黃 石，朱 力，陳 嘉，黃朝平

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都 610500)

·論著·

鼠李糖乳桿菌對(duì)過(guò)敏性鼻炎小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用*

黃 石，朱 力△，陳 嘉，黃朝平

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都 610500)

目的探討鼠李糖乳桿菌(lactobacillus rhamnosus GG，LGG)對(duì)卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導(dǎo)過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用。方法6～8周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、LGG組及AR組，每組各10只。采用Luminex法檢測(cè)各組血清IL-4 、IL-10和IFN-γ水平。ELISA測(cè)血清OVA特異性IgE(OVA-sIgE)水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞比例。結(jié)果與AR組比較，LGG可明顯降低血清IL-4、IL-10及OVA-SIgE水平(P<0.05)，提高脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞比例(P<0.05)；LGG組血清IFN-γ水平與AR組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.215)。結(jié)論LGG能通過(guò)抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)及增強(qiáng)CD4+CD25+T細(xì)胞活性發(fā)揮抗過(guò)敏作用。

過(guò)敏性鼻炎；益生菌；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Th1/Th2細(xì)胞因子

近年來(lái)，過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是世界性衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病機(jī)制主要是由免疫調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)各種變應(yīng)原的免疫應(yīng)答向Th2型偏移，即Th1型細(xì)胞反應(yīng)受到抑制，Th2型細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ及IL-12減少，相反Th2細(xì)胞分泌的IL-3、 IL-4和IL-5等增多，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgE增多，嗜酸性粒細(xì)胞活化、增殖及釋放各種促炎性介質(zhì)[1]，引起打噴嚏、鼻癢、鼻分泌亢進(jìn)和鼻阻等癥狀。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是一種抑制性T細(xì)胞，其中，CD4+CD25+T細(xì)胞是Tregs家族中最重要的一員，通過(guò)協(xié)助抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞以及外周樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，下調(diào)T輔助細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)，而且能阻止初始T細(xì)胞(Th0)早期的活化階段向Th2階段分化轉(zhuǎn)變[2]。IL-10是Tregs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用過(guò)程中的關(guān)鍵因子,其可誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)，促進(jìn)Th0向Tregs分化，而Tregs又可分泌IL-10，調(diào)節(jié)Th0向Th1方向分化[3]，從而進(jìn)一步增強(qiáng)Tregs活性。

益生菌來(lái)源于希臘文，適量可對(duì)宿主有益，是一種活的微生物。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4-5]證實(shí)，益生菌對(duì)哮喘及食物過(guò)敏、過(guò)敏性皮炎等動(dòng)物模型有免疫調(diào)節(jié)作用。目前，一些臨床研究[6-7]證實(shí)，應(yīng)用益生菌制劑可緩解AR患者鼻部癥狀，提高其生活質(zhì)量，但卻缺乏實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)來(lái)支持該措施進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)建立AR動(dòng)物模型，給予鼠李糖乳桿菌(lactobacillus rhamnosus GG，LGG)灌胃處理，分析LGG對(duì)AR動(dòng)物模型的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只6～8周齡雌性BALB/c小鼠(購(gòu)自成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)，體質(zhì)量(20.0±2.0)g, SPF級(jí)。經(jīng)過(guò)1周檢疫期后，飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：塑料鼠籠，室溫(24±1)°C，濕度55%，光照周期12 h/12 h，自由進(jìn)食水，不含卵清蛋白(ovalbumin,OVA)。動(dòng)物飼養(yǎng)和試驗(yàn)許可均按照成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制定的條例執(zhí)行。

1.2AR小鼠模型建立和LGG干預(yù)

小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)方式如下：1)陰性對(duì)照組：采用生理鹽水腹腔注射和鼻腔激發(fā)后，給予生理鹽水灌胃至56 d。2)AR組：采用OVA(美國(guó)sigma公司)腹腔注射致敏和OVA滴鼻進(jìn)行鼻腔激發(fā)后，給予生理鹽水灌胃至56 d；3)LGG組：采用OVA腹腔注射致敏和OVA滴鼻進(jìn)行鼻腔激發(fā)后，給予每只小鼠LGG(上海交通大學(xué)昂立生物研究所)， 0.1 mL(1×109cfu)，1 次/d，灌胃至56 d。

造模主要步驟[8]如下：AR組分別于第0天和第7天經(jīng)腹腔注射，20 μg OVA連同2 mg氫氧化鋁凝膠混合于200 μL PBS中，行腹腔注射致敏；從14 d開(kāi)始接受為期6 周，1 次/d的鼻部激發(fā)，以200 μg OVA溶于20 μL PBS中，使用微量加樣器滴于小鼠前鼻孔，10 μL/側(cè)，由其自主吸入鼻腔。

1.3標(biāo)本的制備

鼻腔激發(fā)完畢后，麻醉小鼠,摘眼球取靜脈血，1 200×g(4 ℃)，離心10 min，收集血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子。靜脈血收集完畢后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出完整的脾臟后，使用研磨棒輕輕研磨，加PBS懸浮細(xì)胞，并通過(guò)網(wǎng)孔直徑為40 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液，用于檢測(cè)脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞比例。

