劉長虹，李永輝，李佩佩

(1.淶源縣中醫(yī)院，河北 淶源 074300；2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 海口 571199)

·基礎(chǔ)研究·

益智中圓柚酮對(duì)慢性腎損傷的保護(hù)作用△

劉長虹1，李永輝2*，李佩佩2

(1.淶源縣中醫(yī)院，河北 淶源074300；2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?71199)

目的：評(píng)價(jià)益智中圓柚酮對(duì)慢性腎損傷的保護(hù)作用，闡述益智補(bǔ)腎縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：采用腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD大鼠模型，對(duì)益智中圓柚酮的腎損傷保護(hù)作用進(jìn)行研究，分別測定24h尿量、尿蛋白(UP24h)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、硫酸吲哚醇(IS)的含量以及對(duì)腎臟病理切片進(jìn)行觀察，以確定圓柚酮對(duì)CKD的保護(hù)作用。結(jié)果：與模型組比較，圓柚酮各劑量組大鼠腎組織病理切片形態(tài)均有不同程度的改善，其中圓柚酮高劑量組>圓柚酮中劑量組>黃葵膠囊組>圓柚酮低劑量組，且高劑量組大鼠血清中BUN和IS及尿蛋白含量中低劑量組降低更明顯；與高劑量組相比，中劑量組血清中Scr降低較明顯。結(jié)論：圓柚酮對(duì)CKD呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，高劑量組對(duì)慢性腎損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于低劑量組。

益智；圓柚酮；慢性腎損傷；保護(hù)作用；病理切片

慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease，CKD)是一種多種原因誘導(dǎo)腎臟功能下降的疾病，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，現(xiàn)已成為影響人類健康的一類常見病和多發(fā)病[1-3]。目前，慢性腎病的治療主要為控制患者癥狀，降低蛋白尿的形成，在臨床上取得了一定的療效，但仍有較多的患者療效不佳。腎臟疾病的臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥在改善患者臨床癥狀、控制蛋白尿、減少血尿、保護(hù)腎功能和減輕化學(xué)藥的副作用方面呈現(xiàn)了較好的優(yōu)勢[4]。

益智為姜科山姜屬植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果實(shí)，性溫，味辛，歸脾、腎經(jīng)，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效。臨床上用于治療冷氣腹痛，中寒吐瀉，多唾，遺精，小便余瀝，夜多小便等證。益智作為傳統(tǒng)腎臟用藥[5-7]，在臨床上廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，然而對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究甚少。本課題組在多年益智研究工作的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其主要成分圓柚酮對(duì)CKD具有較好的治療作用，圓柚酮化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。因此，本實(shí)驗(yàn)以腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型，評(píng)價(jià)圓柚酮對(duì)慢性腎損傷的保護(hù)作用，以期闡明益智補(bǔ)腎縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，為益智的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐。

圖1 圓柚酮化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1動(dòng)物

健康SD雄性大鼠48只，體重180～220g，SPF級(jí)，長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(湘)2009-0012，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無不良反應(yīng)者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑

圓柚酮(海南醫(yī)學(xué)院，HPLC含量大于98%)；黃葵膠囊(江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào)：15052703)；尿素氮試劑盒(批號(hào)：20150605)及肌酐試劑盒(批號(hào)：20150616)、尿蛋白定量試劑(批號(hào)：2150603)均由南京建成生物工程研究所提供；腺嘌呤(RealJimer，批號(hào)：641255)。其他試劑購于上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.3儀器

GS-15R型低溫離心機(jī)(Beckman公司)；DW-40L262型低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))；PL203型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；e2695液相色譜儀(Waters公司)。

2 方法

2.1造模

取SD大鼠(180～220g)，隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、黃葵膠囊組、圓柚酮高劑量組、圓柚酮中劑量組和圓柚酮低劑量組，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠按150mg·kg-1灌胃腺嘌呤混懸溶液造模，連續(xù)造模14d后，將大鼠置于代謝籠中，分別收集正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組的24h尿量，模型組和實(shí)驗(yàn)組24h尿量大于正常組為造模成功。正常組給予0.9%氯化鈉溶液，模型組繼續(xù)按照150mg·kg-1腺嘌呤灌胃，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)給予150mg·kg-1的腺嘌呤溶液和圓柚酮不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。

2.2分組及給藥

模型成功后，將大鼠48只隨機(jī)分為6組，即正常組，模型組，陽性藥物組，圓柚酮化合物高、中、低3個(gè)劑量組，每組8只。正常組(灌0.9%氯化鈉溶液)，模型組(按150mg·kg-1·d-1灌腺嘌呤混懸液)，黃葵膠囊組(按0.75mg·kg-1·d-1灌胃給藥)，圓柚酮高劑量組(按20mg·kg-1·d-1灌胃給藥)，圓柚酮中劑量組 (按10mg·kg-1·d-1灌胃給藥)，圓柚酮低劑量組 (按5mg·kg-1·d-1灌胃給藥)，各組每日灌胃1次，不限制飲食和水，干預(yù)周期為2周，期間不使用抗CKD藥物。

