代培培,郭興家，王 丹，呂京珊,許志強(qiáng)，劉 暢，劉立杰，王詩(shī)堯，郝愛軍

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2. 遼寧大學(xué) 化學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

替加氟透明質(zhì)酸納米粒的制備

代培培1,郭興家2，王 丹1，呂京珊1,許志強(qiáng)1，劉 暢1，劉立杰1，王詩(shī)堯1，郝愛軍1

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2. 遼寧大學(xué) 化學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

采用透明質(zhì)酸為原料，以己二酰肼為交聯(lián)劑、EDCI為催化劑，制備了透明質(zhì)酸納米粒，并用做抗腫瘤藥物替加氟的載體。紅外光譜法確定了透明質(zhì)酸納米粒官能團(tuán)的變化反應(yīng)。采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定了納米粒的粒徑和zeta電位。結(jié)果表明，本方法制備的透明質(zhì)酸納米粒的平均粒徑為218.3±41.38 nm，zeta電位為-24.0 ± 7.48 mV。替加氟在透明質(zhì)酸納米粒的包封率為92.1%。

替加氟；透明質(zhì)酸；納米粒；酰肼交聯(lián)法

替加氟又名喃氟啶、FT-207，是氟尿嘧啶(5-Fu)的前體藥物，在機(jī)體肝臟內(nèi)被代謝酶(P-450)活化分解為5 - Fu而起抗腫瘤作用[1]。替加氟在臨床上主要適用于消化道癌，對(duì)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌有一定療效，對(duì)乳腺癌及肝癌也有效[1-3]。在治療腫瘤的同時(shí)，替加氟具有較多的不良反應(yīng)，主要包括骨髓抑制反應(yīng)，白細(xì)胞、血小板下降，神經(jīng)毒性反應(yīng)等。研究表明，替加氟是時(shí)間依存性抗癌藥，即藥物殺滅癌細(xì)胞的效能與接觸細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)短正相關(guān)。因此，為增加替加氟的治療效果，人們研究了替加氟的靜脈脂肪乳劑[5]、緩釋片劑[6]、白蛋白微球[7]及脂質(zhì)體[8-9]等劑型。其中納米類給藥系統(tǒng)尤其引人關(guān)注。

納米藥物是指是指粒徑在 1-1000 nm范圍內(nèi)的微粒類藥物[10]。用作納米藥物載體的納米粒主要包括由合成聚合物或天然高分子構(gòu)成。由于納米粒尺寸在納米級(jí)別而產(chǎn)生獨(dú)特的納米效應(yīng)，包括表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)等，最終，納米材料在光學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)、磁學(xué)等物理性能方面都有較為顯著的提高。因此，納米粒在化工、陶瓷、電子學(xué)、光學(xué)、生物醫(yī)藥等諸多方面具有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力[10]。尤其是納米藥物近年來(lái)得到快速發(fā)展。普通小分子藥物常規(guī)給藥方式下，缺少組織靶向性，在治療疾病的同使具有較大的毒副作用[11-12]。采用納米粒子作為藥物載體制備成納米藥物，利用納米粒子在體內(nèi)的EPR效應(yīng)，納米藥物可以實(shí)現(xiàn)良好的腫瘤和炎癥組織的靶向傳遞，可以減少給藥次數(shù)，提高藥物對(duì)病變部位的靶向性[11-12]。本文以生物相容性聚合物透明質(zhì)酸鈉為原料制備載替加氟的納米給藥系統(tǒng)。

