楊芳李康信徐春忠單芬陳武*彭仕明李婉萍李國(guó)清

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642；2.上海市野生動(dòng)物園有限公司，上海，201300；3.廣州動(dòng)物園，廣州，510070)

環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)多位點(diǎn)基因的克隆、測(cè)序及基因分型

楊 芳李康信徐春忠單 芬3陳 武3*彭仕明李婉萍李國(guó)清1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642；2.上海市野生動(dòng)物園有限公司，上海，201300；3.廣州動(dòng)物園，廣州，510070)

稿件運(yùn)行過(guò)程

剛地弓形蟲(chóng)； 基因分型； 環(huán)尾狐猴

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，其宿主范圍十分廣泛，能感染包括人類(lèi)在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?，引起人獸共患寄生蟲(chóng)病[1]。人類(lèi)對(duì)弓形蟲(chóng)普遍易感，據(jù)估計(jì)全球約有1/3的人感染弓形蟲(chóng)，我國(guó)人群弓形蟲(chóng)血清抗體平均陽(yáng)性率為7.88%[2]。本蟲(chóng)的終末宿主為貓及其他貓科動(dòng)物，人、多種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)為其中間宿主。人和動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)主要是通過(guò)食入含有包囊的生的或未煮熟的肉類(lèi)，攝入被卵囊污染的食物或飲水，及垂直傳播[3]。免疫系統(tǒng)正常者感染弓形蟲(chóng)通常表現(xiàn)為無(wú)癥狀的隱性感染，但對(duì)于免疫功能低下或缺陷者(如惡性腫瘤、器官移植或HIV感染者)則可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和全身性播散感染，甚至引起死亡[4]。孕婦感染弓形蟲(chóng)后可通過(guò)胎盤(pán)或者母體生理性免疫應(yīng)答紊亂導(dǎo)致不良妊娠[5]。

剛地弓形蟲(chóng)的基因型有著高度的地域差異性和豐富的遺傳多樣性，目前，DNA序列分析是研究弓形蟲(chóng)基因多態(tài)性的最精確的分子生物學(xué)的方法之一，通過(guò)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、微衛(wèi)星DNA序列分析和多位點(diǎn)DNA序列分析等方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)弓形蟲(chóng)的高分辨率基因分型[6-8]。一系列不同的遺傳位點(diǎn)已經(jīng)作為靶基因應(yīng)用于弓形蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法中，目前應(yīng)用較多的特異性遺傳標(biāo)記是B1基因、SAG2基因和529 bp DNA序列。Burg等[9]在1989年首次對(duì)B1基因進(jìn)行鑒定，B1基因在弓形蟲(chóng)基因組中有35個(gè)拷貝，具有公認(rèn)的高度特異性。袁恒青等[5]對(duì)安徽豬源弓形蟲(chóng)529 bp重復(fù)序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果表明該基因適合作為弓形蟲(chóng)病診斷的靶基因。陳志強(qiáng)等[10]對(duì)弓形蟲(chóng)上海株SAG2基因進(jìn)行克隆與鑒定，并進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)不同宿主和不同區(qū)域上的弓形蟲(chóng)SAG2基因序列差異很小，作為候選疫苗和診斷抗原，有著廣闊的發(fā)展前景。

環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)對(duì)弓形蟲(chóng)有較強(qiáng)的易感性，感染弓形蟲(chóng)后可出現(xiàn)急性死亡。Sureau等[11]在1962年首次從環(huán)尾狐猴身上分離到剛地弓形蟲(chóng)，隨后，有關(guān)環(huán)尾狐猴感染弓形蟲(chóng)的研究相繼被報(bào)道。Dubey等[12]報(bào)道了辛辛那提動(dòng)物園環(huán)尾狐猴由于感染弓形蟲(chóng)而死亡，其傳染源可能是來(lái)自關(guān)在狐猴附近的貓排出的弓形蟲(chóng)卵囊；Spencer等[13]報(bào)道了1頭3歲雌性環(huán)尾狐猴由于急性Ⅱ型弓形蟲(chóng)感染而引起中度肺炎和肝病，最后導(dǎo)致死亡的病例；Yabsley等[14]對(duì)美國(guó)52頭環(huán)尾狐猴進(jìn)行弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率為5.8%(3/52)。我國(guó)弓形蟲(chóng)病的發(fā)現(xiàn)較晚，對(duì)于環(huán)尾狐猴弓形蟲(chóng)病的報(bào)道極少，目前尚未見(jiàn)有關(guān)環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)遺傳進(jìn)化和生物學(xué)特性等方面的研究報(bào)道。本研究首次以環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株為研究對(duì)象，采用多位點(diǎn)DNA序列分析對(duì)中國(guó)廣東地區(qū)環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株進(jìn)行基因分型，旨在探討其基因型以及豐富我國(guó)弓形蟲(chóng)基因型資源庫(kù)，從而為弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源

