郭詩萌，劉世超,2，劉忠華,3*

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江省細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

豬胚胎發(fā)育與胚胎工程研究進(jìn)展

郭詩萌1，劉世超1,2，劉忠華1,3*

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江省細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

編者按

2017年《中國畜牧雜志》全面改版。為更好展示畜牧學(xué)領(lǐng)域的科技前沿，促進(jìn)學(xué)術(shù)交流，本刊特別邀請不同領(lǐng)域的專家或青年骨干，圍繞各自的研究領(lǐng)域，介紹自己、團(tuán)隊(duì)或國際研究機(jī)構(gòu)近幾年的研究成果、存在問題及研究展望，或就當(dāng)前的研究熱點(diǎn)問題進(jìn)行討論和評論。2017年第一期自副主編開始，將為讀者帶來相關(guān)綜述，希望能引發(fā)讀者對相關(guān)熱點(diǎn)、難點(diǎn)的思考，并進(jìn)行深入探討。

早期胚胎發(fā)育研究是認(rèn)知特定物種個(gè)體發(fā)生、發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)，胚胎工程研究是實(shí)現(xiàn)按照人類的意愿對個(gè)體進(jìn)行遺傳性狀改變的主要途徑。小鼠胚胎發(fā)育和胚胎工程研究成果為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)。但人類對其他哺乳動物早期胚胎發(fā)育規(guī)律的認(rèn)知和胚胎操作技術(shù)的掌握與小鼠相比仍有較大差距，這種狀況阻礙了生命科學(xué)與技術(shù)最新成果在動物生產(chǎn)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

豬在畜牧生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)模型方面都具有重要價(jià)值，因此與豬相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究受到的關(guān)注也多于其他家畜，成為小鼠等小型實(shí)驗(yàn)哺乳動物之外研究熱度較高的大型哺乳動物之一。本文以豬為例，對家畜胚胎發(fā)育和胚胎工程研究進(jìn)展進(jìn)行概括性的綜述，希望能夠?yàn)閺氖略擃I(lǐng)域工作的研究者提供參考。

1 胚胎體外生產(chǎn)及胚胎發(fā)育機(jī)制

經(jīng)濟(jì)成本決定了豬等大家畜無法依賴體內(nèi)獲取胚胎用于相關(guān)研究，因此卵母細(xì)胞體外成熟、胚胎體外生產(chǎn)和胚胎體外培養(yǎng)等技術(shù)體系逐漸得到發(fā)展，成為開展家畜胚胎發(fā)育研究和胚胎工程操作的基礎(chǔ)。目前卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系多以TCM199為基礎(chǔ)液，添加適當(dāng)濃度的促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）以及表皮生長因子（EGF）等生長因子構(gòu)成，有些體系也會添加胎牛血清或者卵泡液來促進(jìn)成熟[1]。雖然與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞在質(zhì)量和發(fā)育潛能方面仍有差距，但豬、牛、山羊和綿羊的體外成熟卵母細(xì)胞均可支持個(gè)體出生。最新報(bào)道指出，通過向成熟體系中添加成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）、白血病抑制因子（LIF）和胰島素樣生長因子（IGF1）可以使得豬卵母細(xì)胞體外成熟率、體外囊胚發(fā)育率和胚胎移植后的仔豬出生率大幅提高[2]。該體系是否也適用于其他物種，或者是否可以促進(jìn)其他物種卵母細(xì)胞體外成熟體系的發(fā)展仍有待觀察。

體外受精、精子注射和體細(xì)胞核移植是體外生產(chǎn)家畜胚胎的主要方式。在過去三十余年的探索積累下，上述體外生產(chǎn)胚胎的技術(shù)體系在以豬為代表的家畜中都可以穩(wěn)定獲得出生的個(gè)體，但如何提高生產(chǎn)效率和穩(wěn)定胚胎質(zhì)量仍有待繼續(xù)探索。最近有消息稱，天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和南開大學(xué)機(jī)器人與信息自動化研究所跨學(xué)科合作，實(shí)現(xiàn)了機(jī)器人顯微操作進(jìn)行克隆豬的生產(chǎn)。無疑以人工智能為基礎(chǔ)的機(jī)器人顯微操作將極大提高該類工作的效率和穩(wěn)定性，值得關(guān)注和期待。

以豬為代表的家畜早期胚胎發(fā)育模式與小鼠差異較大，在卵裂球命運(yùn)決定和分化機(jī)制方面可能也存在種間差異[3]。因此，對豬等家畜早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制的解析對于理解該物種特異性發(fā)育問題具有不可替代性。

近幾年來，隨著干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)以及異種器官移植相關(guān)研究的飛速發(fā)展，由于與人類器官生理結(jié)構(gòu)以及生活習(xí)慣的相似性，豬已經(jīng)成為目前最有希望的待移植人類器官生產(chǎn)者。因此，關(guān)于人豬早期胚胎嵌合體以及早期胚胎發(fā)育相似性的研究工作極大地推動了豬早期胚胎發(fā)育機(jī)理的研究。以往研究表明，小鼠著床前胚胎第一次譜系分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子Cdx2和OCT4相互抑制并促進(jìn)各自細(xì)胞向滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化[4]。而在豬和人早期胚胎中，研究者發(fā)現(xiàn)Oct4基因在囊胚滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中廣泛表達(dá)，在早期囊胚期Cdx2基因在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)量非常低，甚至部分滋養(yǎng)層細(xì)胞中沒有Cdx2基因的表達(dá)[5-7]。這表明豬與人早期胚胎發(fā)育的分子基礎(chǔ)相似，但與小鼠有著巨大差別。另一方面異種嵌合的相關(guān)研究表明，將人胚胎干細(xì)胞注射到豬桑椹胚中可以產(chǎn)生人-豬嵌合體胎兒，但是同樣的操作無法產(chǎn)生鼠-豬嵌合體胎兒[8]，這說明人類干細(xì)胞可以同步參與到豬早期胚胎分化過程中，也從側(cè)面說明了人和豬早期胚胎發(fā)育的相似性。此外，最新研究表明，人和豬原始生殖細(xì)胞的發(fā)源地以及分化的分子機(jī)理極其相似，但與小鼠存在巨大差別[9]。

