張亞輝， 汪 雄， 吳勝英， 彭吉霞， 武福云， 柯 鏡， 張 鵬， 張秋芳， 呂艷霞

(湖北醫(yī)藥學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 湖北 十堰 442000)

核受體NR6A1通過上調(diào)RIPK3基因表達(dá)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡*

張亞輝， 汪 雄， 吳勝英， 彭吉霞， 武福云， 柯 鏡， 張 鵬， 張秋芳， 呂艷霞△

(湖北醫(yī)藥學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 湖北 十堰 442000)

目的： 探討核受體亞家族6A1(NR6A1)對血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。方法: 將腺病毒Ad-NR6A1感染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，分別在感染后0 h、24 h和48 h時進(jìn)行MTT實驗，以時間為橫坐標(biāo)，A570為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，觀察NR6A1對細(xì)胞生長的影響；進(jìn)行DAPI染色、TUNEL染色及caspase活性檢測，觀察細(xì)胞凋亡情況； 進(jìn)一步通過基因芯片技術(shù)，尋找NR6A1的靶基因；采用siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，觀察受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(RIPK3)基因沉默對NR6A1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果: 腺病毒Ad-NR6A1感染細(xì)胞48 h時，NR6A1過表達(dá)組細(xì)胞數(shù)量較對照組(重組腺病毒載體Ad-LacZ)明顯減少；DAPI染色顯示NR6A1過表達(dá)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮和核碎裂的凋亡表型，TUNEL染色顯示NR6A1過表達(dá)引起細(xì)胞凋亡，caspase活性檢測結(jié)果顯示NR6A1過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均較對照組高；基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，NR6A1過表達(dá)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中RIPK3基因表達(dá)；RIPK3基因沉默可以顯著抑制NR6A1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡。結(jié)論: NR6A1通過上調(diào)RIPK3基因表達(dá)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

核受體亞家族6A1； 受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3； 細(xì)胞凋亡

核受體亞家族6A1(nuclear receptor subfamily 6，group A，member 1，NR6A1)又名生殖細(xì)胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF)，是目前發(fā)現(xiàn)的核受體超家族第6亞族唯一的成員。核受體家族在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、生殖、代謝及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮了重要作用。已有研究表明NR6A1在生殖及神經(jīng)發(fā)育中具有重要生物學(xué)作用。NR6A1通過調(diào)節(jié)魚精蛋白、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶、endozepine樣肽等基因的表達(dá)，影響精子的成熟、活力[1-3]；NR6A1還可以下調(diào)BMP-15和GDF-9基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育[4]。NR6A1基因缺陷的小鼠胚胎出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙及心血管缺陷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NR6A1能夠抑制Oct4基因表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化[6]；通過抑制miR-302a調(diào)節(jié)cyclin D1表達(dá)，影響胚胎干細(xì)胞分化[7]。Rajkovic等[2]報道，NR6A1能夠與CREMτ競爭結(jié)合靶基因啟動子，影響下游基因表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞中的NR6A1能夠與細(xì)胞核actin和RNA聚合酶Ⅱ形成復(fù)合物，抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性骨橋蛋白(osteopontin)的轉(zhuǎn)錄水平，并調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞遷移[8]。本研究觀察了NR6A1對血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1材料和試劑

Ad-NR6A1腺病毒由本實驗室制備[9]；DMEM及胎牛血清購自Gibco；小鼠抗FLAG標(biāo)簽抗體和TRITC偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz；紫杉醇(paclitaxel)購自成都曼思特生物科技公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和caspase活性檢測試劑盒購自Millipore；小鼠抗受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2，RIPK2)和RIPK3抗體購自Santa Cruz；RIPK3干擾片段購自上海生工生物科技有限公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Clontech。

2方法

2.1免疫熒光化學(xué)染色技術(shù) 將體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至90%融合。將Ad-NR6A1感染細(xì)胞，24 h后細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)的免疫熒光化學(xué)染色，用抗FLAG標(biāo)簽抗體為 I 抗在4 ℃孵育過夜，隨后用TRITC標(biāo)記的 II 抗顯示NR6A1的表達(dá)，用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，采用相同種屬的IgG作為陰性對照抗體，在共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果并照相。

