黃雙霞，侯殿志，陳華磊，于玥，藍(lán)蔚冰，王帥靜，陳山

(1.廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，南寧 530004；2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004；3.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004)

酶法合成Levan多糖的過程調(diào)控與機(jī)理研究

黃雙霞1,3，侯殿志1,3，陳華磊1,3，于玥1,3，藍(lán)蔚冰1,3，王帥靜1,3，陳山1,2,3*

(1.廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，南寧 530004；2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004；3.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004)

Levan是一種主鏈由大量呋喃果糖基團(tuán)以β-(2,6)糖苷鍵連接，少量支鏈以β-(2,1)糖苷鍵連接的胞外多糖。作為一種功能性多糖，Levan具有益生元、降血脂及抗腫瘤等重要的生理功能，在醫(yī)藥和食品行業(yè)具有巨大應(yīng)用前景。就Levan多糖的制備方法、酶法合成Levan多糖的機(jī)理研究及過程調(diào)控幾方面進(jìn)行了綜述，對酶法合成Levan多糖中存在的問題進(jìn)行了分析和討論，對未來酶法合成Levan多糖的研究方向進(jìn)行了展望。

Levan多糖；酶法合成；Levan蔗糖酶；合成機(jī)理；過程調(diào)控

Levan多糖是一種主鏈以β-(2,6)果糖苷鍵連接，支鏈以β-(2,1)果糖苷鍵連接的微生物功能多糖，其分子量通常在2×103～1×105kDa(Levan多糖結(jié)構(gòu)式見圖1)[1]。Levan多糖具有多種重要的生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化學(xué)工業(yè)行業(yè)中。在食品行業(yè)中，Levan多糖作為天然甜味劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、配方輔助物及風(fēng)味和美味載體等，可以應(yīng)用于糖果、焙烤食品、調(diào)味料及乳品中等[2]；并且Levan多糖含熱量低，進(jìn)入人體后不易被消化吸收，是一種理想的可溶性膳食纖維，可用作減肥食品的原料[3]。在醫(yī)藥行業(yè)中，Levan多糖可作免疫增強因子與抗癌抗菌素[4]。在化學(xué)工業(yè)中，由于Levan多糖具有水溶性、保濕性、熱穩(wěn)定性、成膜性及抗氧化等特性，可以用來制備化妝品添加劑、冷凍保護(hù)劑、薄膜、涂層和納米材料等[5]。Levan多糖的生理活性及功能作用使其具有巨大的商業(yè)應(yīng)用價值，進(jìn)而其制備方法的研究也越來越受到重視。

圖1 Levan多糖結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure chart of Levan polysaccharide

1 Levan多糖的制備方法

目前，制備Levan多糖的方法主要有微生物發(fā)酵法和酶法合成，也有用化學(xué)合成Levan多糖的報道，但由于其合成過程復(fù)雜，產(chǎn)物難以分離純化，且僅獲得以β-糖苷鍵連接的Levan三糖，進(jìn)而很少采用此法[6]。

微生物發(fā)酵法是一種通過生產(chǎn)菌株在高濃度蔗糖培養(yǎng)基中發(fā)酵，經(jīng)過離心、沉淀等工序得到多糖粗品的方法。但是此法目前存在諸多需要改進(jìn)的地方，例如生產(chǎn)菌株篩選困難，易染雜菌；產(chǎn)物分離純化困難，且發(fā)酵廢液污染環(huán)境及成本高等；此外，該法得到的Levan多糖產(chǎn)量也較低，一般在10～50 g/L左右[7]。Feng等[8]構(gòu)建了γ-PGA缺陷型解淀粉芽孢桿菌NK-ΔLP，在最適條件下發(fā)酵培養(yǎng)獲得Levan多糖22.6 g/L；Silbir等[9]利用運動發(fā)酵單胞菌NRRLB-14023在最適條件下培養(yǎng)合成Levan多糖40.2 g/L，通過海藻酸鈣固定化菌后獲得Levan多糖31.8 g/L；Xu X等[10]利用類芽孢桿菌BD3526，在最優(yōu)條件下培養(yǎng)得到Levan多糖36.25 g/L。

酶法是一種通過Levan蔗糖酶直接作用于底物蔗糖，通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)聚合果糖基形成Levan多糖的方法[11]。相比于微生物發(fā)酵方法，酶法合成Levan多糖的過程反應(yīng)體系簡單，避免了發(fā)酵液中菌體的干擾，產(chǎn)物提取及純化較易，并且反應(yīng)條件溫和；通過調(diào)控反應(yīng)條件可提高生產(chǎn)效率及控制產(chǎn)物分子量分布，使得生產(chǎn)成本大大降低[12]。因此，酶法合成未來將成為Levan多糖制備的研究熱點。

