徐曉燕， 邵夏炎， 劉映雪， 李東軒， 焦 鵬， 郝 奇， 田 華， 姚樹(shù)桐△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2人口與計(jì)劃生育學(xué)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 4動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000)

蜂膠醇提物通過(guò)抑制C/EBP同源蛋白表達(dá)減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡*

徐曉燕1， 邵夏炎2▲， 劉映雪2， 李東軒3， 焦 鵬4， 郝 奇3， 田 華4， 姚樹(shù)桐3△

(泰山醫(yī)學(xué)院1藥學(xué)院，2人口與計(jì)劃生育學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，4動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000)

目的： 研究蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis，EEP)對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用，并探討可能的分子機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，給予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA; 4 mmol/L)預(yù)處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM; 4 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況；試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性。分別采用Western blot和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關(guān)鍵蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和Bcl-2的表達(dá)變化。結(jié)果: 與ERS抑制劑PBA相似，EEP呈劑量依賴性地減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加(P<0.01或P<0.05)，LDH漏出、凋亡率和caspase-3活性降低(P<0.05或P<0.01)，且可抑制ERS誘導(dǎo)劑TM所致的HUVECs活力下降(P<0.05)，以及LDH漏出、細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性增加(P<0.05或P<0.01)；與PBA相似，EEP可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)和Bcl-2下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；另外，與TM組比較，EEP預(yù)處理組CHOP蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)也受到明顯抑制(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論: EEP可減輕 ox-LDL 所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，其機(jī)制可能與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑有關(guān)。

蜂膠醇提物； C/EBP同源蛋白； 氧化低密度脂蛋白； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)之一，而低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)增高是AS的重要危險(xiǎn)因子，LDL經(jīng)過(guò)氧化修飾成為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)則致AS作用更強(qiáng)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能障礙是早期AS過(guò)程中的重要病理變化，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、功能改變，使血液中脂質(zhì)和單核細(xì)胞更易沉積在內(nèi)皮下間隙進(jìn)一步成為泡沫細(xì)胞，從而啟動(dòng)粥樣斑塊的形成與發(fā)展，促進(jìn)AS進(jìn)程。大量研究表明，ox-LDL可通過(guò)多種途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其過(guò)度凋亡[2-4]。因此，干預(yù)ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用對(duì)阻止AS發(fā)展、降低心血管不良事件的發(fā)生率具有重要意義。蜂膠是蜜蜂采集植物樹(shù)脂等與其上顎腺分泌物混合形成的膠狀物質(zhì)，其中黃酮類、酚酸類等是其重要活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗AS等廣泛的生物學(xué)活性[5]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis，EEP)能夠促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止AS發(fā)展，并可以通過(guò)抑制凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[6-8]，但EEP是否可以通過(guò)抑制C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑減輕 ox-LDL 所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本工作通過(guò)研究EEP對(duì) ox-LDL 所誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)CHOP表達(dá)和凋亡的影響，探討了EEP對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的抑制作用及機(jī)制。

材料和方法

1試劑

HUVECs由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供；ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和RIPA裂解液分別購(gòu)自HyClone和Solarbio；衣霉素(tunicamycin，TM)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)和抗β-actin抗體購(gòu)自Sigma；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]和 Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗CHOP多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG分別為Cell Signaling Technology和北京中杉金橋公司產(chǎn)品；兔抗Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和二氟化樹(shù)脂(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜分別為Pierce和Millipore產(chǎn)品；Trizol 試劑為 Invitrogen產(chǎn)品；cDNA 合成試劑盒和 RealMaster Mix (SYBR Green)試劑盒購(gòu)自北京天根公司 ；Caspase-3和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測(cè)定試劑盒分別購(gòu)自碧云天生物和南京建成生物技術(shù)公司；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2方法