透明質(zhì)酸又稱玻尿酸(Hyaluronan)，是由兩個(gè)雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高分子量的糖醛酸[13-14]。透明質(zhì)酸具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等作用。同時(shí)，現(xiàn)代腫瘤相關(guān)研究表明，透明質(zhì)酸在多種腫瘤組織中的含量均有所升高。同時(shí)，分子藥理學(xué)研究表明，透明質(zhì)酸鈉可以特異性識(shí)別并特異性結(jié)合細(xì)胞表面CD44受體，引起信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架的重排[15]。有研究表明CD44受體具有促進(jìn)侵襲性腫瘤存活的能力，而抑制CD44的活性則誘導(dǎo)侵襲性腫瘤的凋亡。同時(shí)也有研究表明，不同分子量的透明質(zhì)酸在體內(nèi)的作用差別很大。小分子量的透明質(zhì)酸可以促進(jìn)腫瘤的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，中高分子量的透明質(zhì)酸可以抑制腫瘤產(chǎn)生。

本文利用透明質(zhì)酸鈉作為原料，采用酰肼交聯(lián)法制備透明質(zhì)酸納米粒，并用作抗腫瘤藥物替加氟的藥物載體，制備替加氟透明質(zhì)酸納米粒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

透明質(zhì)酸鈉(100萬(wàn)Dalton，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)；己二酰肼(ADH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)為市售分析純；替加氟(江蘇南通精華制藥有限公司)。激光粒度測(cè)定儀(Nano ZS-90，馬爾文公司)。

1.2 替加氟分析方法的建立

準(zhǔn)確稱取4.0 mg替加氟溶于100mL容量瓶中，加水定容。再經(jīng)稀釋配制成2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00、18.00和20.00 μg/mL濃度的替加氟標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)272 nm波長(zhǎng)處下測(cè)定其吸光度，并取其三次平均值。記錄數(shù)據(jù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 透明質(zhì)酸納米粒制備：

方法[16]，采用碳二亞胺催化，酰肼交聯(lián)的方法制備透明質(zhì)酸納米粒。具體方法如下：于500 mL的燒杯中，加入80 mL的去粒子水，加入0.2 g的透明質(zhì)酸，溶解后得到透明的粘性溶液(2.5 mg/mL)。加入適量丙酮，攪拌15 min，保證均勻溶解。將80 mg的EDC和40 mg的ADH溶于2 mL的去離子水中，加入到上述燒杯中，攪拌30 min后，加入適量丙酮，繼續(xù)攪拌3 h,用截留分子量(MWCO 1000)透析袋透析，冷凍干燥。得到納米粒。

稱0.0500 g替加氟溶解并定容于50 mL容量瓶中。將上述透明質(zhì)酸納米粒稱重，分散于1.00 mL 去離子水，按納米粒與藥重量10:1比例將藥物溶液與納米粒混合，最后定容得到載藥透明質(zhì)酸納米粒。

1.4 載藥透明質(zhì)酸納米粒表征

取上述載藥透明質(zhì)酸納米粒超聲至溶液均勻后，取5 mL 在離心機(jī)中進(jìn)行離心分離10 min(10000 rpm，10 min)。取上清液于用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度，測(cè)三次數(shù)據(jù)并取其平均值，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算載藥率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 透明質(zhì)酸納米粒制備

透明質(zhì)酸納米粒的制備方法有多種，可以采用戊二醛、ADH等進(jìn)行交聯(lián)得到微球[16]。采用ADH交聯(lián)方法可以很好地控制納米粒的形狀和交聯(lián)深度，使得到的納米粒在納米范圍。

圖1 透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)

透明質(zhì)酸及其交聯(lián)納米粒的紅外圖譜，圖2為透明質(zhì)酸紅外圖譜，圖3為己二酰肼交聯(lián)透明質(zhì)酸納米粒的紅外圖譜。

由透明質(zhì)酸的紅外譜圖(圖2)可見: 在3399.71 cm-1為HA 的OH 伸縮振動(dòng)峰; 在611.57、1410.86、1617.40 cm-1處為羧酸鹽的特征吸收峰，說(shuō)明有游離羧基結(jié)構(gòu)存在; 在1410.86、1617.40 cm-1處出現(xiàn)C=O和C-N伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明未交聯(lián)的透明質(zhì)酸中存在乙酰氨基的結(jié)構(gòu)。制備得到的HA-ADH納米粒紅外光譜圖譜中(圖3)在3402.54 cm-1處出現(xiàn)明顯的N-H伸縮振動(dòng)吸收峰；1410.86、1617.40 cm-1處的羧酸鹽特征吸收峰消失，在1656.90 cm-1處表現(xiàn)出強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明透明質(zhì)酸與ADH 反應(yīng)生成了新的酰胺鍵，說(shuō)明透明質(zhì)酸納米粒是通過化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)形成的。