2.3檢測指標(biāo)

2.3.1尿蛋白2周末，分別將各組大鼠置于代謝籠內(nèi)，禁食不禁水，收集24h尿液，計(jì)24h尿量，充分混勻后1300r·min-1離心5min，收集上清液，通過尿蛋白定量試劑測定24h尿蛋白量。

2.3.2腎功能 大鼠空腹6h后，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，通過尿素氮試劑盒和肌酐試劑盒分別檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum Creatinine，SCr)。

參照文獻(xiàn)采用HPLC熒光法測定血漿中硫酸吲哚酚(IS)的含量[8]：Phenomenex Luna色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸(15∶85∶0.2，V/V/V)；流速：1mL·min-1；柱溫：30℃；激發(fā)波長：280nm，發(fā)射波長：390nm。以硫酸吲哚酚濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=3.348X-3097，r=0.9998)，對(duì)樣品進(jìn)行測定，見圖2。

2.3.3病理切片 藥物對(duì)腺嘌呤致腎損傷的腎組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中病理切片委托南京醫(yī)科大學(xué)病理教研室檢測。觀察指標(biāo)包括：1)腎小球有無增生或萎縮；2)腎小管有無擴(kuò)張、管型和尿酸鹽沉積；3)間質(zhì)有無炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生等病變。

注：A.硫酸吲哚酚對(duì)照品；B.血漿樣品。圖2 硫酸吲哚酚HPLC圖

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1尿蛋白

表1結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的24h尿蛋白定量給藥后明顯升高；與模型組相比，給藥2周后各給藥組則明顯降低，其中圓柚酮高劑量組較低劑量組降低明顯。

3.2腎功能

表2結(jié)果表明，與正常組相比，給藥后各組小鼠的SCr、BUN、IS升高明顯；與模型組相比，各給藥組中圓柚酮低劑量組小鼠的IS略微升高，其他給藥組小鼠的SCr、BUN、IS降低明顯，其中高劑量組大鼠血清中BUN、IS降低較低劑量組明顯，而低劑量組血清中SCr較高劑量組降低明顯。

表1 不同劑量圓柚酮對(duì)CKD大鼠24 h尿蛋白的影響

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；下同。

表2 不同劑量圓柚酮對(duì)CKD大鼠的BUN、Scr、IS影響

3.3病理切片

圖3、表3結(jié)果表明,與正常組比，給藥組大鼠腎小球輕微萎縮，腎小管擴(kuò)張均增大，管型病變，尿酸沉積增高，腎間質(zhì)中出現(xiàn)炎癥及纖維增生；與模型組相比，給藥組大鼠腎病均有不同程度減輕，圓柚酮高劑量組>圓柚酮中劑量組>黃葵膠囊組>圓柚酮低劑量組。

注：A.正常組；B.模型組；C.黃葵膠囊組；D.圓柚酮高劑量組；E.圓柚酮中劑量組；F.圓柚酮低劑量組。圖3 不同劑量圓柚酮對(duì)腺嘌呤致CKD實(shí)驗(yàn)病理切片圖(HE染色)

組別劑量/mg·kg-1病理結(jié)果得分正常組0.60±0.55模型組15011.20±0.45##黃葵膠囊組0.757.50±1.96**圓柚酮高劑量組205.20±0.76**圓柚酮中劑量組105.30±0.89**圓柚酮低劑量組55.50±1.27**

4 討論

隨著我國居民生活方式的轉(zhuǎn)變，CKD的發(fā)病率不斷提高，2012年流行病學(xué)調(diào)查顯示[3]，CKD的患病率高達(dá)10.8%。目前CKD的診斷指標(biāo)主要包括尿蛋白、血肌酐和血清尿素氮等，其中尿蛋白是慢性腎病診斷的重要依據(jù)，也是評(píng)定腎病治療效果的重要指標(biāo)之一，臨床通常監(jiān)測24 h尿蛋白定量來判斷蛋白尿出的多少，來評(píng)判腎臟的功能。血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)是人體蛋白質(zhì)新陳代謝的產(chǎn)物，當(dāng)腎臟功能正常時(shí)，可將多余的Cr和BUN排出體外，使Cr和BUN在血液中保持著穩(wěn)定，在腎功能受損時(shí)，導(dǎo)致Cr和BUN在血漿中積累，因而測定血Cr和BUN可以評(píng)價(jià)腎功能的損傷程度。IS是色氨酸的代謝產(chǎn)物，高濃度的IS在血漿中與蛋白結(jié)合后，不僅可以誘發(fā)尿毒癥，同時(shí)還可以刺激腎組織產(chǎn)生TGF-β1、α-SMA、PDGF等纖維化因子，促進(jìn)腎臟纖維化，導(dǎo)致慢性腎病的惡化，因此IS也是腎臟疾病監(jiān)測的重要指標(biāo)之一[9]。

