曹燕飛，任 睿，楊 曄，羅向暉，王水利

miR-185靶向Six1對肺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響及其機制

曹燕飛1，任 睿2，楊 曄1，羅向暉1，王水利3

目的 探討miR-185影響人肺癌細胞遷移和侵襲能力的分子機制。方法 在肺癌細胞系H520和A549中轉(zhuǎn)染miR-185 mimic獲得miR-185過表達，利用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力；熒光素酶報告實驗驗證miR-185靶向Six1基因；采用qRT-PCR和Western blot法檢測miR-185對細胞中Six1基因表達水平的影響；Western blot法檢測miR-185過表達對肺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程的影響。結(jié)果 miR-185過表達降低肺癌細胞的遷移和侵襲能力(P<0.05)，上皮細胞標志物E-cadherin表達升高(P<0.01)，間質(zhì)細胞標志物vimentin表達降低(P<0.01)，H520細胞過表達miR-185后，Six1基因表達水平降低(P<0.01)，miR-185調(diào)控肺癌細胞的遷移和侵襲是通過靶向Six1基因?qū)崿F(xiàn)的。結(jié)論 miR-185靶向Six1基因調(diào)控人肺癌細胞EMT途徑。

肺腫瘤；遷移；侵襲；miR-185；Six1

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，由于肺癌發(fā)病隱匿、復(fù)發(fā)率高、侵襲性強等，給臨床治療帶來極大困難[1]。miR-185是一個長度為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，定位于人染色體22q11.21，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，研究表明miR-185在人肺癌細胞中呈低表達[2]，在非小細胞肺癌中miR-185誘導(dǎo)細胞周期在G1期阻滯，抑制細胞增殖[3-4]。有研究證明，在腫瘤中Six1是miR-185的靶基因之一[5]。Six1在早期肺腺癌中表達上升[6]，但目前Six1基因在肺癌中的作用機制還有待研究。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腫瘤的發(fā)生與遷移過程中起著十分重要的作用，而E-cadherin和vimentin是EMT過程中的關(guān)鍵因子，在EMT中，常伴有E-cadherin的功能缺失[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Six1的過表達能夠引起EMT[8]。本文旨在探討miR-185對肺癌細胞的遷移、侵襲的影響及其分子機制是否與Six1基因相關(guān)以及對肺癌細胞EMT過程的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人肺癌細胞系H520、A549購自ATCC公司，RPMI 1640及胎牛血清購自Hyclone公司；RNA抽提和純化試劑盒購自德國Qiagen公司；qRT-PCR試劑盒及所有引物均購自美國ABI公司，miR-185模擬物(miR-185 mimic)及其對照(miR-185 NC)購自美國AB公司。Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，熒光素酶報告載體pmirGLO vector購自湖南科愛醫(yī)療公司；轉(zhuǎn)染用無血清Opti-MEMI購自Sigma公司；Six1 siRNA由上海英俊生物公司合成，Six1抗體購自Abcam公司，E-cadherin和vimentin購自上海安妍生物公司。Transwell小室(8 μm孔徑聚碳酸酯膜)和Matrigel購自美國Corning Costar公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)孵箱中傳代培養(yǎng)。每2～3天消化傳代。轉(zhuǎn)染前1天將細胞按需接種于細胞培養(yǎng)板，次日按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時細胞達70%～90%的板底面積。按照轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明轉(zhuǎn)染陰性對照組(si-Con，轉(zhuǎn)染無效序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)、實驗組(si-Six1，轉(zhuǎn)染有效序列5′-AGTTTGAGCTAATGGCGTG-3′)。實驗分組：(1)正常對照為normal組；(2)轉(zhuǎn)染miR-185 mimic為miR-185組；(3)轉(zhuǎn)染miR-185 NC為NC組。