從廣東某地采集具有典型弓形蟲(chóng)病臨床癥狀的死亡環(huán)尾狐猴心肝肺腎和腦組織。

1.1.2主要試劑

Ex-Taq酶、buffer、MgCl2、dNTPs、DL 2000 DNA Marker、pMD-18 Vector均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒為天根公司產(chǎn)品；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purifiction Kit Ver 4.0質(zhì)粒提取試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病理組織學(xué)觀察

剖檢死亡環(huán)尾狐猴并觀察病理變化。采集心肝肺腎和腦等組織樣品，于10%中性福爾馬林中固定48 h后制作常規(guī)石蠟切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

1.2.2 DNA的提取

將采集的病料組織用滅菌的微型剪刀剪碎，然后加入200 μL的Buffer GA反復(fù)研磨，再加入20 μL的蛋白酶K，混勻后置于54℃恒溫水浴鍋中消化3～4 h(每30 min震蕩混勻1次)。消化好的組織懸液按TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行組織DNA的提取，DNA樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[15]中的10個(gè)分型標(biāo)志物基因特異性引物(其中SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358和PK1為核基因位點(diǎn)，Apico為頂質(zhì)體基因位點(diǎn))，以本次分離的蟲(chóng)株基因組DNA為模版，擴(kuò)增上述10個(gè)基因片段。反應(yīng)體系如下：DNA模板2 μL(約55 ng總DNA)，上下游引物各1 μL(25 μmol/mL)，PCR PremixTaq25 μL，總體積為50 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠中110 V電泳30 min，于紫外透射儀上觀察，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)攝像記錄結(jié)果。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及鑒定

用DNA膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-T Vector上，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取轉(zhuǎn)化好的菌液涂布于加有Amp + IPTG + X-gal的LB固體培養(yǎng)基上，倒置平皿，于37℃溫箱中培養(yǎng)12～16 h，無(wú)菌挑選白色單菌落(每個(gè)PCR產(chǎn)物挑選3個(gè)白色單菌落，作重復(fù)對(duì)照)，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中于37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5序列測(cè)定與同源性分析

陽(yáng)性菌液采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purifiction Kit Ver 4.0試劑盒抽提重組質(zhì)粒，并將質(zhì)粒委托生工生物(上海)公司測(cè)序，測(cè)序采用Sanger法。所得序列運(yùn)用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)，并運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析。

1.2.6系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用Clustalx 1.81及MEGA 5.05軟件對(duì)獲得的弓形蟲(chóng)部分基因位點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)及計(jì)算遺傳距離，然后用MEGA 5.05程序中的鄰接法(neighbor-joining method，NJ)繪制種系發(fā)育樹(shù)，采用Tamura-Nei模型進(jìn)行分析，采用自展檢驗(yàn)(Bootstrap值)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的可靠性，復(fù)制數(shù)為1 000。

2 結(jié)果

2.1病理組織學(xué)變化

肺臟見(jiàn)肺內(nèi)積塵，呈間質(zhì)性肺炎變化，肺泡壁內(nèi)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔中有炎性滲出物(圖1A)；氣管黏膜上皮脫落、出血；氣管固有層內(nèi)見(jiàn)大量淋巴和巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶(圖1B)；肝發(fā)生局灶性壞死性肝炎，見(jiàn)大淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)；腦血管周?chē)[，神經(jīng)元變性，腦皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)炎性粒細(xì)胞結(jié)節(jié)(圖1D)；腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的變性，甚至壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)；心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性、肌間水腫，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1F)。

A：肺；B：肺；C：肝；D：腦；E：腎；F：心A：lung；B：lung；C：liver；D：brain；E：kidney；F：heart圖1 五種臟器的病理組織學(xué)觀察(×400)Fig.1 Histopathological observation of five organs(×400)