1.4血清OVA特異性IgE(OVA-sIgE)水平檢測(cè)

采用ELISA試劑盒(美國(guó)Biolegend公司)檢測(cè)血清OVA-sIgE的濃度水平。首先將反應(yīng)孔板使用包被液及終止液包被，按試劑盒說(shuō)明配置標(biāo)準(zhǔn)品，并使用去離子水稀釋血清標(biāo)本(OVA-sIgE：樣本稀釋2倍)。將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋好的樣本分別加入相應(yīng)的反應(yīng)孔中，室溫下?lián)u床上孵育2 h，倒出反應(yīng)孔中的液體并洗孔。再加入100 μL生物素化的二抗，室溫下?lián)u床上孵育1 h，棄液并洗孔。接著加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，室溫下反應(yīng)30 min，棄液并洗孔，每孔加入100 μL底物溶液，避光反應(yīng)15 min，最后每孔加入100 μL終止液。使用Bio-Rad680在450 nm處讀取OD值，并通過(guò)系統(tǒng)計(jì)算出對(duì)應(yīng)孔中的濃度。

1.5血清細(xì)胞因子檢測(cè)

本研究使用Luminex試劑盒(美國(guó)R&D公司)，檢測(cè)血清中IL-4和IL-10的濃度。具體步驟如下：洗板后各反應(yīng)孔分別加入50 μL相應(yīng)因子的微粒混合物及50 μL配置好的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋好的血清樣本(所有樣本均稀釋2倍)，室溫下振蕩器上孵育3 h。采用真空抽吸裝置自孔底吸出液體后洗板，再每孔加入50 μL生物素化的抗體,室溫下振蕩器上孵育1 h。抽吸反應(yīng)孔中液體并洗板，接著加入50 μL PE標(biāo)記的鏈親和素，反應(yīng)30 min。最后，洗板后加入100 μL清洗液并使用Luminex讀數(shù)。

1.6檢測(cè)脾細(xì)胞懸液CD4+CD25+T細(xì)胞比例

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞的比例。將準(zhǔn)備好的脾細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法定量細(xì)胞濃度在106個(gè)/mL， 取1 mL細(xì)胞懸液，1 500 ×g(4 ℃)，離心5 min，去上清液，再使用50 μL PBS重懸，接著加入1 μL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體和1 μL PE標(biāo)記的抗鼠CD25抗體(美國(guó)eBioscience公司)，4 ℃下，避光孵育30 min，再加入1 mL Fixation/Permeabilization 緩沖液(溶質(zhì)和溶劑按1∶2比例配置)，震蕩后，4 ℃，孵育30 min。接著加入3 mL Permeabilization緩沖液(溶質(zhì)和溶劑按1∶9比例配置)，震蕩后離心去上清液。清洗并重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)的數(shù)據(jù)使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1血清OVA-sIgE、IL-4、IFN-γ及IL-10水平比較

血清OVA-sIgE：AR組血清OVA-sIgE水平較LGG組及陰性對(duì)照組血清升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但LGG組小鼠血清OVA-sIgE水平與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.399)；血清IL-4水平比較：AR組血清IL-4水平較陰性對(duì)照組及LGG組血清IL-4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； LGG組小鼠血清IL-4水平較陰性對(duì)照組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.655)；血清IFN-γ水平比較：AR組與陰性對(duì)照組、AR組與LGG組及陰性對(duì)照組與LGG組間血清IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.456、0.215、0.641)；血清IL-10水平比較：AR組血清IL-10水平較陰性對(duì)照組及LGG組血清IL-10水平升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； LGG組小鼠血清IL-10水平較陰性對(duì)照組血清IL-10水平有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.405)(表1)。

2.2脾細(xì)胞懸液CD4+CD25+T細(xì)胞比例

AR組脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組降低(P<0.05)；LGG組脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞比例較AR組及陰性對(duì)照組脾細(xì)胞懸液中CD4+CD25+T細(xì)胞比例均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 血清細(xì)胞因子水平及脾細(xì)胞懸液CD4+CD25+T細(xì)胞比例(x±s，n=10)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與LGG組比較，#P<0.05

3 討論

AR是具有過(guò)敏性體質(zhì)的個(gè)體接觸致敏原后，由IgE介導(dǎo)的，以炎性介質(zhì)釋放為開(kāi)端的，有免疫活性細(xì)胞、促炎細(xì)胞以及細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病。輔助性T細(xì)胞在這一過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞型反應(yīng)增強(qiáng)，分泌大量Th2代表因子IL-4， 而IL-4可促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并產(chǎn)生IgE，引起鼻黏膜高度充血水腫、腺體增生、黏膜下淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加[9]。正常個(gè)體血清IgE水平極低，而AR患者血清中IgE水平較高[10]。本研究采用OVA作為致敏原，對(duì)雌性Balb/c小鼠進(jìn)行致敏，血清OVA-sIgE水平較陰性對(duì)照組明顯升高，表明建模成功；經(jīng)LGG灌胃干預(yù)后，血清OVA-sIgE水平明顯降低，表明LGG干預(yù)可減少OVA-sIgE產(chǎn)生，緩解Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。