2 酶法合成Levan多糖的機(jī)理研究

2.1 Levan蔗糖酶

Levan蔗糖酶(Levansucrase，EC2.4.1.10)屬于GH68家族果糖基轉(zhuǎn)移酶(FTFs)，具有蔗糖水解酶活性和轉(zhuǎn)移酶活性，一般微生物L(fēng)evan蔗糖酶分子量范圍在45～80 kDa之間，少量在100 kDa以上[13]。Levan蔗糖酶生產(chǎn)菌株來源廣泛，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和木醋桿菌(Acetobacterxylinum)等[14]。

不同來源菌種得到的Levan蔗糖酶，其動力學(xué)常數(shù)Km、酶活力、最適溫度、最適pH值及結(jié)構(gòu)等存在差異，所以Levan蔗糖酶的特性及其純化分離技術(shù)的研究備受關(guān)注。目前，國內(nèi)外學(xué)者利用菌種誘變、基因改造、固定化技術(shù)及優(yōu)化培養(yǎng)基等手段，提高Levan蔗糖酶的活力和產(chǎn)量[15]。最適反應(yīng)條件下不同來源Levan蔗糖酶催化蔗糖合成Levan多糖的分子量及產(chǎn)量的變化情況見表1。

表1 不同微生物L(fēng)evan蔗糖酶催化蔗糖制備Levan多糖的研究Table 1 Study on enzymatic synthesis of Levan polysaccharide by different microbial Levansucrase

續(xù) 表

2.2 Levan蔗糖酶的分泌、酶結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機(jī)制

2.2.1 Levan蔗糖酶的分泌

Levan蔗糖酶的基因表達(dá)包括誘導(dǎo)性表達(dá)和組成性表達(dá)，大多數(shù)細(xì)菌利用蔗糖底物誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)錄；同時底物存在時某些細(xì)菌也進(jìn)行組成性表達(dá)，例如枯草芽孢桿菌、運動發(fā)酵單胞菌和谷氨酸木醋桿菌等。微生物L(fēng)evan蔗糖酶的分泌機(jī)制包括以下兩種：對于革蘭氏陽性菌，通過切割引導(dǎo)前體酶的信號肽后分泌Levan蔗糖酶，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和羅伊乳桿菌等[30]；對于絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌，通過信號肽獨立通道分泌Levan蔗糖酶，如解淀粉歐文氏菌、拉恩氏菌和丁香假單胞菌等，最后成熟的酶蛋白會被轉(zhuǎn)移到外部介質(zhì)或附著在細(xì)胞表面[31]。

然而革蘭氏陰性谷氨酸木醋桿菌的Levan蔗糖酶分泌過程與革蘭式陽性菌類似[32]，首先合成N-末端帶30個氨基酸殘基的信號肽來引導(dǎo)前體酶形成，轉(zhuǎn)移到周質(zhì)后信號肽被切除，然后通過跨膜轉(zhuǎn)移β-螺旋折疊的成熟酶蛋白，這種分泌過程稱為II型分泌系統(tǒng)[33]。枯草芽孢桿菌B168菌株的蔗糖代謝途徑以胞外代謝途徑為主，即以sacB基因編碼分泌型的Levan蔗糖酶后催化蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖[34]；其次以sacA、sacP基因催化進(jìn)行胞內(nèi)代謝途徑；研究發(fā)現(xiàn)sacA和sacB操縱子均受到抗終止轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中抗終止轉(zhuǎn)錄因子sacT和sacY起正調(diào)控作用，sacX起負(fù)調(diào)控作用；且sacX、sacY操縱子的表達(dá)又受sacY自身、degS、degU及底物蔗糖的調(diào)控[35]。

2.2.2 酶結(jié)構(gòu)

Levan蔗糖酶屬于胞外酶，其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中通常有5個重要區(qū)域：信號肽、N-末端結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)域和C-末端結(jié)構(gòu)域[36]。GH68家族FTFs都有3個高度保守的AA序列，分別稱為共價催化基團(tuán)、廣義酸/堿催化基團(tuán)和過渡態(tài)穩(wěn)定基團(tuán)形成催化三聯(lián)體[37]。

圖2 Levan蔗糖酶的三維結(jié)構(gòu)及其活性部位[38]Fig.2 The three-dimensional structure and active sites of Levansucrase

圖2中，微生物L(fēng)evan蔗糖酶的晶體結(jié)構(gòu)相似，催化結(jié)構(gòu)域均為5片折疊β-螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，形成一個帶負(fù)電荷、中心深的口袋狀結(jié)構(gòu)[38]。