2.2 PCR擴(kuò)增

以從環(huán)尾狐猴心肝肺腎組織中提取的基因組DNA為模板，對(duì)SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico這10個(gè)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，分別可見(jiàn)400 bp、550 bp、300 bp、400 bp、350 bp、500 bp、450 bp、400 bp、900 bp和600 bp左右大小的條帶，均與預(yù)期目的片段大小相一致(圖2)，且無(wú)非特異性條帶。

圖2 剛地弓形蟲(chóng)10個(gè)基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 10 gene segments of Toxoplasma gondii 注：M.DL 2000 DNA Marker；1.SAG3位點(diǎn)；2.BTUB位點(diǎn)；3.SAG1位點(diǎn)；4.c29-2位點(diǎn)；5.L358位點(diǎn)；6.GRA6位點(diǎn)；7.PK1位點(diǎn)；8.c22-8位點(diǎn)；9.Apico位點(diǎn)；10.SAG2位點(diǎn)；11.陰性對(duì)照 Note：M.DL 2000 DNA Marker；1.SAG3；2.BTUB；3.SAG1；4.c29-2；5.L358；6.GRA6；7.PK1；8.c22-8；9.Apico；10.SAG2；11.Negative control

2.3測(cè)序與序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示，SAG1基因片段大小為390 bp，SAG2基因片段大小為546 bp，SAG3基因片段大小為311 bp，BTUB基因片段大小為411 bp，GRA6基因片段大小為344 bp，c22-8基因片段大小為521 bp，c29-2基因片段大小為446 bp，L358基因片段大小為418 bp，PK1基因片段大小為903 bp，Apico基因片段大小為614 bp。將測(cè)序所得的10個(gè)基因片段序列與GenBank和ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)下載的典型弓形蟲(chóng)株RH株、ME49株和VEG株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明環(huán)尾狐猴弓形蟲(chóng)株(TgRTL1)在SAG2、SAG3、c22-8、GRA6、PK1位點(diǎn)為基因Ⅱ型；在SAG1、L358、BTUB、c29-2位點(diǎn)為非典型基因型；在Apico位點(diǎn)為基因Ⅰ型(圖3)。

2.4弓形蟲(chóng)部分基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

種系發(fā)育分析結(jié)果顯示，基于L358、PK1、c22-8基因序列以NJ法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基本一致(圖4)，弓形蟲(chóng)RH株和GT1株屬于基因型Ⅰ型，位于同一分支上，弓形蟲(chóng)基因Ⅰ型和Ⅱ型蟲(chóng)株之間得到了較好的區(qū)分。本次所獲環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株(TgRTL1)基于L358、PK1、c22-8基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)均與基因Ⅱ型蟲(chóng)株遺傳距離最近，在遺傳進(jìn)化樹(shù)上處于同一分支。

MarkerSAG1-ChrVIIISAG2-ChrVIIIL358-ChrvNucleotide104192285302337355ALLELE92693594610861329ALLELE35157205ALLELEConsensusGCCGACCGGAATGCRHATGAGTⅠ．．．．．Ⅰ．．GⅠME49．．．．．．ⅡGCTC．ⅡCA．ⅡVEG．．．．．．Ⅲ．．．．GⅢ．．．ⅢTgRTL1．．．．G．U1GCTC．ⅡC．．U1A

Markerc22-8-ChrIbGRA6-ChrXBTUB-ChrIXNucleotide6696168376ALLELE98128163228ALLELE2489126129289ALLELEConsensusAATGCTCACCCGCRH．．CAⅠ．G．．Ⅰ．．．．TⅠME49．．．．ⅡT．．GⅡGGGC．ⅡVEGTG．．Ⅲ．．T．Ⅲ．．．．．ⅢTgRTL1．．．．ⅡT．．GⅡ．．．C．U1B

Markerc29-2-ChrIIIPK1-ChrVINucleotide164680190384403ALLELE3156144249325350437635766ALLELEConsensusGCAGTGGCGACGATCRHA．C．A．ⅠA．AC．．．GTⅠME49．．．A．AⅡ．．．．．．．．．ⅡVEG．G．．．．Ⅲ．A．．TATG．ⅢTgRTL1AG．．．．U1．．．．．．．．．ⅡC

MarkerApicoSAG3-ChrXIINucleotide150528ALLELE118145189ALLELEConsensusTCGTGRH．．ⅠC．．ⅠME49C．Ⅱ．CAⅡVEG．TⅢ-．．ⅢTgRTL1．．Ⅰ．CAⅡD