輔助性T淋巴細(xì)胞亞群按產(chǎn)生細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)的功能的不同，可分為T(mén)h1和Th2兩類，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IL-12及IFN-γ 等，通常稱為T(mén)h1類細(xì)胞因子，其中，IFN-γ 是其特征因子，參與細(xì)胞免疫。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等，統(tǒng)稱為T(mén)h2類細(xì)胞因子，其中，IL-4是其特征因子，主要參與體液免疫，引起I型變態(tài)反應(yīng)。AR除體內(nèi)特異性IgE升高外，還存在Th1/Th2型免疫失衡，具體表現(xiàn)為T(mén)h2反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，Th1反應(yīng)受抑制。益生菌刺激可維持Th1/Th2平衡，但具體機(jī)制現(xiàn)在還未達(dá)成共識(shí)。本研究結(jié)果顯示，LGG組Th2代表因子IL-4較AR組明顯降低，而Th1代表因子IFN-γ與AR組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示LGG可能主要是通過(guò)抑制Th2型反應(yīng)來(lái)達(dá)到Th1/Th2平衡的，此過(guò)程沒(méi)有明顯促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答。

脾作為全身免疫器官，是淋巴細(xì)胞接受抗原刺激，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。CD4+CD25+T細(xì)胞是Tregs家族中最主要的一群細(xì)胞，可以通過(guò)細(xì)胞間直接接觸的方式，抑制其他效應(yīng)性免疫細(xì)胞，從而維持機(jī)體的免疫平衡，CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量和功能的異?？蓪?dǎo)致多重自身免疫性疾病的發(fā)生[11]。本實(shí)驗(yàn)中，AR組CD4+CD25+T比例較陰性對(duì)照組明顯減少，證實(shí)CD4+CD25+T數(shù)量下降可誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。IL-10作為CD4+CD25+T細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞向Th1方向分化，從而調(diào)節(jié)免疫平衡。成熟的APC分泌IL-2，使Th0向Thl細(xì)胞發(fā)育，不成熟的或經(jīng)IL-10/TGF-β誘導(dǎo)的APC，促進(jìn)初始T細(xì)胞向Tregs分化，而Tregs進(jìn)一步產(chǎn)生大量IL-2、IL-10，抑制Thl/Th2細(xì)胞，反饋性下調(diào)APC功能，從而全面抑制免疫反應(yīng)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，益生菌可通過(guò)TLR9傳遞信息給APC，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10，促進(jìn)Tregs細(xì)胞分化。然而，益生菌能否刺激IL-10的分泌還存在爭(zhēng)議，Hougee等[12]及Ghadimi等[13]研究卻發(fā)現(xiàn)，益生菌刺激不但不能刺激IL-10的分泌，反而可使其降低。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在Huang等[14]的研究結(jié)果中。本實(shí)驗(yàn)中，LGG組小鼠血清IL-10水平較AR組明顯降低，這可能是被增加的IL-10受體結(jié)合[15]，導(dǎo)致血清游離IL-10減少所致。

綜上所述，LGG能通過(guò)抑制Th2型細(xì)胞反應(yīng)及增強(qiáng)Tregs活性，從而起到防治過(guò)敏性鼻炎發(fā)生的作用。

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ImmunomodulatoryEffectofLactobacillusRhamnosusGGontheBALB/cMicewithAllergicRhinitis

HuangShi,ZhuLi△,ChenJia,HuangChaoping.

TheDepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo investigate the immunomodulatory effect of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) on the BALB/c mice with allergic rhinitis (AR) induced by ovalbumin (OVA).MethodsThe BALB/c mice aged from6to8weeks were divided randomly into the control group, LGG group and AR group, and each group consisted of10mice. The Luminex method was used to detect the levels of IL-4, IL-10and IFN-γ in each group, the ELISA method was adopted to detect the level of OVA-specific IgE (OVA-sIgE), and the flow cytometry assay was used to examine the splenic percentage of CD4+CD25+Tregs.ResultsCompared with the AR group, LGG significantly reduced the levels of serum IL-4, IL-10and OVA-specific IgE respectively (P<0.05) and increased the splenic percentage of the CD4+CD25+Tregs (P<0.05). There were no significant differences in the level of IFN-γ between the LGG group and the AR group (P=0.215).ConclusionsLGG exerts the anti-allergic effect by inhibiting the Th2immune response and inducting the activity of CD4+CD25+Tregs.

Allergic rhinitis; Probiotics; Regulatory T cells; Th1/Th2cell factor

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170613.1606.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.012

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(No:2015JY0256)

：朱力，E-mail：1968403299@qq.com

R392.8

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