A為革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶(PDB ID∶1OYG)的三維結(jié)構(gòu)圖，B為其活性部位；C為革蘭氏陰性谷氨酸木醋桿菌Levan蔗糖酶(PDB ID∶1W18)的三維結(jié)構(gòu)圖，D為其活性部位；Levan蔗糖酶催化結(jié)構(gòu)域的5葉片分別對應(yīng)橙色、藍(lán)色、綠色、黃色和紅色。

枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶的親核催化基團(tuán)Asp86(D86)、廣義酸堿催化基團(tuán)Glu342(E342)及過渡態(tài)穩(wěn)定基團(tuán)Asp247(D247)；研究發(fā)現(xiàn)Arg360殘基(R360)位于毗鄰中央口袋的溶劑暴露位點，與活性中心周圍的AA殘基E340、N242相互作用形成一個果糖基受體底物的短暫停留位點，因此，Arg360殘基與聚合酶的活性及Levan多糖的生物合成過程密切相關(guān)[39]。通過研究酶活性中心的氨基酸組成，有助于探索酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。李潤靜等[40]利用化學(xué)修飾劑NBS與PMSF對Levan蔗糖酶進(jìn)行化學(xué)修飾，其中NBS修飾色氨酸(Trp)；PMSF修飾蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)的-OH基團(tuán)，發(fā)現(xiàn)Levan蔗糖酶的水解酶活和轉(zhuǎn)糖基酶活均受到抑制，說明Trp與-OH基團(tuán)是Levan蔗糖酶活性的必需基團(tuán)。

2.2.3 酶催化反應(yīng)機(jī)制

Levan蔗糖酶催化反應(yīng)過程遵循non-Leloir反應(yīng)機(jī)制，包括形成一種共價的糖基-酶中間體并且通過過渡態(tài)氧化碳離子穩(wěn)定這2個步驟[41]：第一階段是糖基化過程，首先蔗糖作為供體，通過親核-COOH基團(tuán)攻擊糖基的異頭碳形成共價的果糖-酶中間體，側(cè)鏈基團(tuán)作為廣義酸催化劑為糖基離去基團(tuán)提供質(zhì)子；第二階段是去糖基化過程，廣義堿催化劑作為質(zhì)子受體，從轉(zhuǎn)移的果糖基(或水分子、蔗糖)移去一個質(zhì)子從而水解果糖-酶中間體[42,43]。

2.3 Levan多糖的合成過程

蔗糖底物同時作為果糖基的供體和受體；水分子、果糖、葡萄糖及低聚果糖均可作為受體；所以根據(jù)不同受體，Levan蔗糖酶利用蔗糖催化以下3個反應(yīng)，見圖3。

圖3 Levan蔗糖酶利用蔗糖催化的3個反應(yīng)[44]Fig.3 Three enzymatic reactions catalyzed by microbial Levansucrase

圖3中1為聚合反應(yīng)，以果聚糖鏈作為受體形成Levan多糖；2為轉(zhuǎn)果糖基反應(yīng)，以單糖、二糖或低聚糖作為果糖基受體；3為水解作用，以水分子為受體釋放葡萄糖和果糖。

Levan蔗糖酶直接作用于蔗糖底物，其水解酶活和轉(zhuǎn)糖基酶活同時起作用，催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖基，同時逐步將呋喃果糖基單元以β-(2,6)糖苷鍵連接到葡萄糖殘基受體上，不斷延長糖鏈，最后形成Levan多糖。Méndez-Lorenzo L等[45]發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜镎崽呛谋M后，合成的聚合物作為果糖基供體，Levan蔗糖酶外切多糖的β-(2,6)糖苷鍵連續(xù)釋放末端果糖，直到外切位點遇到多糖鏈上的分支點后停止，說明連接分支點β-(2,1)糖苷鍵是Levan多糖控制自身合成酶水解作用的關(guān)鍵部位。

根據(jù)不同Levan蔗糖酶來源及反應(yīng)條件，合成Levan多糖的過程存在2種增長機(jī)制。對于革蘭氏陽性菌產(chǎn)的Levan蔗糖酶催化合成聚合物的過程沒有中間產(chǎn)物低聚果糖的積累，其果聚糖鏈與酶相結(jié)合可以產(chǎn)生高聚合度的Levan多糖，稱為高度連續(xù)性增長機(jī)制，如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和唾液鏈球菌[46,47]；而革蘭氏陰性菌產(chǎn)的Levan蔗糖酶在反應(yīng)過程中會生成中間產(chǎn)物，因為水解酶活性依次釋放果糖基形成低聚果糖，導(dǎo)致Levan多糖產(chǎn)量低，這是一種半連續(xù)性增長機(jī)制，如谷氨酸桿菌、解淀粉歐文菌和丁香假單胞菌[48,49]。不同細(xì)菌Levan蔗糖酶對果糖基受體的親和力有顯著差異，因此合成Levan多糖的能力不同，進(jìn)而需要更深一步研究Levan多糖的合成機(jī)制及建立模型。