2.1EEP制備和總黃酮測(cè)定 采集新鮮泰山松柏蜂膠，烘干、粉碎，按本室既往報(bào)道的方法[6]制備EEP。取100克蜂膠溶于1L 95%乙醇中，40 ℃超聲提取，共3次，每次3 h，合并3次上清液，50 ℃條件下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，烘箱中干燥得EEP。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分光光度比色法(GB/T 20574-2006)測(cè)定EEP總黃酮含量，結(jié)果為(213.46±2.93) mg蘆丁當(dāng)量(RE)/g。 以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制EEP母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成適當(dāng)濃度。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)ox-LDL組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)EEP+ox-LDL組：培養(yǎng)液中先加入EEP(7.5、15和30 mg/L)預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)PBA(ERS抑制劑)+ox-LDL組：培養(yǎng)液中先加入4 mmol/L PBA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(5)TM(ERS誘導(dǎo)劑)組：培養(yǎng)液中加入4 mg/L TM；(6)EEP+TM組：先給予30 mg/L EEP預(yù)處理1 h，再加入4 mg/L TM。除EEP預(yù)處理組和TM組外，其它各組均加入0.1%的DMSO，培養(yǎng) 24 h 收集細(xì)胞。

2.3細(xì)胞活力和LDH測(cè)定 接種于96孔板的細(xì)胞經(jīng)處理后，按既往報(bào)道的MTT分析方法[9]檢測(cè)細(xì)胞活力。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度(A)值占對(duì)照組A值的百分比表示。同時(shí)按照LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組培養(yǎng)基中LDH活性。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率由流式細(xì)胞儀分析測(cè)定?？偧?xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

2.5細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，即細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并用PBS洗滌1次，以裂解液冰浴裂解15 min， 4 ℃條件下16 000 ×g離心15 min，采用Bradford法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。在96孔板中將10 μL裂解上清液、80 μL反應(yīng)緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃條件下孵育2 h。利用多功能酶標(biāo)儀于405 nm處讀取吸光度(A)，通過(guò)相同條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中caspase-3活性，并以正常對(duì)照組細(xì)胞caspase-3活性為100%，其余各組細(xì)胞caspase-3活性以其占正常對(duì)照組的百分比表示。

2.6Western blot分析 按本室既往報(bào)道的方法[10]提取細(xì)胞總蛋白，等量的各組總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)封閉、洗脫后與抗CHOP(1∶800)、Bcl-2(1∶400)抗體和抗β-actin(1∶6 000)單克隆抗體室溫孵育4 h，洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)II抗室溫孵育1 h?？乖?抗體復(fù)合物用ECL法顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)值，以CHOPIA值/β-actinIA值的比值反映CHOP蛋白相對(duì)水平。

2.7Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)CHOP的mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞后，用Trizol一步法提取RNA。按試劑盒說(shuō)明配制20 μL的反應(yīng)體系， 37 ℃反應(yīng)60 min，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系為：2.5×RealMaster Mix/20×SYBR solution 4.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL及三蒸水1.5 μL，共10 μL。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，CHOP的上游引物序列為5’-CCACCACACCTGAAAGCAGAA-3’，下游引物序列為5’-GGTGCCCCCAATTTCATCT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CCTCCCGCTTCGCTCTCT-3’，下游引物序列為5’-GCTGGCGACGCAAAAGA-3’。在 Rotor-Gene Q熒光定量 PCR 儀上反應(yīng)，條件為 94 ℃預(yù)變性15 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s。GAPDH作為內(nèi)參照，根據(jù)2-ΔΔCt法分析CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 來(lái)表示。多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs活力降低和LDH漏出

MTT 結(jié)果顯示，ox-LDL 可使HUVECs活力顯著降低(P<0.01)；而以15 mg/L和30 mg/L EEP預(yù)處理HUVECs 1 h，細(xì)胞活力則明顯增加(P<0.05)，表明EEP 可以減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs活力降低；ERS抑制劑PBA也可減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs活力降低(P<0.05)，與EEP預(yù)處理組結(jié)果相似，見(jiàn)圖1A。

對(duì)培養(yǎng)液中LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBA相似， EEP可顯著抑制ox-LDL所致的LDH漏出(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

2EEP抑制TM誘導(dǎo)的HUVECs活力降低和LDH漏出

ERS誘導(dǎo)劑TM 可顯著誘導(dǎo)HUVECs損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低(P<0.01)，LDH漏出增加(P<0.01)；而以EEP(30 mg/L)預(yù)處理HUVECs 1 h，可以明顯減輕TM 誘導(dǎo)的HUVECs活力降低和LDH漏出(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡和caspase-3活化