相對于小鼠等模式動物，豬體內(nèi)胚胎獲取的成本高，體外胚胎培養(yǎng)體系效率低，最重要的是針對于早期胚胎相關(guān)的實(shí)驗(yàn)體系不健全。這導(dǎo)致過去幾十年來豬早期胚胎發(fā)育的相關(guān)研究工作相對緩慢。但隨著對其醫(yī)療和科研價(jià)值的深入認(rèn)識，豬早期胚胎發(fā)育的研究工作正處于加速起跑的階段，相信在不遠(yuǎn)的將來會產(chǎn)生更多更具有影響力的研究成果。

2 多能性干細(xì)胞系

小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）系是最早建立的多能性干細(xì)胞系[10]，它的生物學(xué)特征也為多能性設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)。能夠?qū)崿F(xiàn)生殖系嵌合發(fā)育或者四倍體嵌合發(fā)育的干細(xì)胞系擁有的多能性被定義為初始態(tài)（naive）多能性；具有體外自我更新能力和三胚層分化能力，但不具有生殖系嵌合發(fā)育或者四倍體嵌合發(fā)育能力的干細(xì)胞系擁有的多能性被定義為激發(fā)態(tài)（primed）多能性。在小鼠ESC和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSC）[11]取得成功后，嘗試建立其他哺乳動物ESC和iPSC的努力一直沒有中斷，也取得了一系列進(jìn)展。但總體來看，目前以豬為代表的其他物種多潛能干細(xì)胞都沒有達(dá)到小鼠ESC的全部生物學(xué)特征，大部分處于接近激發(fā)態(tài)多能性狀態(tài)[12-13]。探索適合于每個(gè)物種初始態(tài)多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)體系或者找到各物種通用的初始態(tài)多能性干細(xì)胞培養(yǎng)體系是目前該領(lǐng)域的主要任務(wù)。

3 基因編輯

向哺乳動物基因組導(dǎo)入外源基因最初是通過原核注射在小鼠中實(shí)現(xiàn)的[14]，采用同樣的技術(shù)路線，其他哺乳動物也相繼取得了成功。但自從小鼠ESC建立之后，小鼠的基因操作取得了大幅的進(jìn)展。ESC與基因打靶技術(shù)相結(jié)合可以在個(gè)體水平實(shí)現(xiàn)各種類型的基因操作，如外源基因定點(diǎn)導(dǎo)入、特定基因敲除和特定基因的條件性敲除等。由于沒有等同于小鼠ESC的細(xì)胞可用，大型哺乳動物的基因操作進(jìn)展緩慢，直到2002年才通過體細(xì)胞核移植路線首次實(shí)現(xiàn)基因敲除[15]。鋅指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9工具體系的出現(xiàn)，使大型哺乳動物基因打靶變得相對容易實(shí)現(xiàn)，也促使基因編輯概念的提出，并相繼出生了基因編輯大型哺乳動物[16-17]?？紤]到豬等家畜的妊娠周期和飼養(yǎng)管理成本，受精卵直接操作路線和體細(xì)胞基因編輯后進(jìn)行核移植路線都存在不盡如人意之處。在降低成本、提高效率和多基因編輯等方面，豬等大動物多能性干細(xì)胞系的建立仍具有重要的意義。

4 展望

以豬為代表的家畜胚胎發(fā)育和胚胎工程研究對畜牧生產(chǎn)發(fā)展和人類生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展具有重要的促進(jìn)作用。生命科學(xué)和生物技術(shù)的整體進(jìn)步為家畜胚胎發(fā)育和胚胎工程研究提供了更為豐富的探索路徑和探索空間。如何提高家畜胚胎體外生產(chǎn)的效率和質(zhì)量仍將是未來一定時(shí)間內(nèi)的重要任務(wù)；借助高通量技術(shù)在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和表觀組學(xué)等層面深入闡明家畜物種特異性胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制是領(lǐng)域的總體發(fā)展趨勢；建立初始態(tài)多能性干細(xì)胞系，結(jié)合最新基因編輯技術(shù)，按照人類的需要在家畜上高效實(shí)現(xiàn)多基因編輯操作是未來五到十年內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。

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10.19556/j.0258-7033.2017-09-001

國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目；豬初始態(tài)（naive）多能干細(xì)胞系建立及多能性調(diào)控機(jī)制解析（2016YFA0100200）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目；豬早期胚胎發(fā)育中CDX2和OCT4基因功能及互作模式研究（31371457）

郭詩萌，在讀博士，主要從事豬胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究，E-mail：guoshimeng217@neau.edu.cn

*通訊作者：劉忠華，E-mail：liuzhonghua@neau.edu.cn