李秀娟， 沈 慧， 魏林郁， 王國紅， 張利彬， 李超堃， 李新娟， 王 璐， 趙紅崗， 宋景貴， 李東亮△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室， 2第三附屬醫(yī)院， 3第二附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

孕酮減輕ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷*

李秀娟1， 沈 慧2， 魏林郁1， 王國紅1， 張利彬1， 李超堃1， 李新娟1， 王 璐1， 趙紅崗1， 宋景貴3， 李東亮1△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，2第三附屬醫(yī)院，3第二附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的： 探討孕酮對抗腺苷三磷酸(ATP)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護作用和機制。方法：取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞按照孕酮或ATP濃度的不同進行分組，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，YO-PRO-1染色檢測細(xì)胞膜通透性，F(xiàn)luo-3染色檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，Western blot法檢測嘌呤能P2X7受體表達的變化。結(jié)果：與對照組相比，不同濃度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h，SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),細(xì)胞攝入YO-PRO-1的熒光強度明顯增加(P<0.05)，且呈劑量依賴性。濃度為3、10和30 nmol/L的孕酮預(yù)孵育30 min可減輕ATP損傷作用，細(xì)胞存活率較單純ATP組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。孕酮(30 nmol/L)或P2X7受體拮抗劑KN-62 (500 nmol/L)預(yù)孵育30 min均可顯著抑制ATP誘導(dǎo)的胞內(nèi)YO-PRO-1的熒光增強(P<0.01)，而孕酮和KN-62兩者之間沒有明顯差異。正常組細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量少，ATP組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度較對照組明顯增高(P<0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62 (500 nmol/L)預(yù)孵育30 min可明顯降低(P<0.05)ATP 誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣熒光增強,而孕酮和KN-62兩者之間的作用無明顯差異。ATP組SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體表達較對照組明顯增加(P<0.05)，而孕酮(30 nmol/L)預(yù)孵育30 min則可顯著降低ATP誘導(dǎo)的P2X7受體表達(P<0.05)。結(jié)論：孕酮可抑制ATP誘導(dǎo)的P2X7受體表達、膜孔形成和胞內(nèi)Ca2+升高，降低細(xì)胞死亡率，明顯減輕高濃度ATP 對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。

孕酮； 腺苷三磷酸； 嘌呤能P2X7受體； SH-SY5Y細(xì)胞

腦創(chuàng)傷、腦卒中、阿爾茨海默病等是常見病、多發(fā)病，其死亡率和致殘率僅次于癌癥和心血管疾病而居第3位。這些中樞神經(jīng)疾患除了原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性損傷又稱二次損傷，主要由損傷區(qū)局部水腫、缺血、缺氧、氧化應(yīng)激、興奮毒作用等所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死。越來越多的證據(jù)表明損傷區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放大量的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)在繼發(fā)性損傷中起著重要作用[1]。目前研究表明胞外高濃度 ATP激活膠質(zhì)細(xì)胞后引起繼發(fā)性的二次損傷主要與嘌呤能P2X7受體(purinergic P2X7receptor, P2X7R)介導(dǎo)有關(guān)[2]。高濃度ATP反復(fù)持久作用于P2X7受體，則形成大的“膜孔”，允許各種陽離子和900 D以下的有機物質(zhì)通過[3]。Ferrari等[4]認(rèn)為高濃度ATP激活P2X7受體，誘導(dǎo)大量Ca2+內(nèi)流、K+外流以及促炎性細(xì)胞因子的釋放等，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡，而抑制P2X7受體活化可降低細(xì)胞興奮性從而減少細(xì)胞死亡[5]。

幾十年來人們致力于腦缺血、腦損傷干預(yù)的研究，但至今仍缺乏在臨床上確實安全有效的藥物[6]。孕酮(progesterone，PROG)是一種內(nèi)源性的雌性激素，近年來的許多細(xì)胞和動物實驗表明，孕酮可減輕腦水腫，減少炎癥級聯(lián)反應(yīng)，延緩神經(jīng)細(xì)胞的壞死、凋亡，促進血腦屏障重建，加速神經(jīng)髓鞘修復(fù)，顯示了良好的應(yīng)用前景[7]。然而孕酮是否通過調(diào)控膜孔相關(guān)蛋白的表達和功能發(fā)揮神經(jīng)保護作用，目前未見文獻報道。本實驗以SH-SY5Y細(xì)胞為對象，在研究ATP-P2X7R嘌呤信號通路的基礎(chǔ)上探究孕酮的影響及作用機制。

