王 健，鞏佳昕，劉 念，徐 穎，祁 琪，楊靈芝，沈露露，房興堂*，李 軍

（1.江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州 221116；2.江蘇師范大學科文學院，江蘇徐州 221116；3.睢寧縣隴西養(yǎng)羊專業(yè)合作社，江蘇睢寧 221200）

湖羊miR-29a、miR-125b、miR-487b不同生長時期組織表達譜初步分析

王 健1，鞏佳昕2，劉 念1，徐 穎1，祁 琪1，楊靈芝1，沈露露1，房興堂1*，李 軍3

（1.江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州 221116；2.江蘇師范大學科文學院，江蘇徐州 221116；3.睢寧縣隴西養(yǎng)羊專業(yè)合作社，江蘇睢寧 221200）

本研究旨在探究miR-29a、miR-125b、miR-487b在湖羊不同生長時期各組織中的表達情況，以了解它們在湖羊肌肉發(fā)育中的作用。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-29a在湖羊不同生長時期中差異表達，并在各組織中有著不同的表達模式，其中在背最長肌中的表達顯著高于其他肌肉組織和內(nèi)臟組織；miR-125b只在胎羊和成年羊心肌和背最長肌中的表達相對容易檢測，并且在成年羊中的表達明顯低于胎羊。結果表明：miR-125b在湖羊的生長發(fā)育過程中表達量下調(diào)；miR-487b在湖羊胎羊的不同組織中都有相應的表達，并且在肌肉組織中的表達明顯高于其他組織，而在成年羊的相對應的組織中表達量都呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，且背最長肌、腿肌和胸肌的下調(diào)趨勢與胎羊相應的組織都有顯著差異。

湖羊；miR-29a；miR-125b；miR-487b；表達譜

湖羊是我國太湖流域的重要經(jīng)濟型家畜之一，是皮肉兼用型的優(yōu)良綿羊品種，有著性早熟、常年發(fā)情、每年兩胎、一胎多只羔羊、生長發(fā)育周期短等諸多優(yōu)良特性。肌肉是動物機體的重要組成部分，其中骨骼肌大約占機體總重量的40%[1-2]。骨骼肌細胞來源于胚胎的中胚層和胚胎的外胚層，經(jīng)分化形成塊狀樣的組織。在動物骨骼肌發(fā)育過程中，來源于體節(jié)的細胞經(jīng)過增殖、終端分化等過程，之后形成具有多核的肌纖維[3]，該過程受到各種信號通路以及內(nèi)部環(huán)境改變的調(diào)控，導致特異性轉錄因子的激活以及隨后相關基因表達的重編程。

MicroRNAs（miRNAs）是非編碼的RNA的家族之一，大約由22個核苷酸組成，它們在轉錄后水平發(fā)揮著調(diào)控基因表達的作用。miRNAs通過與靶基因的3'非編碼區(qū)發(fā)生作用，使基因表達沉默或者抑制靶基因的表達活性的過程，已經(jīng)被證實參與動物機體發(fā)育的多個過程，包括組織的形成、器官的發(fā)育以及一些細胞學過程，比如細胞凋亡、細胞周期調(diào)控和信號分子的轉運等過程，并發(fā)揮著至關重要的作用[4-5]。很多調(diào)控肌肉發(fā)育方面的肌肉特異性miRNAs被先前許多的研究所鑒定和表征，相比之下，目前研究最熱的miRNAs是microRNA-1或microRNA-206、microRNA-133、microRNA-208和microRNA-499家族，它們調(diào)控包括在肌源性轉錄因子作用下的肌肉衛(wèi)星細胞和成肌細胞的增殖和分化等肌肉生成的基本過程[6]。