1.3 Transwell實驗檢測細胞的侵襲性 細胞侵襲實驗在Transwell小室中進行，在聚碳酸酯膜上室面鋪Matrigel膠，整個操作在冰上和無菌條件下進行，37 ℃固化1 h備用。實驗分為3組：normal組、miR-185組和NC組，每組重復(fù)3次，48 h后用含1%血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞，調(diào)整細胞濃度，在上室接種5×104/100 μL，下室加入含10%血清的完全培養(yǎng)基作為趨化劑。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，擦掉上室細胞，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，然后在顯微鏡下計數(shù)5個不重復(fù)視野的穿膜細胞數(shù)。

1.4 劃痕實驗 將處于對數(shù)生長期的細胞以0.25%胰酶消化處理，離心棄上清，以完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，吹勻后計數(shù)細胞并調(diào)整至所需細胞的濃度，接種單細胞懸液于6孔板中，待24 h細胞密度達90%時，換正常培養(yǎng)基為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，待細胞貼壁率達100%時，用無菌槍頭在每個孔中長滿的單層細胞上迅速而輕輕地劃1～2道痕，1×PBS沖洗去掉脫落的細胞，換無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并在5 h及24 h后拍照觀察，利用顯微鏡自帶的測量工具測量同一位點上5、24 h劃痕的寬度，計算遷移距離，細胞遷移距離=1/2(5 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)。

1.5 qRT-PCR 將細胞接種于6孔板，實驗分為3組：normal組、miR-185組和NC組，重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染48 h時用Trizol法提取總RNA，檢測濃度及純度，并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，然后以總RNA為模板，miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行第一鏈cDNA的合成，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，以U6為陽性對照基因校正PCR模板的拷貝數(shù)，基因相對表達量采用2-ΔΔCt值計算。引物序列：miR-185反轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC TCAGGA-3′；miR-185 PCR下游引物5′-TGGAGAGA AAGGCAGTTCCTGA-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTC ACGAATITGCGT-3′；Sixl上游引物5′-CAGTTCT CGCCTCACAAC-3′，下游引物5′-TTCTCCTTGAAGC AGTAGC-3′；GAPDH上游引物5′-TATGACAACA GCCTCAAGAT-3′，下游引物5′-AGTCCTYCCACGA TACCA-3′。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達 用預(yù)冷的RIPA細胞裂解液裂解細胞，經(jīng)超聲機粉碎后離心取上清。提取的細胞蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入Six1、E-cadherin及vimentin抗體，內(nèi)參為抗GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標記的二抗進行雜交，孵育1 h，ECL試劑顯色，采用成像儀拍照，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH的A值比值表示蛋白的相對表達水平。1.7 熒光素酶檢測 將含有miR-185結(jié)合位點的Six1 3′-UTR的cDNA片段插入到pmirGLO載體，通過點突變方法，構(gòu)建結(jié)合位點突變的Six1 3′-UTR的cDNA片段，插入pmirGLO載體，并經(jīng)測序驗證插入序列正確。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pmirGLO-Six1或pmirGLO-mut Six1重組載體與miR-185 mimic或miR-185 NC共轉(zhuǎn)染入H520細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集并裂解細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)說明書操作，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示各組細胞的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-185對H520、A549細胞遷移和侵襲的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-185 mimic后H520細胞miR-185表達水平較normal組和NC組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明H520細胞轉(zhuǎn)染miR-185 mimic后miR-185過表達效果顯著(圖1A)；A549細胞轉(zhuǎn)染miR-185 mimic后，與normal組和NC組相比，miR-185表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。Transwell結(jié)果顯示，48 h后過表達miR-185的H520細胞中遷移到下室的細胞數(shù)目為121±2，normal組為432±4，NC組為416±5，miR-185組細胞的侵襲能力明顯低于normal組(P<0.05，圖1C)；A549細胞轉(zhuǎn)染48 h后，miR-185組遷移到下室的細胞數(shù)目為241±5，normal組為384±3，NC組為361±5，miR-185過表達后，細胞的侵襲能力明顯降低(P<0.05，圖1D)。劃痕實驗顯示，5 h時H520和A549細胞均無細胞越過“劃痕”，而24 h后miR-185組H520細胞遷移距離為(142.32±2.45) μm，A549細胞遷移距離為(167.24±5.37) μm；normal組H520細胞遷移距離為(237.03±4.24) μm，A549細胞遷移距離為(285.97±8.13) μm；NC組H520細胞遷移距離為(224.06±3.62) μm，A549細胞遷移距離為(276.54±6.23) μm，提示在兩種肺癌細胞系中，中，miR-185組細胞遷移能力與normal組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 A.H520細胞中miR-185過表達；B.A549細胞中miR-185過表達；C.miR-185過表達對H520細胞侵襲的影響；D.miR-185過表達對A549細胞侵襲的影響；與normal組相比，*P<0.05;1. normal組；2. NC組；3. miR-185組