圖3環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)10個(gè)遺傳標(biāo)記基因多態(tài)性分析

Fig.3.Polymorphisms at 10 genetic markers by direct PCR-DNA sequencing ofToxoplasmagondiiisolates fromLemurcattafrom China

注：A、B、C、D分別為SAG1，SAG2，L358基因位點(diǎn)；c22-8，GRA6，BTUB基因位點(diǎn)；c29-2，PK1基因位點(diǎn)和Apico，SAG3基因位點(diǎn)的DNA序列分析。Consensus序列由至少2個(gè)典型Type I，II和III基因型的共同等位基因組成。使用RH株作為參考蟲(chóng)株，其序列登錄號(hào)GQ253075，M33572，EU258490，AM055943，JX044183，JX045446 和 L42007分別對(duì)應(yīng)SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB和PK1基因位點(diǎn)，c29-2，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進(jìn)行blasted搜索；使用ME49株作為參考蟲(chóng)株，其序列登錄號(hào)XM_018781602，XM_018781958和XM_002371898分別對(duì)應(yīng)SAG2，L358和GRA6基因位點(diǎn)，SAG1，c22-8，BTUB，c29-2，PK1，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進(jìn)行blasted搜索；使用VEG株作為參考蟲(chóng)株，其序列登錄號(hào)LN714498，LN714498，LN714494，LN714490，LN714500，LN714499，LN714492和LN714495分別對(duì)應(yīng)SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB，c29-2和PK1基因位點(diǎn)，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進(jìn)行blasted搜索?！?”指代和consensus序列相一致；“-”指代基因的插入或缺失?！皍”指代非典型等位基因；I，II 和III分別指TypeⅠ，Ⅱ和Ⅲ基因型分離株的典型等位基因序列

Note：DNA sequence analysis at(A)SAG1，SAG2，L358；(B)c22-8，GRA6，BTUB；(C)c29-2，PK1 and(D)Apico，SAG3.Consensus sequence is defined as the nucleotide shared by at least two of the three archetypal Type I，II and III strain alleles.GenBank accession no.GQ253075，M33572，EU258490，AM055943，JX044183，JX045446 and L42007 for SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB and PK1 respectively，for c29-2，Apico and SAG3 the amplicon was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding RH sequence used as the reference；GenBank accession no.XM_018781602，XM_018781958 and XM_002371898 for SAG2，L358 and GRA6 respectively，for SAG1，c22-8，BTUB，c29-2，PK1，Apico and SAG3 the amplicon was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding ME49 sequence used as the reference；GenBank accession no.LN714498，LN714498，LN714494，LN714490，LN714500，LN714499，LN714492 and LN714495 for SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB，c29-2and PK1 respectively，for Apico and SAG3 was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding VEG sequence used as the reference.“.”indicates identity with consensus；“-”indicates an insertion/deletion.“u”indicates a nonarchetypal allele；Ⅰ，Ⅱ or Ⅲ refers to an archetypal allelic sequence from a Type Ⅰ，Ⅱ or Ⅲ strain

圖4 弓形蟲(chóng) L358(A)、PK1(B)、c22-8(C)基因以NJ法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on L358(A)，PK1(B)，c22-8(C)gene of Toxoplasma gondii by neighbor-joining (NJ)method

2.5 弓形蟲(chóng)基因分型

采用10個(gè)遺傳位點(diǎn)，對(duì)本室分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，對(duì)其進(jìn)行基因分型，共揭示了1個(gè)基因型(ToxoDB#3)(表1)。

表1 中國(guó)廣州環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株基因型

Tab.1 Multi-locus genotypes of Toxoplasma gondii isolates from Lemur catta from Guangzhou，China

3 討論

將廣東某地圈養(yǎng)感染弓形體死亡的環(huán)尾狐猴的心肝肺腎和腦組織制作石蠟切片，觀察其病理組織變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎的變化、肝發(fā)生局灶性壞死性肝炎、腎小管上皮細(xì)胞不同程度的變性和壞死變化、腦神經(jīng)元變性，腦皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)炎性粒細(xì)胞結(jié)節(jié)和心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等變化，這些與王小波[16]等報(bào)道的豬感染弓形蟲(chóng)主要病理組織學(xué)變化基本一致。