2.2RNA提取及RT-qPCR技術(shù) 將體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至90%融合。然后向細(xì)胞加入10 nmol/L濃度的paclitaxel，分別在0 h、6 h、12 h和24 h后用Trizol試劑提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒做RT-qPCR反應(yīng)，檢測靶基因的表達(dá)。

2.3細(xì)胞凋亡的檢測 如上述方法接種血管平滑肌細(xì)胞于6孔板中，將Ad-NR6A1-FLAG感染細(xì)胞，分別在感染后0 h、24 h和48 h時進(jìn)行MTT實驗，以時間為橫坐標(biāo)，A570為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，觀察NR6A1對細(xì)胞生長的影響；進(jìn)行DAPI染色和TUNEL染色，觀察細(xì)胞凋亡情況。Ad-NR6A1感染細(xì)胞48 h后用4%多聚甲醛固定，加入新鮮配制的TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，在共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果并照相。Caspase活性檢測按試劑盒操作要求，在Ad-NR6A1感染細(xì)胞48 h后裂解細(xì)胞，離心收集上清，使樣品與底物37 ℃孵育約2 h，測定A570值，根據(jù)對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品A值，計算出caspase酶活性。

2.4蛋白免疫印跡技術(shù) 收集腺病毒感染后的細(xì)胞，制備蛋白樣品。Ad-NR6A1感染血管平滑肌細(xì)胞24～48 h后收集細(xì)胞，運(yùn)用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白變性后采用SDS-PAGE及ECL顯色檢測相關(guān)蛋白水平。

2.5siRNA介導(dǎo)的基因沉默 將體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至60%～80%融合，使用前換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別用Opti-MEM reduced serum medium 稀釋Lipo2000與siRNA,將稀釋好的siRNA與Lipo2000輕輕混勻，室溫培養(yǎng)20～25 min，將siRNA-Lipo2000混合液加入細(xì)胞，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞提取總蛋白，運(yùn)用Western blot檢測基因沉默效果。

2.6基因表達(dá)譜芯片技術(shù) Ad-LacZ或者Ad-NR6A1感染血管平滑肌細(xì)胞24h，采用Trizol法提取總RNA，由上海生工生物技術(shù)有限公司行Affymetrix表達(dá)譜分析。

3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1NR6A1表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞核中

既往研究顯示NR6A1表達(dá)于細(xì)胞核中。我們首先觀察了NR6A1在平滑肌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。免疫熒光化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞中所表達(dá)的融合蛋白NR6A1與細(xì)胞核有共定位，提示NR6A1定位在血管平滑肌細(xì)胞核內(nèi)，見圖1。

Figure 1. The sub-cellular localization of NR6A1 in the VSMCs (×400). VSMCs were infected with Ad-NR6A1 for 24 h. Indirect immunofluorescence staining of VSMCs with anti-NR6A1 and tetramethylrhodamine isothiocyanate-conjugated donkey anti-rabbit antibodies was performed. The nuclei stained with DAPI were shown. The negative controls were stained with normal IgG only. The arrows pointed at VSMCs were positive for NR6A1.

圖1免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測NR6A1在平滑肌細(xì)胞中的定位

2紫杉醇增加血管平滑肌細(xì)胞中NR6A1的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，在紫杉醇處理平滑肌細(xì)胞12 h和24 h后，可以抑制細(xì)胞中actin的表達(dá)，同時NR6A1 mRNA的表達(dá)較對照組明顯增加，提示NR6A1是紫杉醇的靶基因，見圖2。

Figure 2. The effect of paclitaxel on mRNA expression of NR6A1 in the VSMCs. Serum-starved VSMCs were treated with paclitaxel for 6 h, 12 h and 24 h. The mRNA levels of NR6A1 were measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2紫杉醇對平滑肌細(xì)胞中NR6A1mRNA表達(dá)的影響

3NR6A1過表達(dá)引起血管平滑肌細(xì)胞凋亡

在Ad-NR6A1感染細(xì)胞后0 h、24 h和48 h時進(jìn)行MTT實驗，Western blot顯示腺病毒誘導(dǎo)NR6A1蛋白過表達(dá)(圖3A)。以時間為橫坐標(biāo)，A570為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果表明，48 h時NR6A1過表達(dá)組細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少(圖3B)。DAPI染色顯示NR6A1過表達(dá)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮和核碎裂的凋亡表型，TUNEL染色結(jié)果顯示NR6A1過表達(dá)引起細(xì)胞凋亡(圖3C)。進(jìn)一步的caspase活性檢測結(jié)果顯示NR6A1過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均較對照組高(圖3D)。