同時，近年來許多研究表明，很多非肌肉特異性microRNAs通過與成肌因子相互作用也是調(diào)控肌肉發(fā)育所必需的，miR-29a、miR-125b和miR-487b在調(diào)控肌肉發(fā)育方面有相關的功能。在肌肉發(fā)育期間，YY1蛋白通過抑制肌肉發(fā)育后期分化基因，如α-肌動蛋白、肌酸蛋白、肌球蛋白重鏈II-b基因的合成，進而抑制肌肉細胞的分化，miR-29a可以直接結合并作用于YY1基因的3'非編碼區(qū)（UTR），減少YY1的抑制作用，從而促進肌細胞的分化[7]。miR-125b，一個新發(fā)現(xiàn)的肌源性microRNA，在肌肉生成的過程中表達量下降，并負調(diào)控體外培養(yǎng)的C2C12成肌細胞的分化[8]。miR-487b是一個肌肉分化相關的新microRNA，它的功能很大程度上也還是未知的，而且僅有極少數(shù)的研究報道其在肌肉發(fā)育相關的作用。湖羊作為肉用綿羊的品種之一，研究其肌肉發(fā)育的調(diào)控機制極其重要。目前，microRNA對湖羊肌肉發(fā)育影響的研究報道不多。本實驗在前人研究基礎上，擬用實時熒光定量PCR技術，分別檢測miR-29a、miR-125b、miR-487b在湖羊胎羊和成年羊心、肝、脾、肺、腎、腸、背最長肌、腿肌、胸肌、脂肪10個組織中的相對表達量，為研究湖羊的肌肉發(fā)育和相關調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗從徐州市某湖羊養(yǎng)殖場，分別采取3只健康湖羊成年羊和胎羊的心、肝、脾、肺、腎、腸、背最長肌、腿肌、胸肌、脂肪10個組織。用經(jīng)過高壓滅菌之后的0.9%生理鹽水，清洗去除血污和其他雜質(zhì)，用經(jīng)過高壓滅菌處理過的錫箔紙包好后置于事先準備好的液氮罐中，迅速帶回實驗室開展實驗。

1.2 引物設計與合成 依據(jù)miRbase（http://www. mirbase.org/）已收錄并公布的綿羊miRNA-29a、miR-125b和miR-487b的成熟序列，序列號分別為MIMAT0014967、MIMAT0014971、MIMAT001 9295設計相應的反轉錄引物和實時熒光定量PCR引物。由生物工程（上海）股份有限公司合成用于反轉錄實驗的引物和熒光定量PCR的引物，并用Primer BLAST和Bio XM 2.6等進行引物分析。引物詳見表1。

1.3 RNA的提取和反轉錄 用RNAiso Plus試劑，按照Trizol法原理提取湖羊胎羊、成年羊的心、肝、脾等組織的總RNA。用Nanodrop 2000C分光光度計檢測湖羊各組織的總RNA濃度和純度（D260/ D280和OD260/OD230）。測完各組織總RNA濃度之后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的相應組織總RNA的完整性。

根據(jù)PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒的說明書將提取的各組織總RNA反轉錄成cDNA。反應的總體系為20 μL：2 μL 5xgDNA Eraser Buffer，2 μg的總RNA，1 μL gDNA Eraser，用RNase Free H2O加至10 μL ，注意維持低溫操作環(huán)境，最好在冰盒上操作，混勻后放入PCR儀器中42℃2 min。2 min后，暫停上述反應，在該反應液中依次加入1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μL RT Prime Mix，1 μL miRNA（miR-29a，miR-125b，miR-487b）反轉錄特異性引物，4 μL 5×Prime Script Buffer 2，3 μLRNase Free H2O（可提前按相應的使用量配好分裝），繼續(xù)上述的PCR反應，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 s。反應結束后將反轉錄所得的cDNA儲存于-20℃?zhèn)溆?，若要長久使用，則需置于-80℃冰箱。

表1 MicroRNA的反轉錄和實時熒光定量PCR引物

1.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR的總反應體系為15 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII試劑7.5 μL，Rox Reference Dye 0.3 μL，cDNA模板0.6 μL，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 5.4 μL。使用ABI Step OnePlus實時熒光定量PCR儀進行定量分析實驗，每個樣品的表達量均以各組織18S核糖體RNA的表達量為參照，各個組織間的相對表達以心臟為參照進行比對。PCR反應程序為95℃進行預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火1 min，共進行40個循環(huán)，循環(huán)結束之后對熔解曲線進行相關分析。每個組織進行3次技術性重復，且每進行1次實驗都設空白管作為對照。