圖2 透明質(zhì)酸原料的紅外光譜圖

圖3 透明質(zhì)酸納米粒的紅外光譜圖

2.2 透明質(zhì)酸納米粒的粒徑和zeta電位

在制備得到透明質(zhì)酸納米粒后，我們用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定了納米粒的粒徑和Zeta電位，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 透明質(zhì)酸納米粒的粒徑和表面電荷

圖5 透明質(zhì)酸納米粒的zeta電位

透明質(zhì)酸采用ADH交聯(lián)形成納米粒后，其平均粒徑為218.3±41.38 nm。說(shuō)明粒徑比較均勻，在納米范圍。同時(shí)，透明質(zhì)酸納米粒的 zeta電位為-24.0±7.48 mV。說(shuō)明透明質(zhì)酸納米粒表面帶有較大的負(fù)電荷，有利于納米粒體系的穩(wěn)定。

2.3 透明質(zhì)酸納米粒載藥

按照實(shí)驗(yàn)部分操作，替加氟的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.044c+0.033，r2=0.9996。準(zhǔn)確稱取透明質(zhì)酸納米粒66 mg, 按10:1則加入藥量6.6mg。原溶液濃度為0.66mg/mL,即660.0 μg/mL。離心后測(cè)定上清液中藥物濃度。計(jì)算游離藥物。得到替加氟的包封率為92.1 %。透明質(zhì)酸納米粒與替加氟藥物溶液的質(zhì)量比對(duì)替加氟的包封率的影響有待進(jìn)一步考察。

3 結(jié)論

本文采用酰肼交聯(lián)法制備了透明質(zhì)酸納米粒，采用紅外光譜法測(cè)定了透明質(zhì)酸納米粒的官能團(tuán)變化，采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定了納米粒的平均粒徑和zeta電位。結(jié)果顯示，酰肼交聯(lián)法可以制備透明質(zhì)酸納米粒粒徑為218.3±41.38 nm，zeta電位為-24.0 ± 7.48 mV。采用該納米粒在替加氟藥物的包封率為92.1%。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬東玉,劉 明,黨 云. 用替加氟和氟尿嘧啶對(duì)胃癌患者進(jìn)行化療的效果對(duì)比[J]. 當(dāng)代醫(yī)藥論叢 , 2015 (11) :283-284.

[2] Takiuchi H, Ajani J A. Uracil-tegafur in gastric carcinoma: a comprehensive review[J]. Journal of Clinical Oncology , 1998 , 16 (8) :2877-2885.

[3] Sadahiro S, Tsuchiya T, Sasaki K, et al. Randomized phase III trial of treatment duration for oral uracil and tegafur plus leucovorin as adjuvant chemotherapy for patients with stage IIB/III colon cancer: final results of JFMC33-0502[J]. Annals of oncology, 2015 , 26 (11) :2274-2280.

[4] 劉 剛,楊 沔, 陳本棟. 替加氟與氟尿嘧啶治療胃癌的療效比較[J]. 中國(guó)藥房 2014: 4546-4548.

[5] 韓繼洪, 蘇德森. 抗癌藥物FT-207脂肪乳劑物理性質(zhì)的研究[J]. 沈陽(yáng)藥學(xué)院學(xué)報(bào) 1991 (1) :14-17 ,35.

[6] 謝懷江，宋聚忠，彭 濤，等. 輻射聚合制備抗癌藥FT-207緩放制劑的研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào) 1995,13 (2) : 114-117.