材 料 與 方 法

1材料

1.1主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(BI)；PBS、Hanks緩沖液和D-Hanks緩沖液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；ATP、孕酮、鼠抗GAPDH抗體和KN-62(Sigma)；兔抗P2X7受體抗體(Alomone Labs)；蛋白Marker(上海生物工程股份有限公司)；YO-PRO-1 Iodide(Invitrogen)；Cell Counting Kit-8 (CCK8;廣州晶欣生物科技有限公司)；Fluo-3/AM(日本同仁公司)。

1.2細(xì)胞系 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞來自上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.2CCK-8實驗檢測細(xì)胞存活率 (1)分組：ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率變化的實驗分4組，各組細(xì)胞分別在含0、1、3和5 mmol/L 濃度的ATP培養(yǎng)液中處理2 h，0 mmol/L ATP(control)組在常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，無ATP處理。孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率影響的實驗也分4組，各組細(xì)胞分別在含0、3、10和30 nmol/L孕酮的培養(yǎng)液預(yù)孵育30 min，然后在含ATP(5 mmol/L濃度)的培養(yǎng)液(每孔100 μL)中處理2 h。(2)檢測：對數(shù)生長期密度為5×107/L的SH-SY5Y細(xì)胞接種于高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔100 μL)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。按照上述分組進行處理后，棄原有培養(yǎng)液。置入含10% CCK-8溶液的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔100 μL)，在37 ℃避光孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測各組吸光度(A)。 計算公式如下：細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。本實驗將對照組細(xì)胞存活率定為100%，每組6個平行復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.3YO-PRO-1攝入檢測細(xì)胞膜通透性 YO-PRO-1是一種陽離子熒光染料(分子量為629)，可以透過膜孔形成的損傷細(xì)胞膜，與核酸反應(yīng)在激發(fā)光的作用下顯綠光，但正常細(xì)胞不通透。(1)分組：ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜通透性變化的實驗分4組，各組細(xì)胞分別在含0、1、3和5 mmol/L ATP的培養(yǎng)液中處理2 h，0 mmol/L ATP(control)組在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無ATP處理。孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜通透性變化的影響也分為4組：正常對照組、ATP組、孕酮+ATP組和KN-62+ATP組。正常對照組在常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；ATP組在ATP(5 mmol/L)的培養(yǎng)基中處理2 h；孕酮+ATP組在孕酮(30 nmol/L)先孵育 30 min，后置于含ATP(5 mmol/L)的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔100 μL)作用2 h；KN-62+ATP組在KN-62(500 nmol/L)先孵育 30 min，再置于含ATP(5 mmol/L)的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔100 μL)作用2 h。(2)檢測：對數(shù)生長期密度為5×107/L的SH-SY5Y細(xì)胞接種于高糖DMEM培養(yǎng)基的96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。按照上述分組進行處理后，棄原有培養(yǎng)液。置換入含YO-RRO-1(2 μmol/L)的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育1 h。然后多功能酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm)各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強度。熒光強度(%)=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。本實驗將對照組細(xì)胞攝取的熒光強度定為100%，每組6個平行復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.4Fluo-3/AM檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度 對數(shù)生長期密度為5×107/L的SH-SY5Y細(xì)胞接種于高糖DMEM培養(yǎng)基的96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，隨機分為正常對照組、ATP組、孕酮+ATP組和KN-62+ATP組。經(jīng)孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)先孵育 30 min，后置于含ATP(5 mmol/L)的高糖DMEM培養(yǎng)基作用2 h，棄原有培養(yǎng)液，用Hanks溶液洗滌細(xì)胞 3 次，加入Fluo-3/AM(5 μmol/L)和Hoechst 33342(2 μmol/L)的無血清、無酚紅H-DMEM培養(yǎng)液，各組37 ℃孵育30 min。Fluo-3/AM熒光染料染色細(xì)胞內(nèi)Ca2+，Hoechst 33258熒光染料染細(xì)胞核。Carl Zeiss熒光顯微鏡，型號Axio Vert.A1，Axiocam 506拍照，ZEN 2.1 (blue edition)圖像分析模塊分析記錄結(jié)果，測定每組細(xì)胞中Ca2+的平均熒光強度，實驗重復(fù)3次。