1.5 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法對實時熒光定量PCR儀的數(shù)據(jù)進行處理、計算各組織Ct值并分析miR-29a、miR-125b、miR-487b在湖羊胎羊和成年羊組織之間的相對表達量。實驗結果經(jīng)IBM SPSS Statistics 22軟件進行均值、單因素方差、多重比較等統(tǒng)計分析，并使用GraphPad Prism5軟件作圖分析，各個組織3個miRNA的相對表達量以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 總RNA的質(zhì)量檢測 Nanodrop 2000C分光光度計測定總RNA純度，OD260/OD280均在1.95～2.05，說明提取的各組織總RNA樣品質(zhì)量較高。隨后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA條帶完整性，28S和18S 2條帶清晰明亮，5S條帶較暗，依稀可以看出，可用于后續(xù)的實驗（圖1）。

圖1 總RNA條帶檢測電泳圖

2.2 熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析 通過對定量實驗熔解曲線分析，miR-29a、miR-125b、miR-487b及18S核糖體RNA基因的熔解溫度分別為80.37、80.67、80.37、83.35℃，且這3個microRNA和內(nèi)參18S的熔解曲線都呈單一峰，沒有引物非特異性峰（圖2）。

圖2 湖羊各組織基因溶解曲線

2.3 miR-29a、miR-125b和miR-487b 在湖羊胎羊和成年羊各組織中的表達譜 如圖3所示，miR-29a在胎羊時期各組織中都有表達，其中在背最長肌中的表達量最高，為5.82，與在心肌中表達量差異極顯著（P＜0.01）；其次，miR-29a在肺、脾和肝的表達量也相對較高，依次為3.54、2.69和1.93，與在心肌中的表達量相比，它們之間表達量差異分別達到極顯著（P＜0.01）和顯著水平（P＜0.05）；脂肪和腎的表達量為0.79和0.66（P＞0.05）；腸、腿肌和胸肌的表達量為0.28、0.23和0.26（P＜0.05）。miR-29a在成年羊的背最長肌中表達量最高，為1.78，與心肌的表達量差異極顯著（P＜0.01）；脾、肺的表達量為0.59和0.64（P＞0.05）；肝、腎、腸、腿肌、胸肌和脂肪的表達量依次為0.04、0.19、0.04、0.38、0.16和0.10（P＜0.05）。在不同生長發(fā)育時期的湖羊各個組織中，miR-29a在湖羊胎羊和成年羊的背最長肌中的表達相比其他組織都很高，分別為5.82和1.78，其中miR-29a在湖羊胎羊背最長肌中的表達量最高。

圖3 miR-29a在湖羊胎羊和成年羊各組織中的相對表達情況

如圖4所示，在胎羊的各個組織中，miR-125b在背最長肌中的表達量最高，值為2.38，其次為肺和腿肌，分別為0.31和0.23，均與心肌的表達量差異極顯著（P＜0.01）；miR-125b在肝等其他組織中的表達量較低。在成年羊的各組織中，背最長肌、腿肌和胸肌的表達量依次為0.82、0.12和0.11，肝、脾等組織的表達量相比心肌值很低。從2個時期的湖羊各組織相對表達量可以看出，miR-125b在背最長肌中的表達量較其他組織中的表達量都很高，且miR-125b在胎羊背最長肌中的表達高于成年羊。

圖4 miR-125b在湖羊胎羊和成年羊各組織中的相對表達情況

如圖5所示，miR-487b在湖羊胎羊的各個組織中都有表達，其中在背最長肌中的相對表達量最高，為16.92，與心肌中表達量差異極顯著（P＜0.01）；腸、腿肌、胸肌和脂肪的相對表達量依次為9.18、10.04、7.52和9.60（P＜0.01）；肝、脾的相對表達量分別為2.72、4.62（P＜0.05）；肺、腎的相對表達量為1.15、1.48（P＞0.05）。在成年羊的各個組織中，miR-487b也是在背肌中的表達量最高，為2.23（P＜0.01）；脾、肺、腎、腿肌、胸肌的表達量分別為0.21、0.40、0.75、0.33、0.16。miR-487b在成年羊的肝、腸和脂肪組織中的表達量很低，與胎羊相比表達量明顯減少；在胎羊和成年羊的背肌中，miR-487b的表達量都很高，且在胎羊背肌中的表達量比成年羊的表達量高出7倍。