由于CKD疾病復(fù)雜，發(fā)病機(jī)理不明確，目前CKD尚缺乏有效的治療藥物，臨床多以控制指標(biāo)為主，常用化學(xué)藥包括激素、免疫抑制劑、ACEI/ARB等，臨床常用中藥有黃葵膠囊、百靈膠囊等，主要功效為解毒消腫、清利濕熱、活血化瘀。其中黃葵膠囊具有抑制免疫反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、改善腎纖維化、保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞等多方面功效[10-11]，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)選擇了黃葵膠囊作為陽性對(duì)照藥。

益智具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾之功效，用于腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁、脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多唾涎[12]。益智的化學(xué)成分多樣，其中倍半萜類化合物為主要特征成分[13]。本文對(duì)倍半萜類成分的主要化合物圓柚酮進(jìn)行了抗CKD的作用研究。研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，圓柚酮高劑量組可以明顯減少血液中尿素氮、肌酐、硫酸吲哚酚，增加尿量；通過病理切片可以看出圓柚酮高劑量組能夠在一定程度上改善腎組織。結(jié)果顯示圓柚酮具有較好的治療慢性腎病的作用，多項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于臨床常用藥物黃葵膠囊，可以作為慢性腎病的候選藥物。

[1] Stack A G，Casserly L F，Cronin C J，et al.Prevalence and variation of Chronic Kidney Disease in the Irish health system：initial findings from the National Kidney Disease Surveillance Programme[J].BMC Nephrol，2014，15：185.

[2] De Nicola L，Donfrancesco C，Minutolo R，et al.on behalf of the ANMCO-SIN Research Group.Prevalence and cardiovascular risk profile of chronic kidney disease in Italy：results of the 2008-12 National Health Examination Survey[J].Nephrol Dial Transplant，2015，30(5)：806-814.

[3] Zhang L，Wang F，Wang L，et al.Prevalence of chronic kidney disease in China：a cross-sectional survey[J].Lancet，2012，379 (9818)：815-822.

[4] 劉平夫.慢性腎炎蛋白尿的中醫(yī)辨治[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(3)：447.

[5] 汪庵.本草易讀[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1987：161.

[6] 汪昂.本草備要[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2009：126.

[7] 繆希雍.神農(nóng)本草經(jīng)疏[M].北京：中醫(yī)古籍出版社，2002：217.

[8] 吳淳，石成鋼，李梅，等.HPLC-FLU 法測定人血清中硫酸吲哚酚濃度及其在血液透析病人中的應(yīng)用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15(8)：906-910.

[9] 余彥霖，肖堂利，劉亮，等.硫酸吲哚酚促進(jìn)腎纖維化的機(jī)制研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38(2)：119-123.

[10]高渝.黃葵膠囊在腎移植術(shù)后蛋白尿中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20(1)：49-51.

[11]陳萍，萬毅剛，王朝俊，等.黃蜀葵花制劑治療慢性腎臟病的機(jī)制和療效[J].中國中藥雜質(zhì)，2012，37(15)：2252-2256.

[12]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：291.

[13]張俊清，王勇，陳峰，等.益智的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(2)：280-287.

StudyontheRenalProtectionofNootkatonefromAlpiniaeoxyphyllaeFructus

LIU Changhong1，LI Yonghui2*，LI Peipei2

(1.Laiyuan Hospital of Chinese Medicine，Laiyuan 074300，China；2.School of Pharmacy，Hainan Medical University，Haikou 571199，China)

Objective：The efficacy of nootkatone in treating chronic kidney disease were evaluated to explain the active constituents of Alpiniae oxyphyllae Fructus.Methods：Using a rat model of adenine-induced CKD，the protective effect of nootkatone on renal damage were studied，and 24 hours urine，urine protein (UP24h)，blood urea nitrogen (BUN)，serum creatinine (Scr) sulfuric acid indole alcohol (IS) were measured.And the kidney histopathology were also observed to determine nootkatone therapeutic effect of CKD.Results：Compared with the model group，nootkatone group each dose renal tissue biopsy morphology were improved，in which the high-dose group nootkatone > nootkatone middle dose group > Huang Kui capsule group > nootkatone middle dose group.And the IS，BUN and urine protein content the in high-dose group decreased significantly compared with middle dose group.Compared with high-dose group，serum Scr was significantly lower in middle dose group.Conclusion：The protective action of nootkatone on CKD showed a significant dose-effect relationship，the efficacy of the high-dose group is stronger than that of the middle-dose group.

Alpiniae oxyphyllae Fructus；nootkatone；Chronic Kidney Disease；renal protection；pathological section

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8156140281)

] 李永輝，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)及活性成分研究；Tel：(0898)66895337，E-mail：lyhssl@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.019

2016-12-22)

*[