傳統(tǒng)的弓形蟲(chóng)基因型分類(lèi)基于弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠的毒力強(qiáng)弱可將其分為typeⅠ型、typeⅡ型和typeⅢ型。typeⅠ型蟲(chóng)株為強(qiáng)毒株(LD100=1 parasite)，typeⅡ型和type Ⅲ型蟲(chóng)株為弱毒株(LD50>1 000 parasites)。隨著PCR及其衍生技術(shù)在弓形蟲(chóng)分離株的基因鑒定和分型中的廣泛應(yīng)用，對(duì)弓形蟲(chóng)有了更廣泛深入的研究，越來(lái)越多的弓形蟲(chóng)克隆世系被研究者們發(fā)現(xiàn)。研究表明，世界各地的弓形蟲(chóng)株基因型具有豐富的遺傳多態(tài)性，王林等[3]對(duì)世界各地區(qū)弓形蟲(chóng)株種群結(jié)構(gòu)分布概況的研究顯示，typeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型為流行于北美和歐洲的優(yōu)勢(shì)基因型；流行南美洲的弓形蟲(chóng)具有復(fù)雜的遺傳多態(tài)性，主要包括BrⅠ型、BrⅡ型、BrⅢ型和BrⅣ型，此外還有少數(shù)其他的基因型，如：ToxoDB#65型、ToxoDB#7型等；流行于非洲的弓形蟲(chóng)分離株基因型主要以Ⅱ型和Ⅲ型為主，此外，Africa1型和Africa3型亦為流行非洲的弓形蟲(chóng)株優(yōu)勢(shì)基因型。然而對(duì)于我國(guó)流行的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株基因型方面的研究尚十分欠缺，本研究在廣東省1只發(fā)生弓形蟲(chóng)病死亡的環(huán)尾狐猴中分離得到弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株(TgRTL1)，并采用多位點(diǎn)PCR-DNA測(cè)序法進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果顯示其基因型為T(mén)oxoDB#3。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于L358、PK1、c22-8基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)具有一致性，均與屬于基因Ⅱ型的PTG株和ME49株位于同一分支，而屬于基因Ⅰ型的RH株和GT1株位于另一分支，這表明L358、PK1和c22-8基因能作為遺傳標(biāo)記區(qū)分剛地弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株。

PCR-DNA測(cè)序是對(duì)生物遺傳信息鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，是研究弓形蟲(chóng)基因多態(tài)性的最精確的分子生物學(xué)的方法之一。Fraz?o-Teixeira等[17]采用PCR-RFLP和PCR-DNA測(cè)序法分析來(lái)源于豬的弓形蟲(chóng)分離株的基因，對(duì)兩種方法進(jìn)行對(duì)比研究，認(rèn)為PCR-DNA測(cè)序法比PCR-RFLP方法更能有效地發(fā)現(xiàn)非典型等位基因，并且PCR-RFLP技術(shù)對(duì)于存在大量非典型等位基因的部分地區(qū)分離株很難做出準(zhǔn)確的基因分型，而PCR-DNA測(cè)序法卻能彌補(bǔ)PCR-RFLP技術(shù)的這一不足，能對(duì)含有較多非典型等位基因的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株做出準(zhǔn)確分型。Binas等[18]對(duì)DNA聚合酶α基因的625 bp的內(nèi)含子進(jìn)行序列分析，進(jìn)而鑒定10株屬于兩個(gè)不同世系的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株是有毒力的。

我國(guó)地域遼闊，動(dòng)物種類(lèi)繁多，但研究顯示，流行于中國(guó)的弓形蟲(chóng)分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且以Chinese 1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢(shì)基因型[2，19-21]。本研究對(duì)從廣東分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株采用PCR-DNA測(cè)序法進(jìn)行基因型分析，結(jié)果顯示其基因型為T(mén)oxoDB#3(表1)，該基因型亦在分離自中國(guó)青海的綿羊、新疆維吾爾自治區(qū)的鳥(niǎo)類(lèi)弓形蟲(chóng)中有過(guò)報(bào)道[22]。同時(shí)，Zhou等[23]應(yīng)用PCR-RFLP分析17株來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)不同宿主的弓形蟲(chóng)株基因型，結(jié)果顯示，12株(70.6%)屬于ToxoDB#3；Dubey等[24]報(bào)道的17株從廣東分離到的貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)中，15株(88%)屬于ToxoDB#3型譜系。這些數(shù)據(jù)表明我國(guó)弓形蟲(chóng)不僅有優(yōu)勢(shì)基因型Chinese 1型流行，ToxoDB#3也是中國(guó)大陸流行的主要世系之一。