2.2 miR-185調(diào)控肺癌細胞EMT過程 Western blot結(jié)果顯示miR-185表達上調(diào)后，肺癌H520細胞中E-cadherin表達量明顯增高(P<0.01)，而vimentin表達量減低(P<0.01，圖2)。提示細胞miR-185過表達后，H520細胞發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)換。該結(jié)果表明miR-185可通過誘導(dǎo)EMT改變促進肺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

2.3 過表達miR-185對Six1表達水平的影響 熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，在H520細胞中，轉(zhuǎn)染miR-185 mimic抑制熒光素酶的活性，與NC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將Six1 3′UTR點突變后，則miR-185過表達對熒光素酶的活性無明顯影響(圖3A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-185組細胞Six1 mRNA較normal組和NC組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，在H520細胞中，miR-185組細胞Six1蛋白表達水平較normal組和NC組也均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3C)。

圖2 miR-185調(diào)控肺癌細胞EMT過程 與normal組相比，**P<0.01

2.4 miR-185靶向Six1調(diào)節(jié)肺癌細胞的遷移、侵襲和EMT途徑 為進一步分析miR-185影響肺癌細胞的侵襲、遷移能力的分子機制，本實驗采用轉(zhuǎn)染Six1 siRNA來檢驗normal組和miR-185組細胞的侵襲和遷移變化及EMT過程相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示：抑制Six1基因，肺癌細胞的遷移和侵襲率明顯降低(圖4A、B)。說明miR-185影響肺癌細胞遷移和侵襲是通過靶向Six1基因?qū)崿F(xiàn)的。同時，Western blot檢測了低表達Six1對EMT過程標記蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)抑制Six1，miR-185過表達造成的E-cadherin表達增加情況減弱，miR-185過表達造成的vimentin表達降低的情況同樣減弱(圖4C)。

圖3 A.miR-185靶向Six1；B.過表達miR-185對Six1 mRNA表達 水平的影響；C.過表達miR-185對Six1蛋白表達水平的影響

與NC組相比，*P<0.05；與normal組相比，**P<0.01

圖4 A.抑制Six1對細胞遷移的影響；B.抑制Six1對細胞侵襲的 影響；C.抑制Six1對EMT過程中標記蛋白表達的影響

與normal組相比，*P<0.05；與miR-185組相比，#P<0.05

3 討論

肺癌患者就診時多伴有遠端轉(zhuǎn)移，80%～90%的肺癌患者死亡是由轉(zhuǎn)移引起的。而轉(zhuǎn)移很大程度上影響了肺癌患者的治療、生存質(zhì)量及預(yù)后。因此，肺癌的轉(zhuǎn)移是醫(yī)學(xué)的重大難題。闡明肺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制進而采取靶向干預(yù)措施控制轉(zhuǎn)移，有望進一步改善肺癌患者預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)miR-185在肺癌中的表達降低，本組實驗進一步闡明了miR-185能通過影響肺癌細胞EMT過程變化，從而影響肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。

