黃開遠，謝展雄，吳群華，劉宇琳

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 藥劑科，深圳 518110)

·基礎研究·

復方金銀花外洗液及其單味藥的體外透皮實驗與抑菌活性研究

黃開遠*，謝展雄，吳群華，劉宇琳

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 藥劑科，深圳 518110)

目的：觀察復方金銀花外洗液(外洗液)及金銀花水提液(金銀花液)體外透皮吸收的效果；并探討兩者對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的體外抑菌活性。方法：采用改良的Franz擴散池裝置，以昆明小鼠腹部皮膚為屏障，利用高效液相色譜法研究外洗液及金銀花液中綠原酸的透皮吸收性能；采用管碟法測定外洗液及金銀花液對4種菌的抑菌能力；用試管二倍稀釋法與平板涂布法結合確定藥液對4種菌的最小抑菌濃度(MIC)。結果：綠原酸在體外可以通過透皮吸收，外洗液和金銀花液在8 h內綠原酸的累積透皮釋藥量分別為1.68、0.98 μg·cm-2；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌對外洗液及金銀花液均敏感；含相同綠原酸量的外洗液的抑菌圈直徑都大于金銀花液；含相同質量濃度的綠原酸和生藥的外洗液對4種菌的MIC值均比金銀花液對4種菌的MIC值小。結論：外洗液及金銀花液均有體外透皮吸收作用和抑菌活性，且復方的最高安全劑量和功效要強于單味藥。

金銀花；外洗液；抑菌效果；透皮吸收

濕疹、疥癬是皮膚科中常見的疾病，對于真菌感染引起的濕疹、疥癬臨床中主要使用抗菌藥和激素治療，由于微生物的耐藥性越來越嚴重，單純依靠抗菌藥和激素的治療方案對于某些病例已經起不到滿意的治療效果。因此，合理開發(fā)、利用中草藥，特別是對具有抗菌活性的中藥復方的研究具有重要意義[1]。復方金銀花外洗液是我院在復方黃柏液的基礎上加減而成，由金銀花(15 g)、苦參(15 g)、黃柏(6 g)、蛇床子(12 g)、土茯苓(12 g)5味藥組成。具有清熱解毒、燥濕止癢、抗真菌的功效，臨床實踐中主要應用于因真菌感染引起的疥癬、腳癢及足部濕疹等疾病。金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花或花蕾，具有清熱解毒、涼風散熱、抗炎、抑菌和增強機體免疫功能等作用[2-3]。金銀花在臨床中經常外洗或外敷應用于濕疹及過敏性皮膚瘙癢，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌有較好的抑制作用，但是對綠膿桿菌及其他菌抑制作用不明顯。因此本研究以復方金銀花外洗液及其單味藥金銀花水提液進行體外透皮吸收與抑菌活性的實驗研究比較，為復方金銀花外洗液的臨床應用提供理論依據(jù)，同時也為中藥復方的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物

金銀花、苦參、蛇床子、黃柏、土茯苓(廣東康美藥業(yè)有限公司，批號分別為150101、150501、150801、150801、151002)；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201415)。

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠，6～8周齡，體質量(20±2)g，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物批準文號：SCXK(粵)2014-0001。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌[中國食品藥品檢定研究院，批號分別為CMCC(B)26003、CMCC(B)63501、 CMCC(B)44102、CMCC(B)10104]。

1.3 試劑

乙腈、甲醇(Merck公司)為色譜純，其他試劑均為國產分析純；營養(yǎng)瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.4 儀器

AB16UU型CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電公司)；高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津)；二極管陣列檢測器；YB-P6智能透皮試驗儀(天津藥典標準儀器廠)；AUW220分析天平(日本島津)；其他均為常用儀器。

2 方法

2.1 外洗液及金銀花液的制備

準確稱取處方量為150 g的外洗液中藥(含金銀花37.5 g)和50 g金銀花加蒸餾水各自提取兩次，比例為1∶12、1∶8，第一次60 min、第二次40 min，將外洗液和金銀花提取液濃縮成1.0 g·mL-1裝于三角瓶中煮沸30 min，滅菌后儲存于4 ℃冰箱備用。

2.2 高效液相色譜測定方法

2.2.1 色譜條件 安捷倫TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸緩沖鹽溶液(11∶89)；檢測波長：327 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成1 mL含綠原酸0.048 0 mg的溶液，即可。

