等過氧化應(yīng)激損傷時(shí)TNF-α、IL-1等炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，抗炎機(jī)制和清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化和減少細(xì)胞因子的生成有關(guān)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素能夠明顯減少db/db小鼠血糖，降低Scr、BUN和高脂血癥，降低db/db小鼠的尿8-OHdG水平。提示，葡萄籽原花青素治療通過抑制血糖、尿8-OHdG水平等方面發(fā)揮作用。其與當(dāng)前的研究結(jié)果相一致[8]。

總之，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄籽原花青素拮抗db/db糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT生成，可能是通過抑制ROS的產(chǎn)生及抑制p38 MAPK和ERK1/2活化實(shí)現(xiàn)的。但分子機(jī)制仍不完全清楚。

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Effect of grape seed proanthocyanidins on phenotype marker protein ofrenal cells in db/db mice

WEI Jin-ying, SHI Yong-hong, REN Yong-zhuo, DU Yun-xia, DU Chun-yang, DUAN Hui-jun, WU Hai-jiang

(DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Purpose To investigate the effect of grape seed proanthocyanidins on the phenotype-transforming marker protein expression of db/db renal cells in mice model of type 2 diabetes, and to explore the protective mechanism of grape seed extract on diabetic renal injury in db/db mice. Methods Male db/db diabetic mice were randomly divided into two groups: diabetic group (db/db group) and diabetic+grape seed proanthocyanidin extract group (db/db+GSPE). The same week-old male db/m mice was used as normal controls (db/m) and grape seed proanthocyanidin extract gavage treatment group (db/m+grape seed proanthocyanidin extract group, db/m+GSPE). The mice of db/db+GSPE group and db/m+GSPE group were administered daily with grape seed proanthocyanidin extract (5 mg/kg) by gavage. Results Renal tissues of db/db diabetic mice showed increased expression of α-SMA, p-p38MAPK, p-ERK1/2 and 8-OHdG level, and down-regulation in E-cadherin expression compared with db/m group (P<0.05). However, the alternations of α-SMA, p-p38, p-ERK1/2, E-cadherin protein levels, and 8-OHdG level, in db/db group were reversed by addition of grape seed proanthocyanidin extract (P<0.05). Conclusion Grape seed proanthocyanidin extract inhibits the epithelial to mesenchymal transition (EMT) associated protein, by decreasing ROS production, and activating p38 MAPK and ERK1/2. These findings suggest that grape seed proanthocyanidin extract provides a treatment option for diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; epithelial to mesenchymal transition; grape seed proanthocyanidin extract; α-SMA; E-cadherin

河北省自然科學(xué)基金(H2016206482)、河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(QN2015020)

河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，石家莊 050017

韋金英，女，博士，副教授。Tel: (0311)86265724，E-mail: wjy-sss@126.com 吳海江，男，博士，副教授，通訊作者。E-mail: haijianglaoqi@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.007.html

R-332

A

1001-7399(2017)08-0858-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.007

接受日期：2017-05-24