3 酶法合成Levan多糖的過程調(diào)控

通過酶法合成的過程調(diào)控，可以提高Levan多糖產(chǎn)量和控制其分子量。目前，國內(nèi)外相關(guān)的研究主要通過溫度、蔗糖濃度、pH、離子強度、合成酶的固定化及酶濃度等對酶法合成Levan多糖的過程進(jìn)行調(diào)控。

3.1 溫度的影響

溫度影響酶活性及催化反應(yīng)速率。解淀粉芽孢桿菌在4 ℃時聚合酶活性最高，而在30 ℃時水解酶活性最高[50]；產(chǎn)左聚糖細(xì)桿菌ATCC15953的Levan蔗糖酶聚合最佳溫度為30 ℃，但是水解最佳溫度在45～50 ℃之間[51]。此外，通過控制溫度可以調(diào)控Levan多糖的分子量分布，在50 ℃下地衣芽孢桿菌RN-01產(chǎn)的Levan蔗糖酶主要合成高分子量Levan多糖(612 kDa)，在30 ℃時主要產(chǎn)低分子量多糖(11 kDa)；Santos-Moriano等[52]發(fā)現(xiàn)運動發(fā)酵單胞菌Levan蔗糖酶，在蔗糖濃度為100 g/L時，4 ℃下蔗糖轉(zhuǎn)化率為15.7%，轉(zhuǎn)糖基與水解反應(yīng)的比率為2.4；40 ℃時蔗糖轉(zhuǎn)化率為77.2%，轉(zhuǎn)糖基與水解反應(yīng)的比率為0.8。因此，溫度會影響水解酶活、轉(zhuǎn)糖基酶活及Levan多糖分子量分布；通常Levan蔗糖酶的蔗糖水解反應(yīng)的最佳溫度比聚合反應(yīng)的最佳溫度高，在低溫下(10～30 ℃)有利于聚合形成Levan多糖。

3.2 蔗糖濃度的影響

通常Levan多糖的產(chǎn)量隨著蔗糖濃度的增加而增加，陸娟等[53]使用地衣芽孢桿菌Levan蔗糖酶在一定條件下培養(yǎng)，蔗糖濃度范圍為10～90 g/L，合成Levan多糖的產(chǎn)量隨著蔗糖量濃度的增大而增大。Porras-Domínguez等[54]研究發(fā)現(xiàn)在37 ℃時，枯草芽孢桿菌168 Levan蔗糖酶合成的低分子量分布Levan多糖隨著蔗糖濃度的增加其分子量大小呈降低趨勢；并且在低底物濃度下該酶僅有20%轉(zhuǎn)糖基效率，而在高底物濃度下達(dá)到83%，說明Levan蔗糖酶的轉(zhuǎn)移酶活性隨底物濃度增加而增加。此外，Belghith K S等研究發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度影響嗜熱芽孢桿菌的菌體生長和Levan蔗糖酶的產(chǎn)量，在1%～10%(W/V)低蔗糖濃度時碳源主要供給菌體生長而非合成Levan蔗糖酶，蔗糖濃度達(dá)到30%(W/V)時Levan蔗糖酶的產(chǎn)量與活性均顯著提高。因此，影響Levan蔗糖酶產(chǎn)量的重要因素是蔗糖濃度而不是菌體細(xì)胞的大??；蔗糖濃度變化使Levan蔗糖酶的水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性受到影響，同時也會改變產(chǎn)物L(fēng)evan多糖的分子量分布狀況。

3.3 pH的影響

pH影響酶蛋白的穩(wěn)定性及構(gòu)象，并且通過改變酶與底物的結(jié)合或解離狀態(tài)來影響酶活力，改變催化速率。地衣芽孢桿菌8-37-0-1重組Levan蔗糖酶的最適pH為6.0，而pH<4.0或pH>8.5時酶活力下降50%；運動發(fā)酵單胞菌102250產(chǎn)的Levan蔗糖酶最適pH為6.0；腸膜明串珠菌ATCC8293產(chǎn)的Levan蔗糖酶最適pH為6.5～7.0，當(dāng)pH超過8.0時酶活迅速下降[55]。所以，通常Levan蔗糖酶最適pH值范圍為6.0～7.0左右，在大多數(shù)情況下pH值的變化不影響Levan蔗糖酶的水解酶活性和轉(zhuǎn)移酶活性。