2.5Western blot 檢測P2X7受體的表達 用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS洗滌、離心，重復(fù)2次；細(xì)胞裂解液200 μL裂解細(xì)胞40 min，低溫12 000×g離心45 min，取上清液，棄沉淀。BCA法測蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂牛奶，37 ℃封閉1 h，加入兔抗大鼠P2X7受體抗體(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；曝光顯色，并記錄結(jié)果。該實驗中以GAPDH為內(nèi)參照蛋白。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析， 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的的變化

CCK-8法檢測結(jié)果示，以空白對照組細(xì)胞存活率為100%，1、3、5和7 mmol/L ATP組存活率分別為80.4%、71.7%、56.1%和36.2%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著胞外ATP濃度的增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. The effect of ATP at different concentrations for 2 h on the viability of the SH-SY5Y cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1不同濃度的ATP對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜通透性的變化

0、1、3、5和7 mmol/L的ATP作用于SH-SY5Y細(xì)胞2 h，以對照組(0 mmol/L ATP)的胞內(nèi)YO-PRO-1的熒光強度為100%，其余則分別是103.5%、108.6%、120.5%和140.6%，隨著ATP濃度的升高，胞內(nèi)的熒光強度明顯增加，其中3、5和7 mmol/L ATP組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見圖2。

Figure 2. The effect of ATP at different concentrations for 2 h on the uptake of YO-PRO-1 in SH-SY5Y cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2不同濃度的ATP對SH-SY5Y細(xì)胞攝入YO-PRO-1的影響

3孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

分別給予3、10、30和100 nmol/L孕酮預(yù)孵育30 min后，各組加入ATP(5 mmol/L)處理2 h觀察細(xì)胞存活率的變化。設(shè)正常對照組細(xì)胞存活率為100%，ATP處理組的存活率為56.1%，3、10、30和100 nmol/L孕酮+ATP組分別為62.8%、64.6%、74.4%和59.7%。在30 nmol/L范圍內(nèi)，隨著孕酮濃度的增加，逆轉(zhuǎn) ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降的作用增強，但100 nmol/L時，這種作用減弱，見圖3。

Figure 3. The effect of progesterone on the viability of ATP-da-maged SH-SY5Y cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsATP group．

圖3孕酮對ATP損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

4孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜孔形成的影響

熒光顯微鏡下觀察YO-PRO-1的結(jié)果，與對照組相比，ATP組胞內(nèi)YO-PRO-1熒光信號明顯增強，而孕酮+ATP組和KN-62+ATP組熒光信號明顯低于ATP組。多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果示，孕酮+ATP組和KN-62+ATP組細(xì)胞內(nèi)熒光強度分別為103.9%和98.23%，均明顯低于ATP(5 mmol/L)組的120.5%(P<0.01)，而與對照組無顯著差別(P>0.05)，見圖4。

5孕酮對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響

正常細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量少且穩(wěn)定。ATP處理組平均熒光值隨著ATP作用時間的延長逐漸增高，即胞內(nèi)鈣離子逐漸增高。與ATP組相比，孕酮+ATP組和KN-62+ATP組胞內(nèi)鈣離子均明顯降低(P<0.05),見圖5。

Figure 4. The effect of progesterone (PROG) and KN-62 on YO-PRO-1 uptake induced by ATP in the SH-SY5Y cells (×400). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsATP group．

圖4孕酮和KN-62對ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞攝入YO-PRO-1的影響

6孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體表達的影響

Western blot實驗結(jié)果示，ATP處理后SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體蛋白表達明顯增加(P<0.05)，而預(yù)先給予孕酮預(yù)孵育，P2X7受體蛋白表達水平則明顯低于ATP處理組(P<0.05)，由此看來孕酮能抑制ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體蛋白表達的上調(diào)，見圖6。