圖5 miR-487b在湖羊胎羊和成年羊各組織中的相對表達情況

2.4 3個不同的miRNA在湖羊胎羊和成羊時期的相對表達量分析 將miR-487b在湖羊胎羊心組織中的表達量看成1。從圖6可以看出，miR-487b、miR-29a和miR-125b在湖羊胎羊肌肉相關組織中有著高表達量，其中miR-487b在胎羊脂肪中也有相對較高的表達（P＜0.01）；此外，miR-487b、miR-29a和miR-125b在胎羊肝組織的表達量較其他組織相比均處在顯著水平（P＜0.05）；同樣，將miR-487b在湖羊成年羊心組織中的表達量看成1，如圖7所示，miR-487b和miR-125b在成年羊背肌中高表達，分別處在極顯著水平（P＜0.01）和顯著水平（P＜0.05），而miR-29a在成年羊背肌中的表達與心肌相比較差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 3個不同的miRNA在湖羊胎羊組織中的相對表達情況

圖7 3個不同的miRNA在湖羊成年羊組織中的相對表達情況

3 討 論

目前，關于miRNAs參與調(diào)控哺乳動物肌肉增殖和分化的研究越來越多，并且揭示了許多miRNAs的靶基因和生長發(fā)育相關的調(diào)控因子的功能。在骨骼肌發(fā)育的過程中，一些miRNAs在骨骼肌細胞特異性表達，并在分化的過程中有著差異性表達[9]。許多調(diào)控肌肉組織發(fā)育的特異性miRNA，除了功能熟知的miR-1、miR-133、miR-206家族以外，miR-486、miR-499等肌肉特異性miRNA也在調(diào)控肌肉的發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺作用[10-12]。然而，許多非肌肉特異性miRNAs在此過程中也發(fā)揮著關鍵作用，比如miRNA-378、miR-214、miR-148a、miR-374b、miR-29a、miR-125b等，肌肉發(fā)育相關的基因如MyF6、Ezh2、MEF2、 Mef2A和YY1，都受這些非肌肉特異性miRNAs調(diào)控；IGFII、Cdc25A等其他基因也被證實受這些miRNAs調(diào)控，在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮著作用。在增殖的成肌細胞中，NF-κB基因負調(diào)控肌纖維相關基因的表達。NF-κB基因在轉錄水平肌球蛋白輕鏈、肌球蛋白重鏈基因和α-肌動蛋白等肌纖維相關基因在增殖未分化的成肌細胞中活力 ，使其沉默。YY1作為一個轉錄抑制因子，可以在未分化的成肌細胞中抑制肌球蛋白重鏈IIb和α-肌動蛋白基因的活力，并且NF-κB基因可以通過調(diào)控YY1基因來發(fā)揮抑制作用[13]。YY1基因是MiR-29a的靶基因，miR-29a的高表達，可以抑制YY1基因的活性，從而促進成肌細胞向肌纖維分化。miR-125家族有2個成員，分別是miR-125a和miR-125b，它們在老鼠的大腦組織中表達量較高，然而在除了大腦以外的其他組織中也可以檢測到miR-125b的表達。miR-125b可以直接作用于IGF-II基因——肌生成過程中關鍵基因，調(diào)控著骨骼肌的生成；miR-125b還在調(diào)控山羊皮膚組織被毛生長過程中發(fā)揮著重要作用[14]。miR-487b作為一個新的miRNA，在分化的C2C12細胞中表達下調(diào)，并且在C2C12細胞中，轉染合成過表達的miR-487b能顯著減少成肌分化因子的表達。這3個miRNAs在大型哺乳動物中的功能研究相對較少，很多研究都是建立在小鼠的成肌細胞系（C2C12）的基礎上，其中，尤其是對miR-487b在哺乳動物中的相關功能的研究更少。