3.4 離子強度的影響

金屬離子可以調(diào)控培養(yǎng)基的離子強度，作為某些酶蛋白分子的激活劑、抑制劑及輔助因子，影響酶的氨基酸電離、氫鍵及酶蛋白分子結(jié)構(gòu)?？莶菅挎邨U菌Levan蔗糖酶有Ca2+結(jié)合位點，可以穩(wěn)定活性殘基之間的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域；而谷氨酸木醋桿菌Levan蔗糖酶通過二硫鍵產(chǎn)生類似折疊穩(wěn)定的作用，無Ca2+存在時酶活力高[56]。地衣芽孢桿菌RN-01產(chǎn)的Levan蔗糖酶，Mn2+存在時酶活增加2.4倍，而Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+，SDS，EDTA存在時酶輕微失活，50 ℃時加入0.5 mol/L NaCl后催化合成的Levan多糖分子量從612 kDa降到11 kDa。甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)的Levan蔗糖酶，Cu2+、Zn2+、Fe3+和N2+對水解酶活和轉(zhuǎn)糖基酶活呈抑制作用；而Mg2+作為激活劑提高酶活，促進(jìn)合成高產(chǎn)量Levan多糖；嗜熱芽孢桿菌Levan蔗糖酶在50 mmol/L Fe2+存在時，酶活增加4倍。因此，通常Mg2+可提高Levan蔗糖酶酶活，Ca2+影響Levan蔗糖酶的催化結(jié)構(gòu)域；NaCl會與底物競爭水分子，促進(jìn)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)；此外，強離子作用可能影響酶的氫鍵，導(dǎo)致酶連續(xù)性合成能力降低，多產(chǎn)生低分子量的Levan多糖。

3.5 合成酶的固定化

利用酶的固定化技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性及循環(huán)利用率，使產(chǎn)物更容易分離純化。Esawy等[57]證明枯草芽孢桿菌NRC33a產(chǎn)的Levan蔗糖酶與戊二醛共價結(jié)合到殼聚糖上可獲得最高固定化率81.51%。Jang K H等[58]將運動發(fā)酵單胞菌Levan蔗糖酶通過離子結(jié)合固定在羥基磷灰石表面后，用于生產(chǎn)低分子量的Levan多糖。Chiang等進(jìn)行運動發(fā)酵單胞菌Levan蔗糖酶的重組表達(dá)，并固定于幾丁質(zhì)上，在蔗糖濃度200 g/L時合成產(chǎn)物83 g/L，比游離酶合成產(chǎn)量提高了66%，并且合成高/低分子量Levan多糖的比例沒有改變。對Levan蔗糖酶進(jìn)行固定化處理在一定程度上不僅可以提高酶的利用率，而且可以簡化后期Levan蔗糖的分離純化程序，節(jié)省大量有機(jī)溶劑的使用。

3.6 酶濃度的影響

根據(jù)不同的酶濃度控制Levan多糖的分子量分布。Jaime R等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168的Levan蔗糖酶反應(yīng)體系中，1 U/mL酶濃度下得到雙峰重均分子量分布；大于5 U/mL高酶濃度下獲得低分子量Levan多糖(平均7.2 kDa)；0.1 U/mL低酶濃度下獲得高分子量Levan多糖(大于2×103kDa)。Raga-Carbajal等[59]發(fā)現(xiàn)低濃度的枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶(0.1 U/mL)通過連續(xù)性機(jī)制合成高分子量Levan多糖(平均2.3×103kDa)。因此，酶濃度不僅影響轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，也影響Levan多糖的平均分子量和分枝數(shù)；且在反應(yīng)過程中由于存在不同果糖親和受體會產(chǎn)生不同分子量的Levan多糖產(chǎn)物。

4 結(jié)語

Levan多糖由于其多樣的生理活性已經(jīng)成為多糖開發(fā)的一個熱點，其制備方法的研究是Levan多糖商業(yè)化利用的前提。目前Levan多糖的工業(yè)化制備還限于微生物發(fā)酵階段，存在著諸多的不足和需要改進(jìn)的地方。而酶法由于反應(yīng)體系簡單、制備工藝簡潔、產(chǎn)率高等優(yōu)點迅速引起廣大研究者的興趣。但是目前生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶率不高，Levan蔗糖酶的分泌過程復(fù)雜等原因造成Levan蔗糖酶活性較低，故而酶法合成Levan多糖還處于實驗研究階段。未來酶法合成Levan多糖的研究可以集中在酶活力的提高及后期Levan多糖的分離純化，例如可以利用基因工程制備工程菌或構(gòu)建重組酶，改善酶活，并且可以通過酶的化學(xué)修飾強化酶的催化性能；而分離純化方面，可以采用耦合其他技術(shù)，如固定化、酶耦合膜技術(shù)等。盡管目前酶法在制備Levan多糖中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，但是隨著研究的深入和創(chuàng)新性成果的不斷涌現(xiàn)，酶法合成Levan多糖必將更加成熟和高效。

[1]Srikanth R,Reddy C H,Siddartha G,et al.Review on production,characterization and applications of microbial Levan[J].Carbohydrate Polymers,2014,120:102-114.