[7] 趙中丹, 梁桂媛, 周宜開, 等. 替加氟白蛋白微球的制備[J]. 廣東藥學(xué) 2000 , 10 (3) :19-22.

[8] 郝愛軍, 鄧英杰, 楊靜文, 等. 影響替加氟脂質(zhì)體包封率的因素[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， , 2005 , 22 (5) :327-330.

[9] 高曉黎, 季興梅. 替加氟新型前體脂質(zhì)體小腸吸收試驗(yàn)研究[J]. 西北藥學(xué)雜志 2003 , 18 (5) :214-215.

[10] 劉 洋, 蔣 晨. 納米藥物遞釋系統(tǒng)的腦靶向研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào) , 2013 (10) :1532-1543.

[11] Jahangirian H, Lemraski EG, Webster TJ, et al. A review of drug delivery systems based on nanotechnology and green chemistry: green nanomedicine[J]. International journal of nanomedicine ,2017, 12: 2957-78.

[12] Saha M. Nanomedicine: promising tiny machine for the healthcare in future-a review[J]. Oman medical journal 2009,24: 242-247.

[13] Allison D D, Grande-Allen K J. Review Hyaluronan: a powerful tissue engineering tool[J]. Tissue engineering 2006, 12(8): 2131-2140.

[14] Reitinger S, Lepperdinger G. Hyaluronan, a ready choice to fuel regeneration: a mini-review[J]. Gerontology 2013,59:71-76.

[15] Cortes-Dericks L, Schmid R A. CD44 and its ligand hyaluronan as potential biomarkers in malignant pleural mesothelioma: evidence and perspectives[J]. Respiratory research 2017,18: 58.

[16] Pitarresi G, Craparo E F, Palumbo F S, et al. Composite nanoparticles based on hyaluronic acid chemically cross-Linked with α,β-polyaspartylhydrazide[J]. Biomacromolecules 2007, 8: 1890-1898.

(本文文獻(xiàn)格式：代培培,郭興家，王 丹，等.替加氟透明質(zhì)酸納米粒的制備[J].山東化工，2017，46(14)：13-16.)

Preparation of tegafur entrapped hyaluronic acid nanoparticles

DaiPeipei1,GuoXingjia2,WanDan1,LyuJingshan1,XuZhiqiang1,LiuChang1,LiuLijie1,WangShiyao1,HaoAijun1

(1. School of Pharmaceutical Science, Liaoning University, Shenyang 110036,China;2. College of Chemistry, Liaoning University, Shenyang 110036,China)

In this paper, hyaluronic acid nanoparticles were prepared and used as tegafur carrier with ADH as crosslinking agent, EDCI as catalyst. FTIR analysis confirmed the changes of functional groups of nanoparticles compared to that of hyaluronic acid. The particle diameter and zeta potentials of the particles were determined by Laser Particle Size Analyzer. The results indicated that the mean particle diameter of hyaluronic acid nanoparticles prepared is 218.3 + 41.38 nm with zeta potential of -24.0 + 7.48 mV. Encapsulation efficiency of tegafur in hyaluronic acid nanoparticles is about 92.1%.

tegafur; hyaluronic acid; nanoparticles; hydrazide cross-linking method

2017-05-16

中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)孫思邈中醫(yī)藥研究專項(xiàng)課題 (2016SKT-M019); 遼寧大學(xué)2016年"大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃"項(xiàng)目(x201610140238)

代培培(1993—)，遼寧大學(xué)制藥工程專業(yè)本科生；通訊作者，郝愛軍(1968—)，河北邢臺(tái)人，遼寧大學(xué)副教授，藥劑學(xué)博士，2013-2014年美國(guó)肯塔基大學(xué)研修，從事藥物新劑型和制劑新技術(shù)研究。

R944.1

A

1008-021X(2017)14-0013-04