湖羊作為重要的經(jīng)濟性家畜之一，研究其生長發(fā)育包括肌肉發(fā)育的相關調(diào)控機制至關重要。從本實驗結果可知，miR-29a和miR-125b在肌肉組織中的表達量高于其他非肌肉組織，其中尤其是在胎羊的肌肉組織中，這與Wang等[15]和韋偉等[16]的研究結果一致。miR-487b也在一些研究中，預測通過作用于胰島素受體底物基因來修復和調(diào)控骨骼肌發(fā)育[17-18]。miR-29a、miR-125b和miR-487b調(diào)控湖羊肌肉發(fā)育的研究甚少，本實驗通過熒光定量PCR檢測miR-29a、miR-125b以及miR-487b在不同時間湖羊的不同組織中表達，發(fā)現(xiàn)這3個miRNA在湖羊胎羊組織中的表達量都明顯高于在湖羊成年羊組織中的表達量，可以推測出這3個miRNA在湖羊的成長發(fā)育過程中發(fā)揮著作用，并且在背肌組織中都有著相對較高的表達量；在湖羊胎羊時期，miRNA-29a、miR-125b和miR-487b在肌肉組織中的相對表達量都高于其他非肌肉組織，與許多前人的研究結果相一致，并且在胎羊組織中的表達量均大于在成年羊組織中的表達量，其中，在胎羊背肌組織中表達量最高。miR-487b尤為突出，不僅在胎羊以及成年羊的組織中呈現(xiàn)差異性表達，而且不同年齡段的時空差異性表達顯著，其在成年羊肌肉組織中的表達量明顯下調(diào)，推測它或許參與湖羊肌肉細胞的增殖和分化過程，并在湖羊的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，同時miR-29a和miR-125b在胎羊各組織中的表達高于成年羊，間接說明它們在調(diào)控湖羊發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。

4 結 論

miR-29a在湖羊胎羊組織中的表達明顯多于成年羊組織，且背肌中表達量最高；miR-125b只在心肌和背肌組織中檢測到明顯的表達，其他組織的表達趨勢不明顯；miR-487b在湖羊胎羊的肌肉組織和脂肪組織中的表達量較高，比較不同生長時期的湖羊發(fā)現(xiàn)，在成年羊的肌肉組織中表達趨勢明顯下調(diào)，可以間接推測miR-487b在調(diào)控湖羊胎羊肌肉發(fā)育相關的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用；且這3個miRNA在湖羊胎羊到成年羊的生長過程中，體現(xiàn)出時空差異性表達，并有下調(diào)表達的趨勢。這些實驗結果，可以為后續(xù)的篩選和研究調(diào)控湖羊肌肉發(fā)育的miRNAs提供重要的參考依據(jù)。

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Tissue Expression Pattern Analysis of miR-29a, miR-125b and miR-487b in the Dif f erent Growth Period of Hu Sheep

WANG Jian1, GONG Jia‐xin2, LIU Nian1, XU Ying1, QI Qi1, YANG Ling‐zhi1, SHEN Lu‐lu1, FANG Xing‐tang1*, LI Jun3

(1.College of Life Science, Jiangsu Normal University, Jiangsu Xuzhou 221116,China; 2. Kewen College, Jiangsu Normal University, Jiangsu Xuzhou 221116, China; 3. Longxi Sheep Raising Rofessional Cooperatives of Suining Country, Jiangsu Suining 225009, China)

The aim of this study is to explore the expression of miR‐29a, miR‐125b and miR‐487b in the tissues of dif f erent growth period of Hu sheep and to understand how they play functions in the Hu sheep development. Real‐time quantitative PCR (qRT‐PCR) was used to fi nd that the expression of miR‐29a is diverse in dif f erent tissues in two growth period of Hu sheep. The expression of miR‐29a in the longissimus dorsi muscle is higher than other muscle tissues and visceral tissue obviously. The expression of miR‐125b can only be easily detected in the heart and longissimus dorsi in the fetal Hu sheep, the expression of miR‐125b in mature Hu sheep is lower than the fetal. It indicated that the expression of miR‐125b is reducing in the growth and development of Hu sheep. The miR‐487b was expressed in dif f erent tissues in the fetal Hu sheep and the expression of it is more high in the muscle tissue than other tissues. While in the mature sheep, the expression of miR‐487b is down regulation. In addition, the expression of miR‐487b is down‐regulating in the longissimus dorsi muscle, legs and pectoral muscles markedly.

Hu sheep;miR‐29a;miR‐125b;miR‐487b;Expression prof i le

S827.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-042

2017-02-06；

2017-02-28

江蘇省科技計劃項目（BN2016014、BN201502 7）；徐州市科技計劃項目（KC15N0013、KC16NX073）；江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510320041Z）；江蘇師范大學生科院大創(chuàng)項目（201603003）；江蘇師范大學?？蒲谢鹨话沩椖浚?1XLB04）

王健（1992-），男，江蘇鹽城人，在讀碩士生，研究方向為動物生物化學與分子生物學， E-mail：1030616289@qq.com

*通訊作者：房興堂，E-mail：xtfang@163.com