討 論

至今繼發(fā)性腦損傷仍缺乏理想的治療方法和手段，而孕酮作為神經(jīng)甾體對腦損傷的保護作用已有較多的報道。許多動物模型實驗表明，孕酮可延緩神經(jīng)細(xì)胞的壞死、凋亡，促進血腦屏障重建，減少炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕腦水腫，促進神經(jīng)髓鞘合成[7]，并且能改善與年齡有關(guān)的阿爾茨海默病[8]、帕金森病[9]等神經(jīng)退行性病變。在大鼠腦損傷動物實驗中證實孕酮可降低caspase-3活性，減少細(xì)胞凋亡[10]。Lockhart等[11]在N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的體外凋亡模型中，也發(fā)現(xiàn)低濃度孕酮代謝產(chǎn)物別孕烯醇酮預(yù)處理可使凋亡細(xì)胞數(shù)下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性。Hoffman等[12]還發(fā)現(xiàn)低劑量孕酮可以顯著減輕卵巢切除后大鼠癲癇發(fā)作。雖然大量的動物試驗證實孕酮的神經(jīng)保護作用，但其機制仍不明了。

Figure 5. The effect of progesterone (PROG) and KN-62 on Ca2+concentrations induced by ATP in SH-SY5Y cells (×400)．Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsATP group．

圖5孕酮和KN-62對胞外ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

Figure 6. The effect of progesterone (PROG) on the protein expression of P2X7receptor (P2X7R) induced by ATP in the SH-SY5Y cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsATP group.

圖6孕酮對ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體表達的影響

腦組織 ATP 主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放，且具有遞質(zhì)活性，故稱為膠質(zhì)遞質(zhì)。生理情況下胞內(nèi)ATP達mmol/L濃度，胞外μmol/L水平。胞外μmol/L水平的ATP可激活P2X7R，形成陽離子通道，介導(dǎo)Ca2+、Na+內(nèi)流以及K+外流，使細(xì)胞去極化，維持神經(jīng)細(xì)胞正常興奮活動。而在腦外傷、腦缺血、炎癥等些病理情況下，受傷局部的膠質(zhì)細(xì)胞釋放出大量 ATP 及其降解產(chǎn)物，且向鄰近區(qū)域擴散，高濃度ATP長時間或者反復(fù)刺激細(xì)胞膜上P2X7R，形成允許各種陽離子和900 D以下的有機物質(zhì)通過的“膜孔”，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡而死亡。膜孔形成可加速Ca2+內(nèi)流，引起鈣超載，使膠質(zhì)細(xì)胞釋放致炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷[13]。Suadicani等[14]采用表達P2X7受體的人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤1321N1細(xì)胞系作為實驗對象，發(fā)現(xiàn)苯甲酰苯甲酸腺嘌呤核苷三磷酸可使胞內(nèi)Ca2+濃度、YO-PRO-1攝取及ATP釋放明顯增加。有研究表明ATP作用于分化的NG108-15神經(jīng)細(xì)胞，激活P2X7受體后不僅引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而且通過三磷酸肌醇受體介導(dǎo)鈣釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[15]。因此鈣超載也是P2X7R產(chǎn)生毒性作用的重要因素。既然 ATP 濃度升高激活P2X7R是中樞或外周神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的普遍現(xiàn)象，孕酮對神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的保護作用也已得到證實。孕酮是否可通過調(diào)控 P2X7R 的激活來干預(yù)ATP誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷，實現(xiàn)神經(jīng)保護作用呢？目前沒有報道。

本實驗以神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，來觀察孕酮對ATP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響，探討P2X7R在孕酮神經(jīng)保護中所扮演的角色。CCK-8結(jié)果表明，細(xì)胞存活率隨著ATP濃度的升高而降低，具有劑量依賴性;YO-PRO-1實驗結(jié)果顯示，隨著胞外ATP濃度的升高，細(xì)胞攝取YO-PRO-1也逐漸增加，熒光強度增強,與CCK-8實驗結(jié)果的變化趨勢一致，彼此印證了外源性ATP高劑量導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，損傷越來越嚴(yán)重。在ATP之前，用4種不同濃度的孕酮預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ATP組相比，3、10、30和100 nmol/L孕酮預(yù)處理均可使細(xì)胞存活率明顯升高,這與Hoffman和Lockhat等的實驗結(jié)果一致，表明孕酮可保護損傷的腦細(xì)胞。為了證實孕酮神經(jīng)保護作用的具體環(huán)節(jié)和分子機制，我們在實驗中使用了P2X7R特異性拮抗劑KN-62。KN-62或孕酮預(yù)處理后，SH-SY5Y細(xì)胞對YO-PRO-1攝取的熒光強度顯著低于ATP組，表明了P2X7R激活在ATP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞通透性改變中起重要作用，而孕酮可能具有P2X7R拮抗劑的作用，能抑制ATP誘導(dǎo)膜通透性的增加。Fluo-3/AM實驗結(jié)果顯示，KN-62和孕酮可降低ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，與文獻報道一致[16]，從而進一步證實了胞內(nèi)游離鈣水平的升高參與了ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而孕酮有抑制鈣超載的作用。我們進一步通過 Western Blot 對P2X7R蛋白的表達進行檢測， 發(fā)現(xiàn)ATP組P2X7R蛋白表達量明顯增高于對照組，孕酮+ATP組則顯著降低，表明孕酮可以下調(diào)P2X7R蛋白的表達。