4凋亡信號基因RIPK3是NR6A1靶基因

本研究通過基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，NR6A1過表達(dá)可以上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中的169個基因，下調(diào)217個基因(圖4A)。另外我們對挑選出來的差異表達(dá)基因做了gene ontology的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)NR6A1參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、蛋白水解、發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程(圖4B)。其中，凋亡信號調(diào)節(jié)基因RIPK3是NR6A1的靶基因，芯片結(jié)果顯示NR6A1過表達(dá)可以上調(diào)平滑肌細(xì)胞中RIPK3基因表達(dá)(圖4C)。進(jìn)一步采用蛋白免疫實驗發(fā)現(xiàn)，NR6A1過表達(dá)可以增加平滑肌細(xì)胞RIPK2和RIPK3的蛋白表達(dá)，其中主要增加了RIPK3的表達(dá)(圖4D)。

Figure 3. The effect of NR6A1 over-expression on VSMC apoptosis. VSMCs were infected by Ad-LacZ or Ad-NR6A1 at 100 MOI for 48 h. A: NR6A1 protein levels in the cells were determined by Western blot; B: the cell viability was assessed by MTT assay; C: the cell apoptosis was analyzed by TUNEL assay (×200); D: the activities of caspase-3, 8 and 9 in the VSMCs were measured by colorimetric enzymatic assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsAd-LacZ group.

圖3NR6A1過表達(dá)對平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of NR6A1 over-expression on VSMC signal pathways and RIPK expression. A: log-log scatter plot of NR6A1 over-expression group (X axis) and control group (Y axis) was shown (the red labeled valid points and green labeled valid points were the ratio values of the fluorescence signal intensity in the 2 groups ≥2 or ≤0.5, respectively, indicating the genes with differential expression； the black labeled valid points were the ratio values of the fluorescence signal intensity in the 2 groups between 0.5 and 2, indicating the genes without differential expression); B: statistic analysis of gene ontology (GO) for the differentially expressed genes (the minimalPvalues of the 10 categorizations of GO analysis were shown); C: the effect of NR6A1 over-expression on RIPK expression was measured by DNA microarray; D: the effect of NR6A1 over-expression on RIPK expression was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsAd-LacZ group.

圖4NR6A1過表達(dá)對平滑肌細(xì)胞信號途徑和RIPK表達(dá)的影響

5RIPK3基因沉默抑制NR6A1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡

本研究采用siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，敲低了RIPK3基因，觀察RIPK3基因是否是NR6A1誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，RIPK3基因沉默可以顯著抑制NR6A1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡，見圖5。

Figure 5.RIPK3 silencing inhibited NR6A1-induced apoptosis of the VSMCs. The VSMCs were transfected withRIPK3 siRNA fragments for 24 h. A: the protein expression of RIPK3 was determined by Western blot; B: the cell viability was analyzed by MTT assay； C: the caspase activities were measured. Mean±SD.n=3.*P< 0.05,**P<0.01vsAd-LacZ group;#P<0.05vsscrambled siRNA group.

圖5RIPK3基因沉默對NR6A1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

討 論

心腦血管疾病已成為目前死亡率最高的疾病，其具有“發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高”的特點，嚴(yán)重威脅中老年人健康。它們共同的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化、內(nèi)膜增生。病變部位主要在大型及中型肌彈力型動脈，尤其以主動脈、冠狀動脈及腦動脈多見。在動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中，血管平滑肌細(xì)胞從動脈中膜增殖并遷移至內(nèi)膜下是動脈粥樣硬化及內(nèi)膜增生的重要發(fā)病環(huán)節(jié)之一，造成血管腔狹窄，是引起血管腔閉塞的重要原因[10]。因此探尋抑制平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移或促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是心腦血管疾病研究領(lǐng)域的熱點問題。