2.2.3 樣品溶液制備 精密吸取2.1項下的外洗液500 μL置25 mL棕色瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；再從棕色瓶中吸取500 μL置25 mL棕色瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金銀花液的制備方法同外洗液。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液用50%甲醇稀釋成0.096、0.96、4.8、9.6、24.0 μg·mL-1，進樣20 μL測定，以綠原酸的峰面積(Y)和濃度(X)進行線性回歸，求得標準曲線的回歸方程為Y=58 995X+2 084.2，r=0.999，結果表明綠原酸在0.096～24.0 μg·mL-1有良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下對照品溶液20 μL，重復進樣6次，RSD=1.13%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取透皮接收液在室溫下放置，分別于0、1、4、8 h進樣測定綠原酸峰面積，結果RSD=0.42%，表明接收液在8 h內穩(wěn)定。

2.2.7 樣品綠原酸的含量測定 吸取2.2.3項下的樣品用0.45 μm 濾膜過濾，進樣20 μL，在327 nm處測定綠原酸的峰面積，代入標準曲線方程，得外洗液和金銀花液中綠原酸的質量濃度分別為6.4、22.3 μg·mL-1。

2.3 體外透皮吸收方法

2.3.1 離體鼠皮的制備 昆明小鼠脫頸處死，手術剝離腹部去毛皮膚，并清除皮下黏膜和脂肪組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，置于-20 ℃冰箱保存。

2.3.2 體外透皮實驗裝置及方法 本實驗采用YB-P6智能透皮試驗儀，將預處理皮膚從-20 ℃冰箱中取出，自然解凍，用濾紙吸干皮膚表面0.9%氯化鈉溶液備用。皮膚置于擴散室與接收室之間，角質層朝向擴散室，用鐵夾固定，剪去多余的皮膚，擴散室和接收室之間的半徑0.8 cm，滲透面積為2.01 cm2，向接收室加入 17.0 mL接收液[0.9%氯化鈉溶液-乙醇(7∶3)][4]，排出氣泡，在供藥室中分別加入含生藥量相同的外洗液和金銀花液2 mL(外洗液含12.8 μg綠原酸，金銀花液含44.6 μg綠原酸)，開動電磁攪拌器(300 r·min-1)，32.5 ℃恒溫，分別于1、2、3、4、6、8 h從接收池取樣1 mL，同時向接收池中補充等量同溫的接收液并排除氣泡。

2.3.3 計算累積透皮量 取接收液1 mL用0.45 μm 濾膜過濾，進樣 20 μL，測定綠原酸的峰面積，代入標準曲線方程，得接收液濃度，并按文獻計算累積透皮量Q(μg·cm-2)[5]。

(1)

式中：Cn—第n個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1)；

V—接收池體積；

Ci—第I個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1)；

V0—取樣體積；

A—滲透面積(cm2)，F(xiàn)ranz的擴散池面積為2.01 cm2。

2.4 體外抑菌試驗方法

2.4.1 菌懸液的制備 分別將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用無菌水沖洗，配成含菌數(shù)約為1×108～2×108cfu·mL-1的菌懸液待用。

2.4.2 外洗液及金銀花液對不同菌株的體外抑菌試驗 采用管碟法，取肉湯瓊脂培養(yǎng)基20 mL倒入內徑90 mm的無菌玻璃平皿內，使培養(yǎng)基水平均勻地鋪在平皿內；吸取被檢菌液1 mL與冷至45 ℃的肉湯瓊脂培養(yǎng)基5 mL混勻，均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，即得雙層瓊脂平板[6]。待表面干燥后，用無菌鑷子夾取已經高壓蒸氣消毒并烘干的牛津杯，輕輕平置于菌液平板表面，每皿呈三角形放3只牛津杯，分別取2.1項下的外洗液和金銀花液適量并用無菌水稀釋至0.5 mL，分別加入牛津杯中，每種水平加3孔作為平行樣，同時設無菌0.9%氯化鈉溶液為空白對照。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥，10～15 mm為低度敏感，15～20 mm為中度敏感，20 mm以上為高度敏感。

2.4.3 藥物最小抑菌濃度(MIC) 的測定 采用試管二倍稀釋法，取10只無菌具塞試管，編號排列在試管架上，于每管先加入無菌肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后于第1管中加入已經混勻的滅菌外洗液或金銀花液2 mL (內含外洗液1892 μL或金銀花液544 μL)，混勻后取出含藥培養(yǎng)基2 mL放入第2管中，依此類推，直到第8管取出2.0 mL棄去。第9管不加藥物作為陽性對照，以便觀察培養(yǎng)基是否適合細菌生長。第10管加藥液2.0 mL混勻后取出2.0 mL棄去，不加細菌作為陰性對照，以便觀察外洗液是否受污染。每管平行3份。分別取菌液100 μL，加入1～9號試管中，使每管最終菌液濃度約為5×105cfu·mL-1，混勻后一起放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h觀察結果。記錄各管內細菌生長情況，以渾濁度為指標檢查試管中有無細菌生長，眼觀選出澄清透明無細菌生長的各管，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察瓊脂平板上無細菌生長而含藥液濃度最低者，即為該種藥物對該菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