綜上所述,本研究提示，孕酮對胞外高濃度ATP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷有保護作用。其機制可能是通過抑制P2X7R活化，降低細(xì)胞膜通透性，減輕胞內(nèi)Ca2+超載，從而減少細(xì)胞死亡，本實驗結(jié)果為孕酮用于腦損的傷治療提供實驗依據(jù)。課題組下一步將會采用高表達P2X7R的小膠質(zhì)細(xì)胞和過表達P2X7R的HEK-293細(xì)胞來研究孕酮對炎癥因子和凋亡因子的影響，深入探討孕酮對P2X7R的調(diào)控，明確其神經(jīng)保護作用的機制，以便進一步為臨床上篩選神經(jīng)甾體相關(guān)藥物提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of progesterone on SH-SY5Y cells injured by ATP

LI Xiu-juan1, SHEN Hui2, WEI Lin-yu1, WANG Guo-hong1, ZHANG Li-bing1, LI Chao-kun1, LI Xin-juan1, WANG Lu1, ZHAO Hong-gang1, SONG Jing-gui3, LI Dong-liang1

(1Department of Physiology and Neurobiology,2The Third Affiliated Hospital,3The Second Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China. E-mail: xyldl8@126.com)

AIM: To investigate the neuroprotective effect of progesterone against adenosine triphosphate (ATP)-injured human neuroblastoma SH-SY5Y cells.METHODS: The SH-SY5Y cells in the logarithmic phase were divided into different groups according to the progesterone and ATP concentrations. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The membrane permeability was detected using fluorescent dye YO-PRO-1. Cytosolic Ca2+concentration was measured with fluorescent dye Fluo-3/AM. The expression of purinergic P2X7receptor was assessed by Western blot.RESULTS: The viability of the SH-SY5Y cells was significantly decreased (P<0.05) and YO-PRO-1 uptake was obviously increased (P<0.05) in a concentration-dependent manner compared with control group when SH-SY5Y cells were treated with ATP at 1, 3, 5 and 7 mmol/L for 2 h. The viability reduction of the SH-SY5Y cells induced by ATP was obviously counteracted by treatment with progesterone at 3, 10 and 30 nmol/L for 30 min (P<0.05) as compared with ATP group. YO-PRO-1 fluorescence enhancement induced by ATP in SH-SY5Y cells was significantly reduced (P<0.05) by progesterone (30 nmol/L) or P2X7receptor antagonist KN-62 (500 nmol/L) pretreatment for 30 min, and no obvious difference between treatments with progesterone and KN-62 was observed. Cytosolic Ca2+fluorescence intensity in normal group was a little, but that in ATP group was increased (P<0.05). Progesterone or KN-62 pretreatment significantly decreased the cytosolic fluorescence intensity of Ca2+induced by ATP (P<0.05). However, no obvious difference between treatments with progesterone and KN-62 was found. The expression of P2X7receptor in ATP group was significantly higher than that in control group (P<0.05), and progesterone inhibited ATP-induced P2X7receptor expression (P<0.05).CONCLUSION: Progesterone inhibits P2X7receptor expression, membrane pore formation, intracellular Ca2+increase and cell death induced by ATP, so progesterone may protect SH-SY5Y cells against ATP-induced injuries.

Progesterone; Adenosine triphosphate; Purinergic P2X7receptor; SH-SY5Y cells

1000- 4718(2017)09- 1587- 06

2016- 12- 21 [

] 2017- 08- 10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81371346； No. 81271376);河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃(No.16A310011； No.16A310013)

R741; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.008

△通訊作者 Tel： 0373-3029104； E-mail： xyldl8@126.com