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ox-LDL 可使HUVECs總細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；與PBA預(yù)處理組相似，以7.5、15和30 mg/L EEP預(yù)處理HUVECs 1 h，可以減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，尤其以30 mg/L EEP預(yù)處理組更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖3A。

細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性測(cè)定結(jié)果顯示，ox-LDL可使caspase-3活性明顯增加，而EEP可以顯著降低ox-LDL 誘導(dǎo)的caspase-3活性增高(P<0.01)，與PBA預(yù)處理組相似，見(jiàn)圖3B。

Figure 1. EEP inhibited ox-LDL-induced decrease in the viability of HUVECs and LDH release. HUVECs were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or PBA (4 mmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. A: cell viability determined by MTT assay; B: LDH activity in the media. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖1EEP抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs活力降低和LDH漏出

4EEP抑制TM誘導(dǎo)的HUVECs凋亡和caspase-3活化

TM可使HUVECs總細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，caspase-3活性顯著上調(diào)(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預(yù)處理可以減輕TM所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和caspase-3活化(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

5EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)和Bcl-2下調(diào)

Western blot分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ox-LDL可使CHOP蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，而降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05)；與PBA預(yù)處理相似，EEP預(yù)處理可明顯抑制ox-LDL所致的CHOP蛋白上調(diào)和Bcl-2下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5A。

采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CHOP的mRNA表達(dá)，結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，EEP明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP的mRNA上調(diào)，以 30 mg/L EEP預(yù)處理組尤為顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖5B。

Figure 2. EEP inhibited TM-induced decrease in the viability of HUVECs and LDH release. HUVECs were pretreated with EEP (30 mg/L) for 1 h and then treated with TM (4 mg/L) for 24 h. A: the cell viability determined by MTT assay; B: LDH activity in the media. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&P<0.05vsTM group.

圖2EEP抑制TM所誘導(dǎo)的HUVECs活力降低和LDH漏出

6EEP抑制TM誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)

TM可在蛋白和mRNA水平均明顯上調(diào)CHOP表達(dá)(P<0.01)；而與TM組比較， EEP預(yù)處理組CHOP蛋白和mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6 。

討 論

AS是一種慢性進(jìn)行性血管炎癥性疾病，作為心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)嚴(yán)重危害人類健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能紊亂是AS發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，而ox-LDL是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成及粥樣斑塊的形成和破裂[11]。因此減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AS防治的重要措施。本工作在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷模型上觀察到，EEP可明顯抑制細(xì)胞活力降低和LDH漏出，并顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及caspase-3活化，其作用與ERS抑制劑PBA相似。另外，在ERS誘導(dǎo)劑TM誘導(dǎo)的HUVECs損傷模型上也觀察到EEP類似的保護(hù)作用，提示EEP能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與抑制ERS介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。

Figure 3. EEP inhibited ox-LDL-induced apoptosis of HUVECs. HUVECs were treated as described in Figure 1. A: the cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total (early- and late-stage) apoptotic cells were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI); B: caspase-3 activity was determined by colorimetric assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsox-LDL group.

圖3EEP抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白合成和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要細(xì)胞器，并參與脂質(zhì)合成和氧化還原平衡的維持。在缺氧、氧化應(yīng)激、膽固醇超負(fù)荷等致病因素的作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊和/或錯(cuò)誤折疊蛋白積聚和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度的ERS反應(yīng)通過(guò)暫時(shí)性抑制蛋白合成，促進(jìn)分子伴侶表達(dá)有利于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和細(xì)胞生存，但是過(guò)強(qiáng)或過(guò)久的應(yīng)激則通過(guò)激活ERS相關(guān)凋亡途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致不可逆損傷[12]。CHOP 又稱生長(zhǎng)停滯和DNA損害誘導(dǎo)基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD153)，是介導(dǎo)ERS 相關(guān)凋亡途徑的關(guān)鍵分子之一[12]。大量研究表明，CHOP介導(dǎo)AS粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，并在AS易損斑塊的形成中具有重要作用，而CHOP缺陷可抑制巨噬細(xì)胞凋亡，縮小粥樣斑塊壞死面積[13-15]。本課題組前期工作[16-18]和文獻(xiàn)報(bào)道[19]表明，ox-LDL通過(guò)激活CHOP信號(hào)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2有關(guān)，而EEP和槲皮素通過(guò)抑制該信號(hào)途徑抑制巨噬細(xì)胞凋亡，表明CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑參加AS的發(fā)生發(fā)展，并有可能成為AS防治的重要靶點(diǎn)。來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞的研究表明，CHOP介導(dǎo)ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20-21]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ERS抑制劑PBA相似，EEP在mRNA和蛋白水平均明顯減輕ox-LDL所致的HUVECs中CHOP上調(diào)，并抑制 ox-LDL對(duì)下游 Bcl-2 的下調(diào)作用；另外，對(duì)于ERS誘導(dǎo)劑TM誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)，EEP也有類似的抑制作用。