目前對miR-185的功能及其機制研究發(fā)現(xiàn)，miR-185在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著非常重要的角色，其對于腫瘤細胞的生長、侵襲遷移和耐藥性等多種生物學(xué)行為具有非常重要的作用[9]。Liu等[4]對人結(jié)腸癌細胞SW1116、LoVo研究發(fā)現(xiàn)miR-185能下調(diào)RhoA/Cdc42表達，抑制細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞侵襲。本組實驗在查閱大量相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，通過過表達miR-185，發(fā)現(xiàn)其在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中通過靶向調(diào)節(jié)Six1基因發(fā)揮調(diào)控作用，因此上調(diào)miR-185可能是潛在的肺癌分子治療策略。

EMT為上皮細胞發(fā)生向間質(zhì)細胞的形態(tài)及基因表達改變，其常伴有上皮細胞標志物E-cadherin等表達下調(diào)，而間質(zhì)細胞標志物vimentin等表達升高。目前，腫瘤細胞EMT改變與其侵襲轉(zhuǎn)移、干性維持、耐藥及放療抵抗關(guān)系密切[10]。一直以來，EMT被認為是導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因之一。本組實驗發(fā)現(xiàn)miR-185上調(diào)后，肺癌細胞的體外遷移及侵襲能力降低的同時，發(fā)生了EMT改變。從而初步表明miR-185經(jīng)EMT調(diào)控肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。

本實驗證實了在肺癌中miR-185影響細胞遷移和侵襲時通過靶向Six1實現(xiàn)的。總之，本實驗通過體外實驗證實miR-185能對肺癌細胞的遷移和侵襲能力發(fā)揮調(diào)控作用。同時初步表明該調(diào)控作用的產(chǎn)生與其誘導(dǎo)的肺癌細胞EMT過程密切相關(guān)。研究結(jié)果有助于實現(xiàn)將Six1作為今后肺癌癌治療的潛在干預(yù)靶點。

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Effect of miR-185 targeting Six1 on epithelial-mesenchymaltransition in lung cancer and its mechanism

CAO Yan-fei1, REN Rui2, YANG Ye1, LUO Xiang-hui1, WANG Shui-li3

(1DepartmentofThoracicSurgery,3DepartmentofRespiratory,ShanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,Xin’anCentralHospitalofShanxiProvince,Xi’an710048,China)

Purpose To study the molecular mechanism of miR-185 affecting the migration and invasion of human lung cancer cell. Methods MiR-185 overexpression was obtained by transfection of miR-185 mimic in lung squamous cell carcinoma cell line H520 and A549, transwell assay and cell scratch assay were used to detection of cell migration and invasion. The luciferase reporter assay confirmed that miR-185 targets the Six1 gene. qRT-PCR and Western blot were used to detect the impact of miR-185 cells Six1 gene expression. Western blot was used to detect the effect of miR-185 overexpression on the epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells. Results miR-185 overexpression reduced migration and invasion of lung cancer cells (P<0.05), increased epithelial cell marker E-cadherin expression (P<0.01), and decreased the expression of mesenchymal cell markers vimentin of (P<0.01). After overexpression of miR-185 in H520 cells, the expression level of Six1gene was reduced (P<0.01). MiR-185 regulated the migration and invasion of lung cancer cells by targeting the Six1 gene. Conclusion MiR-185 targets the Six1 gene to regulate the EMT pathway of human lung cancer cells.

lung neoplasms; migration; invasion; miR-185; Six1

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2014JM2-8166)

1陜西省人民醫(yī)院胸外科、3呼吸內(nèi)科，西安 7100682陜西省新安中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710048

曹燕飛，男，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: cyf.521@qq.com 任 睿，女，碩士，主治醫(yī)師，通訊作者。Tel: (029)82229222，E-mail: 80921@126.com

時間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.011.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0879-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.011

接受日期：2017-04-25