[2]朱明婧,劉博,李飛飛.天然甜味劑研究進(jìn)展與開發(fā)前景分析[J].中國調(diào)味品,2015,40(11):136-140.

[3]李興軍.果聚糖的合成與利用[J].中國食物與營養(yǎng),2010(2):23-26.

[4]Abdel-Fattah A M,Gamal-Eldeen A M,Helmy W A,et al.Antitumor and antioxidant activities of Levan and its derivative from the isolateBacillussubtilis,NRC1 aza[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(2):314-322.

[5]Bondarenko O M,Ivask A,Kahru A,et al.Bacterial polysaccharide Levan as stabilizing,non-toxic and functional coating material for microelement nanoparticles[J].Carbohydrate Polymers,2015,136:710-720.

[6]Stefan O,Sehgelmeble F W.Chemical syntheses of inulin and Levan structures[J].Journal of Organic Chemistry,2002,67(24):8457.

[7]陸娟,唐俊,肖敏,等.Levan果聚糖的應(yīng)用與生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2013,30(6):86-90.

[8]Feng J,Gu Y,Quan Y,et al.Recruiting a new strategy to improve Levan production inBacillusamyloliquefaciens[J].Scientific Reports,2015,5:13814.

[9]Silbir S,Dagbagli S,Yegin S,et al.Levan production byZymomonasmobilisin batch and continuous fermentation systems[J].Carbohydrate Polymers,2014,99(1):454.

[10]Xu X,Gao C,Liu Z,et al.Characterization of the Levan produced byPaenibacillusbovissp.nov BD3526 and its immunological activity[J].Carbohydrate Polymers,2016,144:178-186.

[11]Tian F,Karboune S.Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides by Levansucrase fromBacillusamyloliquefaciens: specificity,kinetics,and product characterization[J].Journal of Molecular Catalysis,2012(82):71-79.

[12]陳華磊,侯殿志,于玥,等.酶法合成中合成酶的應(yīng)用研究[J].中國食品添加劑,2016(6):114-124.

[13]陸娟,盧麗麗,肖敏,等.Levan蔗糖酶及其在Levan果聚糖合成中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,2014,54(6):601-607.

[14]Arvidson S A,Rinehart B T,Gadala-Maria F.Concentration regimes of solutions of Levan polysaccharide fromBacillussp.[J].Carbohydrate Polymers,2006,65(2):144-149.

[15]?ner E T,Hernández L,Combie J.Review of Levan polysaccharide:from a century of past experiences to future prospects[J].Biotechnology Advances,2016,34(5):827-844.

[16]Visnapuu T,Mardo K,Mosoarca C,et al.Levansucrases fromPseudomonassyringaepv.tomato andP.chlororaphissubsp.aurantiaca:substrate specificity,polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation[J].Journal of Biotechnology,2011,155(3):338-349.

[17]Zhang T,Li R,Qian H,et al.Biosynthesis of Levan by Levansucrase fromBacillusmethylotrophicusSK 21.002[J].Carbohydrate Polymers,2014,101(2):975-981.

[18]Ben A Y,Matsubara T,Ito K,et al.Characterization of a thermostable Levansucrase fromBacillussp.TH4-2 capable of producing high molecular weight Levan at high temperature[J].Journal of Biotechnology,2002,99(2):111-119.

[19]Nakapong S,Pichyangkura R,Ito K,et al.High expression level of Levansucrase fromBacilluslicheniformisRN-01 and synthesis of Levan nanoparticles[J].International Journal of Biological Macromolecules,2013,54:30-36.

[20]Lu L,Fu F,Zhao R,et al.A recombinant Levansucrase fromBacilluslicheniformis8-37-0-1 catalyzes versatile transfructosylationreactions[J].Process Biochemistry,2014,49(9):1503-1510.

[21]Feng T,Inthanavong L,Karboune S.Purification and characterization of Levansucrases from in intra- and extracellular forms useful for the synthesis of Levan and fructooligosaccharides[J].Agricultural and Biological Chemistry,2011,75(10):1929-1938.