Figure 4. EEP inhibited TM-induced apoptosis of HUVECs. HUVECs were treated as described in Figure 2. A: the cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total (early- and late-stage) apoptotic cells were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI); B: caspase-3 activity was determined by colorimetric assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTM group.

圖4EEP抑制TM所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

Figure 5. EEP inhibited ox-LDL-induced CHOP upregulation and Bcl-2 downregulation. HUVECs were treated as described in Figure 1. The protein levels of CHOP and Bcl-2, and the mRNA levels of CHOP were detected using Western blot (A) and real-time PCR (B), respectively. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖5EEP抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)和Bcl-2下調(diào)

Figure 6. EEP inhibited TM-induced CHOP upregulation. HUVECs were treated as described in Figure 2. The protein and mRNA levels of CHOP were detected using Western blot (A) and real-time PCR (B), respectively. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&P<0.05,&&P<0.01vsTM group.

圖6EEP抑制TM所誘導(dǎo)的CHOP上調(diào)

綜上所述，本研究結(jié)果提示EEP可減輕 ox-LDL 所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，其機(jī)制可能與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Ethanol extract of propolis protects vascular endothelial cells from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting C/EBP homologous protein expression

XU Xiao-yan1, SHAO Xia-yan2, LIU Ying-xue2, LI Dong-xuan3, JIAO Peng4，HAO Qi3, TIAN Hua4, YAO Shu-tong3

(1College of Pharmacy，2College of Population and Family Planning，3College of Basic Medical Sciences，4Institute of Atherosclerosis, Taishan Medical University, Taian 271000, China. E-mail: yst228@126.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of ethanol extract of propolis (EEP) on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced vascular endothelial cell apoptosis and the underlying molecular mechanisms.METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or 4-phenylbutyric acid (PBA, 4 mmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and Annexin V-FITC/PI double staining, respectively. The activities of lactic dehydrogenase (LDH) in the medium and caspase-3 in the HUVECs were measured. The protein and mRNA levels of C/EBP homologous protein (CHOP), a proapoptotic molecule under endoplasmic reticulum stress (ERS), and its downstream Bcl-2 were examined by Western blot and real-time PCR, respectively.RESULTS: Like PBA (an ERS inhibitor), EEP protected HUVECs from ox-LDL-induced injury in a dose-dependent manner, as assessed by the increased cell viability and the decreased LDH release, apoptotic rate and caspase-3 activation. The decrease in cell viabi-lity and the increases in LDH release, apoptotic rate and caspase-3 activation induced by TM, an ERS inducer, were also attenuated by EEP. Moreover, EEP suppressed ox-LDL-induced CHOP upregulation and Bcl-2 downregulation, and this effect was similar to that of PBA. Similarly, EEP significantly suppressed TM-induced CHOP upregulation both at the protein and mRNA levels.CONCLUSION: EEP may protect HUVECs from ox-LDL-induced apoptosis, and the mechanism is at least partially involved in suppressing CHOP-mediated ERS-associated apoptotic pathway.

Ethanol extract of propolis; C/EBP homologous protein; Oxidized low-density lipoprotein; Vascular endothelial cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1551- 07

2017- 03- 22 [

] 2017- 05- 03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81570410； No. 81202949)；泰山醫(yī)學(xué)院國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No. 201510439100； No. 201510439126)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(No. J14LM52)

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.003

△通訊作者 Tel： 0538-6225010； E-mail: yst228@126.com

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