NR6A1是目前發(fā)現(xiàn)的核受體超家族第6亞族唯一的成員。核受體超家族在調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育、生殖、代謝及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮了重要作用[11-13]。人與大鼠NR6A1基因的同源性、蛋白結(jié)構(gòu)功能的一致性超過90%。NR6A1由A/B、C、D和E四個結(jié)構(gòu)域組成：A/B區(qū)高度可變，包含至少一種本身有活性的配體非依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域；保守的C域為DNA結(jié)合區(qū)，包含2個鋅指結(jié)構(gòu)可以和靶基因上的激素應(yīng)答元件或其它特異性DNA序列結(jié)合，如AGGTCAAGGTCA及TCAAGGTCAAGGTCA；D域為一鉸鏈區(qū)可與輔抑制子結(jié)合；最大的E域能夠與配體結(jié)合，二聚體化并被激活，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)控下游靶基因[14]。但是與其它核受體不同的是，NR6A1對靶基因的作用主要表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。比如，NR6A1可以下調(diào)BMP-15和GDF-9基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育[4]；NR6A1能夠抑制Oct4基因表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化[6]；還通過抑制miR-302a調(diào)節(jié)cyclin D1表達(dá)，影響胚胎干細(xì)胞分化[7]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，NR6A1過表達(dá)能夠抑制PDGF-BB和血清誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移，NR6A1可以與RNA聚合酶Ⅱ和細(xì)胞核中的actin形成大復(fù)合物，并進(jìn)而結(jié)合cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)，抑制CREB對分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein-1，SPP1)基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而下調(diào)SPP1基因表達(dá)[8]。可見，NR6A1是調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的重要分子。

本研究進(jìn)一步探討了NR6A1過表達(dá)對平滑肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR6A1過表達(dá)48 h可引起平滑肌細(xì)胞明顯凋亡，細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均升高，以caspase-3活性升高最明顯。進(jìn)一步的實驗表明NR6A1過表達(dá)能增加RIPK3的基因表達(dá)。RIPK3是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白家族的一員，其氨基端為特征性的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，羧基端為RIPK3所獨(dú)有的結(jié)構(gòu)域[14]。有研究顯示，作為腫瘤壞死因子受體1信號復(fù)合物的一部分，RIPK3能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)RIPK3基因沉默則抑制NR6A1過表達(dá)誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡。因此我們認(rèn)為NR6A1很可能通過上調(diào)RIPK3的基因表達(dá)，啟動平滑肌細(xì)胞內(nèi)的caspase凋亡信號通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。NR6A1調(diào)節(jié)RIPK的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

NR6A1 promotes vascular smooth muscle cell apoptosis by up-regulating RIPK3 gene expression

ZHANG Ya-hui, WANG Xiong, WU Sheng-ying, PENG Ji-xia, WU Fu-yun, KE Jing, ZHANG Peng, ZHANG Qiu-fang, LV Yan-xia

(Department of Pathophysiology, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China. E-mail: 350182495@qq.com)

AIM: To determine the role of nuclear receptor subfamily 6， group A， member 1 (NR6A1) in vascular smooth muscle cell (VSMC) apoptosis.METHODS: NR6A1 protein was over-expressed in the VSMCs by infection of adenovirus. The effect of NR6A1 on the viability of VSMCs was measured by MTT assay. DAPI staining, TUNEL staining and caspase activity assay were conducted. DNA microarray was used to quickly screen the target genes of NR6A1. The effect of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3) silencing on NR6A1-induced apoptosis of the VSMCs was further analyzed.RESULTS: Adenovirus-mediated over-expression of NR6A1 induced the apoptosis of VSMCs. TheRIPK3 gene expression was up-regulated by NR6A1 over-expression in the VSMCs. NR6A1-induced VSMC apoptosis was inhibited byRIPK3 silencing.CONCLUSION: NR6A1 promotes VSMC apoptosis by up-regulating theRIPK3 gene expression.

Nuclear receptor subfamily 6， group A， member 1; Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1581- 06

2017- 02- 16 [

] 2017- 07- 12

湖北省教育廳科學(xué)研究計劃指導(dǎo)性項目(No. B2015492)；湖北省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2014CFB187)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81641140)

R363.1； R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.007

△通訊作者 Tel: 0719-8875312; E-mail: 350182495@qq.com