[22]Belghith K S,Dahech I,Belghith H,et al.Microbial production of Levansucrase for synthesis of fructooligosaccharides and Levan[J].International Journal of Biologycal Mcromolecules,2012,50(2):451-458．

[23]Chiang C J,Wang J Y,Chen P T,et al.Enhanced Levan production using chitin-binding domain fused Levansucrase immobilized on chitin beads[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,82(3):445-451.

[24]Rairakhwada D,Seo J W,Seo M Y,et al.Gene cloning,characterization,and heterologous expression of Levansucrase fromBacillusamyloliquefaciens[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2010,37(2):195-204.

[25]Dahech I,Belghith K S,Belghith H,et al.Partial purification of aBacilluslicheniformis,levansucrase producing Levan with antitumor activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(3):329-335.

[26]Strube C P,Homann A,Gamer M,et al.Polysaccharide synthesis of the Levansucrase SacB fromBacillusmegateriumis controlled by distinct surface motifs[J].Journal of Biological Chemistry,2011,286(20):17593-17600.

[27]Inthanavong L,Tian F,Khodadadi M,et al.Properties ofGeobacillusstearothermophiluslevansucrase as potential biocatalyst for the synthesis of Levan and fructooligosaccharides[J].Biotechnology Progress,2013,29(6):1405-1415.

[28]Hijum S A,Szalowska E,Maj V D M,et al.Biochemical and molecular characterization of a Levansucrase fromLactobacillusreuteri[J].Microbiology (Reading,England),2004,150(3):621-630.

[29]宋廷富,姜騰飛,李茜,等.產(chǎn)大分子Levan的果糖基蔗糖轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2016(2):195-200.

[30]Waldherr F W,Meissner D,Vogel R F.Genetic and functional characterization ofLactobacilluspanis,levansucrase[J].Archives of Microbiology,2008,190(4):497-505.

[31]Jakob F,Mei Bner D,Vogel R F.Comparison of novel GH 68 Levansucrases of levan-overproducing gluconobacter species[J].Acetic Acid Bacteria,2012(1):2.

[32]Menéndez C,Banguela A,Caballeromellado J,et al.Transcriptional regulation and signal-peptide-dependent secretion of exoLevanase (LsdB) in the endophyte gluconacetobacter diazotrophicus[J].Applied & Environmental Microbiology,2009(75):1782-1785.

[33]Arrieta J G,Sotolongo M,Menéndez C,et al.A type II protein secretory pathway required for Levansucrase secretion by gluconacetobacter diazotrophicus[J].Journal of Bacteriology,2004,186(15):5031-5039.

[34]吳菁,劉秀敏,張維,等.枯草芽孢桿菌sacB基因的功能驗證及應(yīng)用[J].核學(xué)報,2008,22(5):590-594.

[35]賈凡,毛自朝,王志遠(yuǎn),等.枯草芽孢桿菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能驗證[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,33(2):154-158.

[36]Hijum S A,Kralj S,Ozimek L K,et al.Structure-function relationships of glucansucrase and fructansucrase enzymes from lactic acid bacteria[J].Microbiology & Molecular Biology Reviews,2006,70(1):157-176.

[37]Ozimek L K,Hijum S A,Koningsveld G A,et al.Site-directed mutagenesis study of the three catalytic residues of the fructosyltransferases ofLactobacillusreuteri121[J].FEBS Letters,2004,560(1-3):131-133.

[38]Lammens W,Roy K L,Schroeven L,et al.Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional implications[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(3):727-740.

[39]Meng G,Fütterer K.Structural framework of fructosyltransfer inBacillussubtilisLevansucrase[J].Nature Structural Biology,2003,10(11):935-941.

[40]李潤靜.產(chǎn)果聚糖蔗糖酶菌株篩選及酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究和Levan果聚糖的酶法合成[D].無錫：江南大學(xué),2013.

[41]Rye C S,Withers S G.Glycosidase mechanisms[J].Current Opinion in Chemical Biology,2000,4(5):573-580.

[42]Lee S S,Yu S,Withers S G.Detailed dissection of a new mechanism for glycoside cleavage: alpha-1,4-glucanlyase[J].Biochemistry,2003,42(44):13081-13090.

[43]Weijers C A,Franssen M C,Visser G M.Glycosyltransferase catalyzed synthesis of bioactive oligosaccharides[J].Biotechnology Advances,2008,26(5):436-456.

[44]Li W,Yu S,Zhang T,et al.Recent novel applications of Levansucrases[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(17):6959-6969.

[45]Méndez-Lorenzo L,Porras-Domínguez J R,Raga-Carbajal E,et al.Intrinsic Levanasactivity ofBacillussubtilis168 Levansucrase (SacB)[J].Plos One,2015,10(11):143394.