基因型ToxoDB#3在斯里蘭卡、哥倫比亞、越南和澳大利亞的狗源和貓?jiān)垂蜗x(chóng)分離株中亦有過(guò)報(bào)道，這表明它在亞洲、澳洲和南美也普遍流行[25-28]。本研究對(duì)廣東環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株進(jìn)行基因分型，運(yùn)用DNA序列分析法對(duì)10個(gè)遺傳位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染廣東環(huán)尾狐猴的弓形蟲(chóng)株基因型為T(mén)oxoDB#3型，進(jìn)一步驗(yàn)證了我國(guó)弓形蟲(chóng)株優(yōu)勢(shì)基因型不僅有Chinese 1型，且ToxoDB#3也有廣泛的分布。同時(shí)豐富了我國(guó)現(xiàn)有的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株基因庫(kù)的數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步探討我國(guó)弓形蟲(chóng)生物學(xué)、流行病學(xué)、弓形蟲(chóng)病的診斷和疫苗的研究提供了理論依據(jù)。

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Toxoplasmagondii； Genotyping； Ring-tailed lemur (Lemurcatta)

為確定引起廣東環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)疑似弓形蟲(chóng)病的病原，從2只死亡的環(huán)尾狐猴體內(nèi)無(wú)菌采集肺臟、肝臟、心、腎和腦等組織制作常規(guī)石蠟切片，HE染色。通過(guò)病理組織學(xué)觀察，鑒定為弓形蟲(chóng)(Toxoplasmasp.)后，采用PCR-DNA測(cè)序分析方法對(duì)環(huán)尾狐猴源分離蟲(chóng)株(TgRTL1)的SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L358、PK1、c22-8、c29-2和Apico基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，采用DNAStar和MEGA5.05軟件，將所獲序列與網(wǎng)上下載的弓形蟲(chóng)RH株、ME49株和VEG株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，從廣東分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)株，在10個(gè)遺傳位點(diǎn)經(jīng)PCR-DNA測(cè)序分析，確定該蟲(chóng)株的基因型為T(mén)oxoDB#3。本研究是對(duì)中國(guó)環(huán)尾狐猴源弓形蟲(chóng)采用多位點(diǎn)DNA序列分析進(jìn)行基因型鑒定的首次報(bào)道，為進(jìn)一步研究我國(guó)弓形蟲(chóng)流行病學(xué)、生物學(xué)特性以及弓形蟲(chóng)病的診斷提供了科學(xué)理論依據(jù)。

Multi-Locus Genotyping of the Toxoplasma gondii Isolated from Captive Ring-Tailed Lemur (Lemur catta)in China

Yang Fang1Li Kangxin1Xu Chunzhong2Shan Fen3Chen Wu3*Peng Shiming3Li Wanping3Li Guoqing1*

(1.South China Agricultural University，Guangzhou，510642，China；2.Shanghai Wild Animal Park Company Limited，Shanghai，201300，China；3.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China)

To determine the pathogen of a case suspected toxoplasmosis in lemurs in Guangdong，we sampled tissues of lung，liver，heart，kidney and brain from two dead ring-tailed lemurs and made routine paraffin sections for HE staining.After the pathogen was identified asToxoplasmaby pathological histology observation，10 genetic markers of theT.gondiistrain (TgRTL1)，including 9 nuclear loci of SAG1，SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，L358，PK1，c22-8，c29-2 and an apicoplast locus of Apico were amplified，cloned and sequenced.The nucleotide variations and sequence similarities amongT.gondiistrains were analyzed by software DNAStar and MEGA version 5.05，and a phylogenetic tree was constructed.The result indicated that theT.gondiiisolates fromLemurcattain Guangdong belong to the genotype of ToxoDB#3 according to 10 genetic markers.This study is the first report of genotyping of theT.gondiiisolates fromLemurcattain China by multi-locus DNA sequencing，and provides basis for research onT.gondiiepidemiology and its biological characteristics，and the diagnosis of toxoplasmosis in future.

楊芳，女，24歲，碩士研究生；主要從事獸醫(yī)寄生蟲(chóng)研究。

*通訊作者：陳武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com；李國(guó)清，E-mail：gqLi@scau.edu.cn

2016-11-18

S852.73

A

修回日期：2016-12-06

發(fā)表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-187-07