2.5 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 綠原酸色譜峰的分離鑒定

綠原酸的色譜分離結果如圖1所示，與對照品綠原酸的色譜峰(見圖1B)相比，接收液(見圖1A)在綠原酸的保留時間處沒有雜峰出現(xiàn)，同時外洗液接收液和金銀花液接收液(見圖1C和1D)的色譜峰峰形良好，表明色譜條件可以對綠原酸進行很好分離，而且接收液對綠原酸的測定無干擾。

3.2 外洗液和金銀花液對綠原酸透皮吸收的影響

將檢測結果代入公式計算累積透皮量，制作滲透曲線。外洗液和金銀花液在每個時間段的接收液中均可以檢測到綠原酸。外洗液和金銀花液在8 h時內對綠原酸的累積透皮量分別為1.68、0.98 μg·cm-2(以綠原酸計，下同)，表明外洗液中綠原酸的透皮吸收的作用要強于金銀花液，通過綠原酸透皮累積釋藥時間曲線(見圖2)可以看出，外洗液中綠原酸的累積透皮量在每個時間段內明顯大于金銀花液，這可能是復方金銀花外洗液經處方配伍后金銀花中主要成分綠原酸的經皮滲透效果優(yōu)于其單味的金銀花提取液。

注：A.接收液；B.綠原酸對照品；C.外洗液；D.金銀花液。圖1 復方金銀花外洗液及對照溶液的HPLC圖

圖2 外洗液及金銀花液中綠原酸透皮累積 釋藥時間曲線

3.3 外洗液及金銀花液對4種菌株的抑菌效果

外洗液及金銀花液不同藥物含量對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌都有不同程度的抑制作用，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對外洗液和金銀花液不同藥物含量高度敏感，且劑量與抑菌圈的直徑呈正比；枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌對兩種提取液分別具有中度敏感和低度敏感，但隨著用藥劑量的增加，抑菌圈直徑變化不大；通過比較表1和表2的數(shù)據(jù)可以得出：含相同量綠原酸(0.757 μg，外洗液生藥量為118 mg，金銀花液生藥量為34 mg)的外洗液對4種菌的抑菌圈直徑都要大于金銀花液的抑菌圈直徑，說明復方中其他的生藥也發(fā)揮抑菌作用，同時根據(jù)含相同生藥量的數(shù)據(jù)(18 mg外洗液含金銀花的量為4.5 mg、綠原酸的量為0.114 μg，17 mg金銀花液中含金銀花的量為17 mg、綠原酸的量為0.375 μg)說明在含相同生藥量的情況下，復方中4.5 mg的金銀花便可達到17 mg金銀花的抑菌效果。綜上所述外洗液中各味藥相須為用，從而減少了復方中金銀花的用量，使復方的外洗液治療效果要優(yōu)于單味的金銀花。

3.4 外洗液和金銀花液的最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

外洗液實驗中作為陽性對照試管內的菌株生長良好，說明培養(yǎng)基適合細菌生長。作為陰性對照試管內的液體澄清透明，說明外洗液未受污染。通過表3和表4可知，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌：外洗液的MIC值為7.4 mg·mL-1(生藥量)和0.047 μg·mL-1(綠原酸)，金銀花液的MIC值為8.5 mg·mL-1(生藥量)和0.189 μg·mL-1(綠原酸)；綠膿桿菌：外洗液的MIC值為14.8 mg·mL-1(生藥量)和0.094 μg·mL-1(綠原酸)，金銀花液的MIC值為34 mg·mL-1(生藥量)和0.757 μg·mL-1(綠原酸)；枯草芽孢桿菌：外洗液的MIC值為29.6 mg·mL-1(生藥量)和0.189 μg·mL-1(綠原酸)，金銀花液的MIC值為34 mg·mL-1(生藥量)和0.757 μg·mL-1(綠原酸)。綜合數(shù)據(jù)分析可知：外洗液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有較顯著的抑菌作用，同時對枯草芽孢桿菌也有抑制作用，這與外洗液在臨床上有較好的燥濕止癢、抑菌的功效相一致。金銀花液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值為0.189 μg·mL-1，對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC值為0.757 μg·mL-1。在含等量的綠原酸的情況下，單味的金銀花提取液對4種菌的抑菌效果都要弱于復方金銀花外洗液，同時在含等量的生藥量情況下，單味的金銀花提取液對4種菌的抑菌效果也都要弱于復方金銀花外洗液，這可能是外洗液中含有土茯苓、苦參、蛇床子等對這4種菌株產生聯(lián)合的抑制作用，說明外洗液中各味藥相須為用從而增強復方的治療效果。具體結果見表3、表4。