[46]Ozimek L K,Kralj S,Maj V D M,et al.The Levansucrase and inulosucrase enzymes ofLactobacillusreuteri121 catalyse processive and non-processive transglycosylation reactions[J].Microbiology,2006,152(4):1187-1196.

[47]Homann A,Biedendieck R,G?tze S,et al.Insights into polymer versusoligosaccharide synthesis:mutagenesis and mechanistic studies of a novel Levansucrase fromBacillusmegaterium[J].Biochemical Journal,2007,407(2):189-198.

[48]Caputi L,Nepogodiev S A,Malnoy M,et al.Biomolecular characterization of the Levansucrase of Erwinia amylovora,a promising biocatalyst for the synthesis of fructooligosaccharides[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2013,61(50):12265-12267.

[49]Visnapuu T,Mardo K,Alam?e T.Levansucrases of aPseudomonassyringaepathovar as catalysts for the synthesis of potentially prebiotic oligo- and polysaccharides[J].New Biotechnology,2015,32(6):1885-1889.

[50]Rairakhwada D,Jeongwoo S,Miyoung S,et al.Gene cloning,characterization,and heterologous expression of Levansucrase fromBacillusamyloliquefaciens[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2010,37(2):195-204.

[51]Park H E,Na H P,Kim M J,et al.Enzymatic synthesis of fructosyl oligosaccharides by Levansucrase from microbacterium laevaniformans ATCC 15953[J].Enzyme & Microbial Technology,2003,32(7):820-827.

[52]Santos-Moriano P,Fernandez-Arrojo L,Poveda A,et al.Levan versus fructooligosaccharide synthesis using the Levansucrase fromZymomonasmobilis:effect of reaction conditions[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2015,119:18-25.

[53]陸娟,肖敏,盧麗麗.地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2011,32(7):183-187.

[54]Porras-Domínguez J R,vila-Fernández,Miranda-Molina A,et al.Bacillussubtilis168 Levansucrase (SacB) activity affects average Levan molecular weight[J].Carbohydrate Polymers,2015,132:338-344.

[55]Olvera C,Centeno-Leija S,López-Munguía A.Structural and functional features of fructansucrases present inLeuconostocmesenteroidesATCC 8293[J].Antonie van Leeuwenhoek,2007,92(1):11-20.

[56]Martinez-Fleites C,Ortiz-Lombardia M,Pons T,et al.Crystal structure of Levansucrase from the gram-negative bacterium gluconacetohacter diazotrophicus[J].Biochemical Journal,2005,390(1):19-27.

[57]Esawy M A,Mahmoud D A R,Fattah A F A.Immobilisation ofBacillussubtilisNRC33a Levansucrase and some studies on its properties[J].Brazilian Journal of Chemical Engineering,2008,25(2):237-246.

[58]Jang K H,Song K B,Kim J S,et al.Production of Levan using recombinant Levansucrase immobilized on hydroxyapatite[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2000,23(1):89-93.

[59]Raga-Carbajal E,Carrillo-Nava E,Costas M,et al.Size product modulation by enzyme concentration reveals two distinct Levan elongation mechanisms inBacillussubtilisLevansucrase[J].Glycobiology,2015,26(4)：377.

Process Control and Mechanism Analysis of Levan Polysaccharide by Enzymatic Synthesis

HUANG Shuang-xia1,3, HOU Dian-zhi1,3, CHEN Hua-lei1,3, YU Yue1,3LAN Wei-bing1,3, WANG Shuai-jing1,3, CHEN Shan1,2,3*

(1.Research Center of Sugar Industry Engineering Technology of Guangxi University, Nanning 530004, China;2.Guangxi Sugar Industry Collaborative Innovation Center, Nanning 530004, China;3.Engineering Center of Sugar Industry and Comprehensive Utilization, Ministry of Education,Nanning 530004, China)

Levan, an extracellular polysaccharide, is composed of β-2,6 glycosidic linkage in the main chain and β-2,1 glycosidic linkage in the branch. Due to the promising physiological effects of prebiotics, reducing blood fat and anticancer, Levan exhibits great potential in food and pharmaceutical industries. Summarize the preparation methods of Levan polysaccharide, process control and mechanism analysis of Levan polysaccharide by enzymatic synthesis.Meanwhile,the existing problems in the process of enzymatic synthesis are discussed and the orientation of further research of Levan polysaccharide by enzymatic synthesis is prospected in the future.

Levan polysaccharide；enzymatic synthesis；Levansucrase；synthesis mechanism；process control

2017-03-18 *通訊作者

國家自然科學(xué)基金項目(21264003)

黃雙霞(1992-)，女，碩士，研究方向：糖廠副產(chǎn)物綜合利用與糖類藥物開發(fā)。

TS244

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.036

1000-9973(2017)09-0145-08