表1 外洗液不同藥物含量對4種菌株的抑制作用

表2 金銀花液不同藥物含量對4種菌株的抑制作用

表3 外洗液對不同菌株的最小抑菌濃度(n=3)

4 討論

本研究的體外透皮吸收實驗采用的是離體的雄性昆明小鼠的腹部皮膚作為藥物滲透屏障，同時采用高效液相色譜法測定綠原酸的累積透皮量，保證了結果數(shù)據(jù)的可靠性與準確性[7]。本實驗結果顯示：外洗液中綠原酸透皮吸收的作用要強于金銀花液，同時外洗液中綠原酸的累積透皮量在每個時間段內明顯大于金銀花液。這可能是外洗液中含有苦參、蛇床子、土茯苓等其他藥物，使外洗液中綠原酸的滲透作用比單味藥有顯著提高，這也是中藥揮發(fā)油常被作為透皮吸收促進劑的原因[8]。外洗液中綠原酸的滲透效果要強于單味的金銀花液，可能就是外洗液中含有促進綠原酸透皮吸收的揮發(fā)油，但究竟是外洗液中的何種成分促進綠原酸的透皮吸收有待下一步深入研究。

本實驗選用復方金銀花外洗液及其單味藥金銀花提取液對常見的4種致病菌進行體外抑菌實驗的研究，在測定藥物最小抑菌濃度(MIC) 時采用的是試管二倍稀釋法，由于中草藥的提取液大部分具有顏色，對抑菌試驗的結果判定會產生一定的影響，因此本試驗對MIC的測定方法做了相應的改進，首先眼觀選出澄清透明無細菌生長的試管，再將試管內的液體吸出，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，觀察瓊脂平板上有無細菌生長從而判定藥物對該菌株的最小抑菌濃度[9]。外洗液及其金銀花液對4種菌株的抑菌效果和最小抑菌濃度的實驗結果顯示出其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較好的抑制作用，這佐證了外洗液及其金銀花液在臨床上常用于濕疹、疥癬治療的理論依據(jù)[10]。在含相同質量濃度綠原酸的劑量下，外洗液的生藥量要大于金銀花液，但外洗液中金銀花的含量要少于金銀花的含量。外洗液對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌抑菌能力比金銀花液對這4種菌株的抑菌能力強，在一定程度上說明了中藥復方的功效要比單味藥強。這可能是復方金銀花外洗液中含有燥濕止癢、抗菌功效的苦參、黃柏、蛇床子、土茯苓，各味藥相須為用從而增強復方的治療效果；同時也說明含相似功效的中藥聯(lián)用可以減少單味藥的劑量。因此在臨床上應多用復方的金銀花液，不僅可以增強各味藥的療效，同時可以減少單味藥的劑量和降低細菌對單味藥的耐藥性。

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InvitroAntibacteriostaticActivityandPercutaneousAbsorptionfromFlosLoniceraeJaponicaeLotionanditsWaterExtract

HUANGKaiyuan*，XIEZhanxiong，WUQunhua，LIUYulin

(PharmacyofShenzhenLonghuaDistrictCentralHospital，Shenzhen518110，China)

Objective：To detect the bacteriostatic activity of Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract onStaphylococcusaureus，Bacillusstubtilis，EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosainvitro.Methods：The minimum inhibitory concentration (MIC) was scaled by tube dilution and plate smearing methods.The percutaneous absorption potential of their chlorogenic acid were detected by HPLC，in which via mouse’s abdominal skin cell viability was determined using Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract to the four bacteria.Results： Chlorogenic acid could be absorbed via skininvitro，so after 8 hours treatments of the Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract，the chlorogenic acids’ amount were 1.68 and 0.98 μg·cm-2，respectively.Staphylococcusaureus，Bacillusstubtilis，EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosawere sensitive to Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract.Meanwhile，the inhibition zone diameter of Flos Lonicerae Japonicae lotion was bigger than that of its water extract，but the lotion’s MIC was less than water extract’s.Conclusion： Both Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract can be used as antibiotic treatment and absorbed via skin in vitro.Moreover，the effect of compound of Flos Lonicerae Japonicae was better than individual drug.

Flos Lonicerae Japonicae；topical washing liquid；anti-bacterial effect；percutaneous absorption

] 黃開遠，中藥師，碩士，研究方向：臨床藥學；E-mail 404665355@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.013

2016-07-13)

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